毛銀，鄒宗勝，鄧禹

(江南大學(xué)，糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇 無錫，214122)

1株植物乳桿菌發(fā)酵豆粕產(chǎn)有機(jī)酸的研究

毛銀，鄒宗勝，鄧禹*

(江南大學(xué)，糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇 無錫，214122)

從發(fā)酵豆粕中篩選得到1株生長迅速產(chǎn)酸量大的乳酸菌，經(jīng)鑒定為植物乳桿菌，命名為JUN-DY-6，利用該菌對豆粕進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵。通過高效液相色譜法(HPLC)對發(fā)酵豆粕中的有機(jī)酸組成進(jìn)行了定性定量分析。結(jié)果顯示：用JNU-DY-6生產(chǎn)的發(fā)酵豆粕中主要有6種有機(jī)酸，其中以乳酸、乙酸、丙酸和檸檬酸為主。且發(fā)酵豆粕工藝中糖蜜的添加與否對發(fā)酵豆粕中丙酸含量影響較大。堿性蛋白酶添加量0.5%，糖蜜添加量為3%的條件下發(fā)酵豆粕，產(chǎn)生有機(jī)酸含量峰值為14.646 g/L，比僅使用乳酸菌發(fā)酵的情況下提高了23.1%。SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果顯示，發(fā)酵豆粕中的大豆蛋白基乎完全降解為小分子多肽。

植物乳桿菌；發(fā)酵豆粕；發(fā)酵工藝；有機(jī)酸

豆粕是畜禽最重要的植物性蛋白源，其粗蛋白含量高，營養(yǎng)豐富并有較平衡的氨基酸組成。在飼料發(fā)酵中，乳酸菌被公認(rèn)為是最傳統(tǒng)、最安全的發(fā)酵菌種，并被稱為益生菌[1]。用乳酸菌發(fā)酵豆粕，乳酸菌能進(jìn)一步降解，并把有效蛋白質(zhì)作為營養(yǎng)源，產(chǎn)生生物活性肽[2]，發(fā)酵產(chǎn)生各種有機(jī)酸，導(dǎo)致pH降低[3]。

有機(jī)酸已經(jīng)廣泛用作畜禽(尤其是豬)的飼料添加劑。有機(jī)酸可直接參與機(jī)體能量、結(jié)構(gòu)和酶促反應(yīng)[4-5]，作為一種高效率的能量來源，有機(jī)酸可減少因糖異生和脂肪分解造成的組織損耗，從而提高營養(yǎng)物質(zhì)消化率，促進(jìn)生產(chǎn)性能發(fā)揮；可降低胃腸道pH值，減緩胃的排空速度，改變腸道內(nèi)微生物區(qū)系，抑制病原菌的繁殖，減少胃腸毒素的產(chǎn)生，同時促進(jìn)益生菌繁殖[6-7]。另外檸檬酸、乳酸和甲酸等有機(jī)酸一方面可直接刺激口腔味蕾，使唾液分泌增多，增強(qiáng)食欲[8-10]；另一方面，由于其具有芳香味，可掩蓋不良?xì)馕?，起調(diào)味作用，從而改善飼料的適口性，促進(jìn)仔豬采食，加快生長[11]。丙酸具有良好的防止飼料發(fā)霉、腐敗的作用。

發(fā)酵豆粕的核心是降解大分子蛋白，使豆粕中的大分子蛋白降解為多肽、小肽和游離氨基酸等小分子。本研究通過添加一定量的堿性蛋白酶來確保大分子蛋白的完全降解，在改進(jìn)發(fā)酵工藝的同時采用了1株從發(fā)酵豆粕中分離的生長迅速，產(chǎn)酸量高的植物乳桿菌，不僅大大減少了蛋白酶的使用量，還縮短了發(fā)酵周期，提高了發(fā)酵豆粕的質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 菌株

植物乳桿菌JNU-DY-6，從發(fā)酵豆粕中分離純化得到，由本實驗室保藏。

1.2 主要試劑

CH3COONa、K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·7H2O、CaCO3、檸檬酸氫二銨：分析純，上海國藥集團(tuán)。豆粕來源于豐益(上海)生物技術(shù)研發(fā)中心有限公司；放線菌酮，上海生工(Sangon)；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒，北京索萊寶科技有限公司(Solarbio)。

1.3 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨 10.0，牛肉浸取物 10.0，酵母提取液 5.0，葡萄糖 5.0，CH3COONa 5.0，檸檬酸氫二銨2.0，吐溫80 1.0，K2HPO42.0，MgSO4·7H2O 0.2，MnSO4·7H2O 0.05，pH 6.2～6.4，分離培養(yǎng)基：在MRS固體中添加2% CaCO3。

