譚宇萍，董宏然，楊健，唐金富*，康傳志，張瑜，黃璐琦*

(1.廣東藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，廣州 510000；2.道地藥材國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心，北京 100700)

·中藥農(nóng)業(yè)·

不同發(fā)育期菘藍(lán)和毛狀根中直鐵線蓮寧B的含量變化規(guī)律研究△

譚宇萍1，2，董宏然2，楊健2，唐金富2*，康傳志2，張瑜2，黃璐琦1，2*

(1.廣東藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，廣州 510000；2.道地藥材國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心，北京 100700)

目的測(cè)定不同生長(zhǎng)時(shí)期菘藍(lán)及不同懸浮培養(yǎng)時(shí)間毛狀根中抗流感病毒活性成分直鐵線蓮寧B的含量，研究其累積變化規(guī)律，為菘藍(lán)的采收和菘藍(lán)毛狀根體系評(píng)價(jià)提供參考。方法應(yīng)用超高效液相色譜測(cè)定菘藍(lán)葉片、根及毛狀根中直鐵線蓮寧B的含量。結(jié)果菘藍(lán)葉片中未檢測(cè)到直鐵線蓮寧B；在整個(gè)生育期內(nèi)，菘藍(lán)根中直鐵線蓮寧B動(dòng)態(tài)累積變化曲線為“單峰型”，含量在生長(zhǎng)100 d左右達(dá)到峰值后逐漸降低；毛狀根中直鐵線蓮寧B含量隨懸浮培養(yǎng)時(shí)間持續(xù)增加，在20 d達(dá)到5.40 mg·g-1，超過(guò)根中最大含量。結(jié)論整個(gè)生長(zhǎng)周期內(nèi)，菘藍(lán)和毛狀根中直鐵線蓮寧B累積變化呈一定規(guī)律性，原植物中直鐵線蓮寧 B在九月下旬產(chǎn)量達(dá)到最大；毛狀根在10～20 d期間直鐵線蓮寧B含量增長(zhǎng)處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，20 d后即超過(guò)原植物的最大含量，說(shuō)明菘藍(lán)毛狀根體系是研究直鐵線蓮寧B生物合成的理想體系，也可為后續(xù)利用菘藍(lán)毛狀根體系大量制備直鐵線蓮寧B提供參考。

菘藍(lán)；毛狀根；生長(zhǎng)期；直鐵線蓮寧B；含量

菘藍(lán)IsatisindigoticaFort.為十字花科菘藍(lán)屬兩年生草本植物。根和葉均可入藥，根入藥為板藍(lán)根，葉入藥為大青葉，具有清熱解毒，涼血利咽之功效，主治瘟疫時(shí)毒、發(fā)熱咽痛、痄腮、丹毒、癰腫，臨床常用于流行性感冒，流行性腮腺炎，急慢性肝炎，流行性乙型肝炎，帶狀皰疹等疾病的治療[1]。鐘南山教授課題組研究發(fā)現(xiàn)，菘藍(lán)中木脂素類化合物 7S，8R，8′R-(+)-落葉松樹(shù)脂醇-4，4′-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，即直鐵線蓮寧B (clemastanin B)，對(duì)不同亞型人流感病毒與禽流感病毒均具有顯著抑制作用[2]，可能是菘藍(lán)抗病毒活性物質(zhì)基礎(chǔ)之一。然而，直鐵線蓮寧B在菘藍(lán)原植物中含量較低，安益強(qiáng)等測(cè)定了河北安國(guó)，安徽亳州等8個(gè)不同產(chǎn)地板藍(lán)根中直鐵線蓮寧B的含量，直鐵線蓮寧B含量最高僅為0.900 mg·g-1[3]。中藥材中活性物質(zhì)含量受產(chǎn)地、栽培技術(shù)等因素影響，采收時(shí)間是直接影響中藥材質(zhì)量的重要因素之一，基于抗病毒活性物質(zhì)直鐵線蓮寧B含量來(lái)優(yōu)化菘藍(lán)采收時(shí)間，目前尚缺乏相關(guān)的研究，因此研究菘藍(lán)不同發(fā)育期直鐵線蓮寧B積累規(guī)律將有望為優(yōu)化菘藍(lán)藥材采收時(shí)間提供有價(jià)值的參考。

