□顏旭 文勇 韓慶新 李蘭/成都市農(nóng)林科學院

幾種藥劑及煙草提取物對草莓灰霉病的藥效分析

□顏旭 文勇 韓慶新 李蘭
/成都市農(nóng)林科學院

草莓外觀多呈心形，果實色澤艷、營養(yǎng)高、風味濃、結(jié)果早、效益好，具有較高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值，同時也是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的十大支柱產(chǎn)業(yè)之一，備受生產(chǎn)者和消費者的青睞，素有“果中皇后”的美譽。隨著我國草莓種植面積的不斷增加，其種植過程中發(fā)生病害的問題日益突顯，其中由灰葡萄孢菌引起的草莓灰霉病是目前草莓生產(chǎn)中的重要病害之一，一般會導致草莓減產(chǎn)10%～30%，重者達50%以上。

煙草在我國種植面積大，可用于吸食，含有豐富的蛋白質(zhì)、檸檬酸和蘋果酸等。目前，廢棄煙葉大量堆積，因此對煙草的多用途研究很有必要。煙草提取物中的新植二烯和植醇是良好的致香前體物質(zhì)；煙堿有殺蟲和殺菌作用，是良好的生物殺菌劑。生物殺菌劑是指利用生物活體或其代謝產(chǎn)物針對農(nóng)業(yè)有害生物進行殺滅或抑制的制劑。生物殺菌劑既不污染環(huán)境、毒害人畜、傷害天敵，又不會誘發(fā)抗藥性，是目前大力推廣的高效、低毒、低殘留的“無公害”農(nóng)藥。

本實驗通過水蒸氣蒸餾的方法對廢棄煙葉進行蒸餾提取，用煙草餾出物以及市面上常用的幾種防治灰霉病的藥劑作用于草莓灰霉病菌，采用菌絲生長速率法，測定幾種殺菌劑和煙草提取物對草莓灰霉病的敏感性，分析多種殺菌劑及煙草提取物對草莓灰霉病菌的抑菌效果，以此為防治草莓灰霉病提供新的藥劑，為科學合理地使用殺菌劑提供依據(jù)，同時為煙草廢物利用拓寬方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 草莓灰霉病病果、病花

2017年3～4月，收集四川省成都市農(nóng)林科學院種植大棚里染灰霉病的草莓花和果實，用于提取草莓灰霉病菌，并經(jīng)成都市農(nóng)林科學院草莓研究實驗組和四川農(nóng)業(yè)大學病理實驗室鑒定為草莓灰霉病菌。

1.1.2 廢棄煙葉材料

2015生產(chǎn)的廢棄烤煙煙葉（由四川農(nóng)業(yè)大學特用植物栽培系實驗室提供）。

1.1.3 供試試劑和藥劑

試劑：NaOH、葡萄糖、瓊脂、鏈霉。

藥劑：撲海因（500 g/L異菌脲）拜耳作物科學（中國）有限公司，怪客（500 g/L異菌脲）江蘇輝豐農(nóng)化股份有限公司，健達（吡唑醚菌酯21.2%，氟唑菌酰胺21.2%）德國巴斯夫，靚貝（400 g/L嘧霉胺）永農(nóng)生物科學有限公司，科灰2號（0.3%丁子香酚）河南博愛惠豐生化農(nóng)藥有限公司，瑞鎮(zhèn)（50%嘧菌環(huán)胺）瑞士先正達。

1.2 方法

1.2.1 馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基（PDA）的制作

馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL。馬鈴薯切成小塊狀放入鍋中煮沸，之后用4層紗布過濾，再加入蔗糖和瓊脂，攪拌均勻后用蒸餾水定容到1 000 mL，再放入高壓滅菌鍋中滅菌，滅菌后再在37℃溫箱培養(yǎng)24 h，無菌生長的培養(yǎng)基方可使用。

1.2.2 草莓灰霉病菌的分離純化

用滅菌的木質(zhì)牙簽輕觸采集的染病病果、病花上的灰霉病菌霉層，并將其迅速放入馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基（PDA）平板上帶回實驗室。在25℃恒溫保濕培養(yǎng)1～2 d，促使其產(chǎn)孢。一個病果（病花）作為一個菌株，用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)。取分離好的菌落經(jīng)形態(tài)結(jié)構(gòu)分析及顯微鏡觀察證實為灰葡萄孢，挑取菌落邊緣菌絲于滅完菌的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，重復以上步驟3～4次。鑒定標準是：頂端膨大呈頭狀，頂端有小突起，突起地方密生小柄并著生大量分生孢子，形似葡萄穗，有隔膜，叢生、單枝或樹狀分枝。

1.2.3 煙葉提取物制備方法

將廢棄煙葉置于65℃烘箱中干燥30 min，測定其含水率為10%時用打粉機將其磨成煙末，將煙末混合均勻后取20 g加入三角瓶中，再加入少許NaOH調(diào)節(jié)pH值至堿性，然后加入200 mL水，并用水蒸氣蒸餾法蒸餾煙樣，收取餾出物200 mL，并定容到250 mL。在4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 試驗設計