發(fā)根農(nóng)桿菌Agrobacteriumrhizogenes中含有使植物產(chǎn)生毛狀根的Ri質(zhì)粒，Ri質(zhì)粒內(nèi)Vir區(qū)基因表達(dá)產(chǎn)物作用于T-DNA產(chǎn)生T-DNA片段，并最終整合到宿主細(xì)胞基因組中產(chǎn)生大量毛狀根。植物毛狀根培養(yǎng)具有其生長(zhǎng)不依賴外源植物激素、合成次生代謝物能力強(qiáng)且穩(wěn)定、生物轉(zhuǎn)化功能以及繁殖能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，不僅是植物天然產(chǎn)物生物合成研究的理想體系，以其作為生物反應(yīng)器來(lái)生產(chǎn)高價(jià)值天然產(chǎn)物的潛力，更是受到研究者廣泛關(guān)注，并已有成功的先例[4-5]。參照模式植物擬南芥，菘藍(lán)體內(nèi)木脂素合成途徑已初步闡明[6]，其中香豆酸-3-羥基化酶 (liC3H) 和松脂素還原酶 (liPLR) 參與木脂素成分生物合成，過(guò)表達(dá)liC3H和過(guò)表達(dá)liPLR使菘藍(lán)毛狀根中直鐵線蓮寧B的前體落葉松脂素的含量均明顯提高[7-8]，但對(duì)直鐵線蓮寧B在菘藍(lán)毛狀根的積累情況和積累規(guī)律還未見(jiàn)報(bào)道。

本研究擬通過(guò)超高效液相測(cè)定不同生長(zhǎng)期菘藍(lán)根和葉中直鐵線蓮寧B的含量，探索直鐵線蓮寧B產(chǎn)生規(guī)律，以期為菘藍(lán)藥材的采收提供參考依據(jù)。同時(shí)利用發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1誘導(dǎo)菘藍(lán)毛狀根，摸索不同懸浮培養(yǎng)時(shí)間毛狀根中直鐵線蓮寧B積累變化規(guī)律，為今后解析其生物合成途徑和合成調(diào)控研究提供平臺(tái)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

菘藍(lán)毛狀根材料為測(cè)定生長(zhǎng)曲線時(shí)干燥至恒重的毛狀根；菘藍(lán)自交純系，經(jīng)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心郝近大研究員鑒定為十字花科菘藍(lán)屬植物菘藍(lán)IsatisindigoticaFort.2013年于北京郊區(qū)春播，在生長(zhǎng)至60 d后(8月13日)，每10 d取樣一次，每次取3份菘藍(lán)完整植株，記錄各組菘藍(lán)樣品的表觀數(shù)據(jù)后，將其地上與地下部分切斷，分別稱量各部分鮮重，在烘箱 90 ℃殺青 15 min后于陰涼通風(fēng)處晾干，稱量干重。

1.2 儀器與試劑

超高效液相 ACQUITY UPLC I-Class (美國(guó) Waters 公司，包括四元高壓梯度泵、真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器、 EmpowerTM3 色譜工作站)，超高效液相色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm× 50 mm，1.7 μm)，BAS224S 型分析天平 (Sartorius)，5810R 型冷凍離心機(jī) (Eppendorf)。 甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，Murashige & Skoog Basal Medium with Vitamins (Phyto Thechnology Laboratories)，Tryptone 、 Yeast extract (OXOID，LP0042)。

1.3 菘藍(lán)毛狀根誘導(dǎo)及培養(yǎng)

1.3.1 外植體的制備 挑選飽滿無(wú)破損的菘藍(lán)種子，用 75% 酒精浸泡 5 min，無(wú)菌水沖洗 4～5 次，再用 3% NaClO 溶液浸泡 10 min后無(wú)菌水沖洗 5 次，接種至 MS 固體培養(yǎng)基上，(26 ± 2) ℃ 下暗培養(yǎng) 2 d，光培養(yǎng)約 20 d，取無(wú)菌苗幼葉作為外植體。

1.3.2 發(fā)根農(nóng)桿菌活化 取保存在-80 ℃發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1劃線接種在 LB 固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)2 d，挑取單菌落轉(zhuǎn)接在LB液體培養(yǎng)基中，活化2次，28 ℃，200 r·min-1振蕩培養(yǎng)至OD值為0.5，即可用于誘導(dǎo)毛狀根。

1.3.3 毛狀根的誘導(dǎo)和固體培養(yǎng) 農(nóng)桿菌菌液浸泡過(guò)的菘藍(lán)葉片放入MS固體培養(yǎng)基里，暗培養(yǎng)2 d，轉(zhuǎn)入含400 mg·L-1Cef 的MS固體培養(yǎng)基，每10 d更換培養(yǎng)基，每次將Cef濃度降低100 mg·L-1直至獲得無(wú)菌毛狀根。

1.3.4 毛狀根的鑒定 取新鮮毛狀根 0.1 g，SDS 法提取總 DNA 作為 PCR 擴(kuò)增模板。根據(jù)發(fā)根農(nóng)桿菌 C58C1 菌株中RolB和RolC基因設(shè)計(jì)特異性引物：

RolB：RolB-F：CGAGGGGATCCGATTTGCTT;

RolB-R：GACGCCCTCCTCGCCTTCCT；

RolC：Rol C-F：TCGCCATGCCTCACCAACTCAC;

RolC-R：CCTTGATCGAGCCGGGTGAGAA;

擴(kuò)增體系為 10 μL Takara Premix Ex Taq，1 μL 正向引物(5 μm·μL-1)，1 μL 反向引物 (5 μm·μL-1)，1 μL DNA模板，7 μL dd H2O.PCR 擴(kuò)增條件為 94 ℃ 預(yù)變性 5 min，35 個(gè)擴(kuò)增循環(huán) (94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s)，72 ℃繼續(xù)延伸5 min，1.5%瓊脂糖凝膠(EB 染色)進(jìn)行電泳 (180 V/30 min)，電泳結(jié)果于凝膠成像系統(tǒng)下掃描并保存圖片。

1.3.5 菘藍(lán)毛狀根的液體懸浮培養(yǎng) 稱取經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性且多分枝、多根毛、生長(zhǎng)迅速的毛狀根 1.0 g至6，7 V液體培養(yǎng)基中懸浮振蕩培養(yǎng)，80 r·mim-1，25 ℃，避光。

1.3.6 毛狀根生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 取在6，7-V液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)旺盛的菘藍(lán)毛狀根0.5 g鮮重，轉(zhuǎn)接至新的6，7-V液體培養(yǎng)基中，從繼代培養(yǎng)開(kāi)始，每5 d取出毛狀根樣品，每次三瓶，取出的樣品置于烘箱中37 ℃干燥24 h至恒重后稱量其干重，并計(jì)算3份樣品的平均值，繪制0～60 d毛狀根的生長(zhǎng)曲線。

1.4 直鐵線蓮寧B的含量測(cè)定

1.4.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相：0.1% 甲酸-乙腈 (A)-0.1% 甲酸-水 (B) 12∶88；流速：0.4 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)225 nm，柱溫 40 ℃，進(jìn)樣量 2 μL.

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精密稱取2.00 mg直鐵線蓮寧B粉末(自制)于10 mL棕色容量瓶中，50%甲醇溶解、定容，濃度為200 μg·mL-1，放置于4 ℃冰箱供 UPLC 分析用。

1.4.3 線性關(guān)系考察 將上述對(duì)照品溶液進(jìn)一步稀釋成7個(gè)不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，按照1.4.1 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣濃度X(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，色譜峰面積Y為縱坐標(biāo)得到回歸方程分別為：Y=3827X+6862.9，(r=0.999 7)，線性范圍1.000～100.0 μg·mL-1。

1.4.4 供試品溶液的制備 稱取菘藍(lán)葉片與根的粗粉0.500 g，精密稱定，加入5 mL 50%甲醇超聲提取兩次，每次45 min，并用50% 甲醇補(bǔ)足損失的量；離心取上清，殘?jiān)蒙倭?0% 甲醇沖洗3次，置于10 mL 棕色容量瓶中并用50%甲醇定容至刻度，搖勻，濾過(guò)，取濾液，即得；稱取菘藍(lán)毛狀根粉末0.050 g，精密稱定，加入1 mL 50%甲醇，用上述方法提取，并定容至2 mL，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