1.2.4.1 煙草提取物施用量藥效試驗

以煙草提取物施用量作為試驗因素，制成含有0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL煙葉提取物的20 mL PDA平板培養(yǎng)基，形成4個處理；以不加煙草提取物的PDA平板培養(yǎng)基為CK。操作如下：將滅菌后的PDA培養(yǎng)基熔化，冷卻到50℃左右，用移液槍分別移取2.5 mL、5.0 mL、10.0 mL、20.0 mL煙葉提取物于100 mL滅完菌的干燥錐形瓶中，加入0.3%的鏈霉素抑制細菌，再用分別不同體積的PDA培養(yǎng)基使總體積達100 mL，并振蕩搖勻后等份倒入5個培養(yǎng)皿中。

1.2.4.2 不同藥劑藥效試驗

先用電子天平稱取瑞鎮(zhèn)（50%嘧菌環(huán)胺）0.1 g于滅完菌的容量管中，再用移液槍移取10 mL無菌水，搖勻震蕩后配制成0.01 g/mL的溶液；取0.01 g/mL的溶液5 mL于100 mL滅完菌的干燥錐形瓶中，然后加入PDA培養(yǎng)基使溶液總體積達100 mL，并振蕩搖勻后等份倒入5個培養(yǎng)皿中，使最終PDA培養(yǎng)基中瑞鎮(zhèn)濃度為0.5 g/L。用同樣方法配置各種藥劑，濃度分別為：撲海因0.5 g/L、健達0.26 g/L、靚貝0.47 g/L、科灰2號0.67 g/L、怪客0.5 g/L，最后制成含藥PDA培養(yǎng)基平板。

1.2.5 接種及培養(yǎng)方法

用打孔器（Ф=5 mm）在培養(yǎng)好的菌落外緣打孔制備菌餅，將菌餅菌絲一面朝下，接種到培養(yǎng)基中央，以向培養(yǎng)皿內(nèi)加入20 mL的空白PDA培養(yǎng)基做對照組。每處理3次重復，置于25℃黑暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.6 考查指標及方法

每24 h用十字交叉法測量菌落直徑，取平均值，計算菌絲生長抑制率。

抑菌率=（對照菌落生長直徑-處理菌落生長直徑）/（對照菌落生長直徑-霉菌菌塊初始直徑）×100%

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用DPS7.05數(shù)據(jù)處理軟件進行統(tǒng)計分析（取5%顯著水平）。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草提取物抑制效果分析

為了更加全面地分析出煙草提取物對灰霉病菌的作用效果，在經(jīng)過4 d對照組 （CK） 菌 絲長滿PDA培養(yǎng)基平 板 （ Ф=8.5 mm）后，仍繼續(xù)觀測處理組菌絲生長情況，煙草提取物處理下菌落直徑、抑制效果見表1、2。

通過對表1和表2的分析可得，不同體積相同觀察時間處理下，含有4.0 mL煙草提取物的培養(yǎng)基抑制效果最明顯，2 d觀察時間下，4.0 mL處理和1.0 mL處理、0.5 mL處理差異顯著，抑菌率分別相差11%、10%；1.0 mL處理和2.0 mL處理間差異顯著，相差7.6%，其余處理間差異不顯著；3、4、5 d觀察時間下，均只有4.0 mL處理和0.5 mL處理差異顯著，抑菌率分別相差7.6%、8.4%、4.4%，其他處理間不顯著；6 d觀察時間下，各處理間差異都顯著。說明高濃度的煙草提取物對草莓灰霉病菌有抑制作用，且隨著觀察時間延遲，效果越顯著。

煙草提取物不同觀察時間的抑制率見圖1。從圖1可以看出，同種體積不同觀察時間處理下，隨著觀察時間的延遲，抑制效果減弱，這可能和煙草提取物中含有的煙堿、新植二烯、植醇等有關(guān)。隨著病原菌的呼吸作用，煙堿可以作為病原菌的養(yǎng)分被吸收，產(chǎn)生各種代謝產(chǎn)物，從而抑制病菌的生長；新植二烯、植醇均有抑制真菌生長的效果，但二者是致香前體物質(zhì)，隨著時間延遲，其在培養(yǎng)基中有效成分揮發(fā)，從而抑制效果減弱。

2.2 藥劑抑制效果分析

藥劑對灰霉病菌的抑制效果見表3。從表3分析可得，不同藥劑在2 d觀察時間處理下，抑制效果最好的是科灰2號處理，抑制率高達97.5%，同撲海因、怪客處理差異顯著，抑菌率相差1.1%、3.9%，和其余處理差異不顯著；抑制效果最差的是靚貝，靚貝屬于嘧霉胺類殺菌劑，殺菌機理是抑制病菌蛋氨酸的生物合成和細胞壁降解酶的分泌，但處理效果差的原因可能是所選材料植株上的灰霉病菌對靚貝這種殺菌劑已經(jīng)產(chǎn)生了抗藥性，所以藥效比其他藥差，僅和瑞鎮(zhèn)處理有差異，相差達20%以上，和其余處理沒有差異；瑞鎮(zhèn)處理同其余各處理間均存在差異，這應該和菌落長勢有關(guān)，菌落長勢起初是平鋪生長，后面便是縱向生長，在很大程度上干擾了實驗數(shù)據(jù)測量。