1.4.5 精密度試驗(yàn) 取100 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)樣2 μL連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)得直鐵線蓮寧B的峰面積 RSD 值為0.61%，表明該儀器精密度良好。

1.4.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取菘藍(lán)和毛狀根的同一供試品溶液，分別在0，2，4，6，8 h測(cè)定直鐵線蓮寧B的峰面積，其峰面積的RSD值分別為0.06%，0.08%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

1.4.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批次菘藍(lán)和毛狀根樣品，按照1.4.4項(xiàng)下方法各制備 5 份供試品溶液，測(cè)定直鐵線蓮寧B的含量，結(jié)果為菘藍(lán)和毛狀根中直鐵線蓮寧B質(zhì)量分?jǐn)?shù)的 RSD 值分別為1.23%，1.36%，表明該方法的重復(fù)性良好。

1.4.8 加樣回收率 精密稱取已知含量的菘藍(lán)和毛狀根樣品各5份，每份約50 mg，加入與所測(cè)成分約等量的對(duì)照品溶液，按1.4.4項(xiàng)下制備供試品溶液。按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。測(cè)得菘藍(lán)，毛狀根中直鐵線蓮寧B的平均回收率分別為103.2%，100.1%，RSD分別為0.74%，1.44%.

1.4.9 含量測(cè)定 按1.4.4項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按1.4.1下相應(yīng)的測(cè)定方法測(cè)定峰面積并由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算直鐵線蓮寧B含量。

2 分析

2.1 菘藍(lán)毛狀根的鑒定

提取菘藍(lán)轉(zhuǎn)化毛狀根的基因組DNA，PCR擴(kuò)增毛狀根特異RolB和RolC基因片段，結(jié)果顯示四個(gè)株系毛狀根均能擴(kuò)增出與轉(zhuǎn)化菌株大小一致的片段；而以原植物的DNA為模板，擴(kuò)增后無(wú)特異性條帶，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)了菘藍(lán)的毛狀根，C58C1發(fā)根農(nóng)桿菌中RolB和RolC兩個(gè)基因已經(jīng)穩(wěn)定整合到基因組中，可以用于后續(xù)的研究。

注：M：DNA Maker；P：菌株 C58C1；1～4：不同株系菘藍(lán)毛狀根；G：菘藍(lán)；N：陰性對(duì)照?qǐng)D1 菘藍(lán)毛狀根Rol B，Rol C 基因PCR檢測(cè)

2.2 不同生長(zhǎng)時(shí)期菘藍(lán)及毛狀根生物量的變化

不同生長(zhǎng)期菘藍(lán)根、葉及不同懸浮培養(yǎng)時(shí)間毛狀根生物量累積變化，如圖2，北京春播的菘藍(lán)，在播種后生長(zhǎng)70 d內(nèi)，菘藍(lán)葉及根生物量逐漸增長(zhǎng)；生長(zhǎng)70 d后，進(jìn)入9月份，天氣逐漸變冷，光照強(qiáng)度變?nèi)?，地上葉的形態(tài)趨于穩(wěn)定，生物量積累呈現(xiàn)穩(wěn)定狀態(tài)，此時(shí)葉中有機(jī)物向根部轉(zhuǎn)移，根部進(jìn)入快速增長(zhǎng)期，一直持續(xù)到 10 月，根部生物量積累逐漸穩(wěn)定。懸浮培養(yǎng)毛狀根在生長(zhǎng)50 d內(nèi)，呈現(xiàn)“快～慢”生長(zhǎng)模式；10～20 d處于快速增長(zhǎng)期，10 d內(nèi)生物量增長(zhǎng)一倍，20 d后生物量呈現(xiàn)緩慢積累趨勢(shì)，由于培養(yǎng)基里的水分及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不斷被消耗，50 d后，生物量開(kāi)始下降，毛狀根出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。

圖2 不同生長(zhǎng)期菘藍(lán)根、葉及毛狀根生物量的累積變化

2.3 不同生長(zhǎng)期菘藍(lán)根中直鐵線蓮寧B動(dòng)態(tài)累積變化

不同生長(zhǎng)期菘藍(lán)中直鐵線蓮寧動(dòng)態(tài)積累變化，見(jiàn)圖3 (A，B) 在菘藍(lán)葉片未檢測(cè)出直鐵線蓮寧B；不同生長(zhǎng)期根中直鐵線蓮寧B含量及產(chǎn)量總體均呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，含量介于0.75～ 2.13 mg·g-1，其產(chǎn)量則介于30.9～87.3 mg。從種子萌芽到生長(zhǎng)期，在葉的光合作用下，菘藍(lán)根部不斷積累直鐵線蓮寧B，在生長(zhǎng)90 d后其含量達(dá)到峰值，為2.13 mg·g-1；生長(zhǎng)100 d，其產(chǎn)量達(dá)到最高87.3 mg。生長(zhǎng)100 d后，直鐵線蓮寧B含量急劇下降，產(chǎn)量也相應(yīng)持續(xù)下降。

圖3 不同生長(zhǎng)期菘藍(lán)根中直鐵線蓮寧B動(dòng)態(tài)積累變化

2.4 不同懸浮培養(yǎng)時(shí)間菘藍(lán)毛狀根中直鐵線蓮寧B動(dòng)態(tài)累積變化

圖4 不同懸浮培養(yǎng)時(shí)間菘藍(lán)毛狀根中直鐵線蓮寧B動(dòng)態(tài)積累變化

對(duì)不同懸浮培養(yǎng)時(shí)間的菘藍(lán)毛狀根中直鐵線蓮寧B動(dòng)態(tài)積累發(fā)現(xiàn)，懸浮培養(yǎng)菘藍(lán)毛狀根中直鐵線蓮寧B含量和產(chǎn)量均隨生長(zhǎng)期持續(xù)增加，毛狀根在生長(zhǎng)10 d內(nèi)開(kāi)始積累直鐵線蓮寧B，10～20 d毛狀根處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，直鐵線蓮寧含量急速增加，從0.38 mg·g-1迅速上升至3.10 mg·g-1，產(chǎn)量由1.629 mg·L-1迅速增加到20.26 mg·g-1，增長(zhǎng)率約為10倍；第60 d達(dá)到了5.40 mg·g-1，產(chǎn)量達(dá)47.81 mg·L-1。

3 討論

本研究考察了不同生長(zhǎng)時(shí)期菘藍(lán)以及不同培養(yǎng)時(shí)間菘藍(lán)毛狀根中抗病毒活性物質(zhì)直鐵線蓮寧B含量變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在葉中未檢測(cè)到直鐵線蓮寧B，而根和毛狀根中均含直鐵線蓮寧B，且直鐵線蓮寧B動(dòng)態(tài)積累差異顯著。氣候條件會(huì)影響中藥材質(zhì)量，隨季節(jié)變換植物體內(nèi)活性物質(zhì)含量與生物量呈規(guī)律性變化。春播70 d后，直鐵線蓮寧B進(jìn)入快速積累期，到90 d左右(9月下旬)達(dá)到最高，之后呈下降趨勢(shì)。因春播70 d后，進(jìn)入秋季，晝夜差距變小，氣溫降低，夜間植物蒸騰作用減弱，有利于地上部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐漸轉(zhuǎn)入根部，故根中直鐵線蓮寧B含量逐漸增加；8～9月是菘藍(lán)地下部分生長(zhǎng)旺盛期，也是直鐵線蓮寧B合成積累關(guān)鍵時(shí)期，其合成積累在9月下旬達(dá)到最高值，之后隨氣溫逐漸降低，地上部分開(kāi)始枯萎，光合強(qiáng)度減弱，積累呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，這說(shuō)明春播板藍(lán)根最佳采收期為9月底至10月初[1]。