表1 煙草提取物處理下灰霉病菌的菌落直徑

圖1 煙草提取物不同觀察時間抑制率

表2 煙草提取物對灰霉病菌的抑制效果

3 d觀察時間以后，抑制效果最好的都是撲海因，分別為94.5%、91.5%、86.7%，最差的依然為靚貝處理，抑制效果為68.3%、64.5%、53.5%；在4 d（對照組長滿培養(yǎng)基平板）后，各處理間的差異顯著增多，且處理效果大多保持在70%以上。說明這些藥劑的藥效是好，但同時殘留也高，對環(huán)境和人體健康存在隱患。

各藥劑處理下不同時間灰霉病菌生長直徑見圖2。從圖2可知，相同藥劑不同觀察時間處理下，各藥劑處理均表現(xiàn)出隨觀察時間延遲藥劑處理對灰霉病菌的抑制效果減弱，其中靚貝的減弱效果最大?；颐共【哂蟹敝乘俾矢摺⑦z傳變異大、適合度高的特性，若連續(xù)使用同一種殺菌劑，灰霉病菌很容易產(chǎn)生抗藥性。病原菌無時無刻不在生長繁殖，但是藥劑添加就只有1次，所以，時間越久，病原菌產(chǎn)生的各種代謝產(chǎn)物同藥劑有效物質(zhì)發(fā)生作用越多，藥效稀釋是可以預見的，這也是在生產(chǎn)實踐中要多次施藥的原因。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

不同體積的煙草提取物對草莓灰霉病菌有一定抑制效果，并且隨著施用體積分數(shù)的增加抑制效果越明顯，其中4.0 mL處理效果最好，達56.26%，相比其他處理顯著。藥劑處理實驗中，在短期時間內(nèi)，科灰2號處理效果最佳；3 d過后，撲海因處理抑制效果最好，靚貝處理抑制效果一直最差；同種藥劑都隨著觀察時間延遲抑制效果減弱，但是減弱效果沒有煙草提取物明顯。

表3 藥劑對灰霉病菌的抑制效果

圖2 各藥劑處理下不同時間灰霉病菌生長直徑

3.2 討論

分析表2和表3可以得出，煙草提取物的抑制效果和藥劑相比還有一定差距，煙草提取物效果最好的4.0 mL也比藥劑效果最差的靚貝弱；煙草提取物和藥劑處理對草莓灰霉病菌的抑制效果都隨觀察時間的推移而減弱，其中煙草提取物的減弱程度高于藥劑。但是，不一定哪種藥抑制效果越好就用哪種藥，還要兼顧經(jīng)濟閥值等因素，煙草提取物具有無毒、無殘留、綠色環(huán)保等優(yōu)點，且獲取和制作手段相對簡單，對比農(nóng)藥還是有一定優(yōu)勢。如果提取物再經(jīng)過一定的加工手段，防治效果可能會更好，并且現(xiàn)在灰霉病菌對市面上的大多數(shù)殺菌劑有不同程度的抗性，因此，使用煙草提取物與藥劑防治相結(jié)合的方式，可以有效減緩抗性菌株的形成，為研究新型殺菌劑提供時間。

在藥劑處理實驗中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)瑞鎮(zhèn)處理過的菌落特征有別于其他處理，主要表現(xiàn)在菌落長勢較短時間里是平鋪生長，但后面是縱向生長，取菌絲時在顯微鏡下觀察不能找到孢子，菌絲有隔膜。瑞鎮(zhèn)有效成分嘧菌環(huán)胺殺菌機理獨特，主要是通過抑制蛋氨酸的生物合成，并抑制水解酶的分泌以達到抑菌防病目的。該藥物在病菌孢子萌發(fā)后起作用，通過抑制病菌菌絲體生長和穿透，從而降低了孢子萌發(fā)。

撲海因處理抑制效果最好，除了所采植株抗藥性低的原因外，還與撲海因有效成分異菌脲的作用機理有關(guān)。異菌脲屬于二羧酰亞胺類殺菌劑，通過抑制細胞色素C還原酶破壞類脂類和膜的合成而發(fā)生效果。

煙草提取物中成份有很多，但是最主要的還是煙堿。煙堿能麻痹昆蟲的神經(jīng)系統(tǒng)，從而達到有效防治害蟲的作用。還有研究表明，灰霉病菌的最佳生長pH值是5.0，說明該菌在偏酸性環(huán)境下生長，而煙堿呈堿性，這可能是煙草提取物能抑制病原菌的原因之一，雖然效果沒有農(nóng)藥明顯，但煙堿來源于煙葉，綠色無污染，符合綠色健康的理念，廢棄煙葉庫存量大，材料易獲得，是用于生物防治的不二選擇。