而在菘藍(lán)毛狀根中，直鐵線蓮寧B含量隨懸浮培養(yǎng)增加不斷積累，在生長(zhǎng)10 d內(nèi)明顯增加，10 d后毛狀根進(jìn)入快速生長(zhǎng)期，直鐵線蓮寧B含量迅速增加，培養(yǎng)20 d時(shí)，已經(jīng)超過(guò)了板藍(lán)根中最高含量，懸浮培養(yǎng)50 d后，毛狀根進(jìn)入生長(zhǎng)停滯期，但直鐵線蓮寧B合成累積幅度大于生物量下降幅度，其含量仍呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。由此可見(jiàn)，菘藍(lán)毛狀根能快速合成抗病毒成分直鐵線蓮寧B，生產(chǎn)效率高且穩(wěn)定，并呈現(xiàn)一定的規(guī)律性，是研究菘藍(lán)直鐵線蓮寧B生物合成的理想體系。前人研究發(fā)現(xiàn)，毛狀根中次生代謝物含量甚至高于原植物，如通過(guò)甘草毛狀根獲得甘草黃酮，達(dá)干重的2.042%，是未轉(zhuǎn)化甘草根的4.3倍[10]。本研究中也發(fā)現(xiàn)，菘藍(lán)毛狀根不僅能積累直鐵線蓮寧B，且含量穩(wěn)定，隨培養(yǎng)時(shí)間增加逐漸積累，可達(dá)板藍(lán)根其含量最高值的2.5倍，說(shuō)明菘藍(lán)毛狀根同樣也具有用于生產(chǎn)直鐵線蓮寧B的潛力。

綜上所述，本研究通過(guò)測(cè)定抗病毒活性物質(zhì)直鐵線蓮寧B的含量，不僅為菘藍(lán)藥材的采收時(shí)間提供了參考，而且推斷毛狀根體系是研究直鐵線蓮寧B生物合成的理想體系，同時(shí)也具備用于直鐵線蓮寧B生成的潛力。但本研究?jī)H從抗病毒活性物質(zhì)直鐵線蓮寧B的含量考察菘藍(lán)的毛狀根和板藍(lán)根藥材之間差異，二者在抗病毒活性上差異如何？其物質(zhì)基礎(chǔ)是什么？這些問(wèn)題仍有待于進(jìn)一步研究。

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DynamicAnalysisofClemastaninBofthePlantatDifferentGrowthStagesandHairyRootsofIsatisindigotica

TAN Yuping1,2, DONG Hongran2, YANG Jian2, TANG Jinfu2*, KANG Chuanzhi2, ZHANG Yu2, HUANG Luqi1,2*

1.CollegeofTraditionalChineseMedicine,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China2.StateKeyLaboratoryBreedingBaseofDao-diHerbs,NationalResourceCenterforChineseMateriaMedica,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100700,China

Objective：To investigate the changes of clemastanin B of the plant at different growth stages and hairy root ofIsatisindigotica.MethodsUltra Performance Liquid Chromatography was applied to determine the content of clemastanin B from the plant and hairy roots ofI.indigotica.ResultsClemastanin B was undetectable in the leaves ofI.indigotica，and the content of clemastanin B exhibited obvious change across different growing stages and increased with culture time in hairiry roots.The content of clesmastanin B showed a continuous increasing trend in hairy roots，reaching 5.40 mg·g-1in 20 days，which exceeding the maximum content of clemastanin B in roots，while its content was gradually decreased after reaching the peak at 100 days.ConclusionInvestigation of clemastanin B content at t different growth stages and hairy roots inI.indigoticapresent a certain law.The content of clemastanin B in the roots reached the maximum in 100 days after seeding.However，the content of clemastanin B in hairy roots were at the logarithmic phase of growth from 10 days to 20 days，even exceeding the maximum content in the roots at 20 days after seeding.From this angle，the hairy roots may provide us an ideal system to dissect the mechanism of the biosynthesis of clemastanin B and produce clemastanin B.

Isatisindigotica；hairy roots；growth stages；clemastanin B；content

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.9.014

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(81403090)；中央本級(jí)重大增減支項(xiàng)目(2060302)

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唐金富，副研究員，研究方向：菘藍(lán)有效成分的生物合成調(diào)控研究；Tel：(010)64014411-2956，E-mail：jinfutang@126.com；黃璐琦，研究員，研究方向：分子生藥學(xué)；Tel：(010)64014411-2955，E-mail：huangluqi01@126.com

2017-03-29)