1.4 主要儀器與設(shè)備

隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；HYG-II 空氣恒溫?fù)u床，上海欣蕊自動化設(shè)備有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；UVmini-1240紫外分光光度計，日本SHIMADZU公司；PL2002電子天平，METTLER TOLIDO公司；5804R冷凍離心機(jī)，Eppendorf公司；5424臺式高速離心機(jī)，Eppendorf公司；高效液相色譜儀，Hitachi公司；基因擴(kuò)增儀(C1000TM Thermal Cycler)，Bio-Rad公司；DYY-6C 型電泳儀，Bio-Rad 公司；GelDoc凝膠成像儀，Bio-Rad公司。

1.5 實驗與方法

1.5.1 乳酸菌的富集

將發(fā)酵豆粕以100 g/L的接種量接種于添加了放線菌酮(50 μg/mL)的MRS液體培養(yǎng)基中，200 r/min，37 ℃培養(yǎng)48 h，連續(xù)增殖2～3次。

1.5.2 乳酸菌的分離純化

取一定量的富集菌液，用無菌生理鹽水逐級稀釋，涂布于已經(jīng)制備好的分離培養(yǎng)基(含2%的碳酸鈣)平板上，其上再覆蓋一層同樣的培養(yǎng)基，夾層厭氧培養(yǎng)(30 ℃，48 h)，然后挑選溶鈣圈大的單菌落，在分離培養(yǎng)基上多次劃線分離純化得到純培養(yǎng)物經(jīng)鑒定為植物乳桿菌，并命名為JUN-DY-6。

1.5.3 菌株的生長曲線的測定

挑取單菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中200 r/min，37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)過夜作為種子液待用。取2.5 mL菌懸液于45 mL MRS培養(yǎng)基中(5%的接種量)，37 ℃ 200 r/min恒溫培養(yǎng)。用分光光度計測量OD值，跟蹤菌種生長情況。選用600 nm波長，以蒸餾水做參比，開始培養(yǎng)前測定種子的OD值作為起點(diǎn)，開始培養(yǎng)后，每隔4 h測定1次，每次測量3組數(shù)據(jù)做對照。處理OD600值，繪制該菌生長曲線圖。

1.5.4 發(fā)酵豆粕

將風(fēng)干的豆粕、水、糖蜜、堿性蛋白酶以及對數(shù)期的植物乳桿菌菌液按不同的的配比混合均勻后置于經(jīng)無菌處理的自封袋中，封口置于37 ℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵48 h，每4 h取1次樣。每批次實驗做3個平行。

1.5.5 發(fā)酵豆粕的預(yù)處理

1.5.5.1 高效液相色譜樣品處理

每次取樣取4 g發(fā)酵豆粕于50 mL離心管中，加入40 mL去離子水?dāng)嚢杌靹蜢o置1 h后取上清，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后置于液相瓶中用于下一步實驗。

1.5.5.2 SDS-PAGE凝膠電泳樣品處理

稱取3 g豆粕于100 mL燒杯中，加入30 mL 0.2% NaOH室溫下攪拌15 min，于6 000 r/min離心7 min，棄脂層和沉淀小心留取上清液2 mL，稀釋5倍留樣。取30 μL經(jīng)稀釋的樣品上清液，加10 μL 4×buffer，沸水浴10 min，13 000 r/min離心5 min用上清上樣。

1.5.6 高效液相色譜法(HPLC)分析樣品

使用日立高效液相色譜儀，紫外吸收檢測器，分析柱用有機(jī)酸柱(Aninex Hpx-87H ion exchange column)柱溫50 ℃，流動相5 mmol/L H2SO4溶液，流速0.6 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，標(biāo)樣及樣品每個跑27 min。輸出圖譜進(jìn)行分析。根據(jù)出峰時間和峰面積和標(biāo)準(zhǔn)品比對，計算樣品中各種有機(jī)酸的含量。

1.5.7 SDS-PAGE凝膠電泳

按照試劑盒中的說明書配置：12%的分離膠，5%的濃縮膠。上樣量20 μL，先用80 V的電壓跑20 min后，繼續(xù)用120 V的電壓跑120～180 min。跑膠結(jié)束后，先用固定液固定0.5 h，再用考馬斯亮藍(lán)染色液染色1 h，最后用脫色液脫色3 h，用凝膠成像儀拍照，進(jìn)行圖像分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 植物乳桿菌JUN-DY-6生長曲線

測定OD600后繪制該菌的生長曲線(圖1)。該菌生長24 h左右進(jìn)入平臺期。實驗選用15～18 h的菌液作為種子液為宜。

圖1 植物乳桿菌JUN-DY-6生長曲線Fig.1 Growth curve of plant Lactobacillus JUN-DY-6

2.2 發(fā)酵豆粕不同有機(jī)酸含量分析

以下圖中出現(xiàn)的ABCDEFGH分別代表不同的發(fā)酵工藝：A.未添加蛋白酶且同時加乳酸菌；B.未添加蛋白酶且隔夜后添加乳酸菌；C.0.5%蛋白酶同時接種乳酸菌；D.0.5%蛋白酶隔夜接種乳酸菌；E.1%蛋白酶同時接種乳酸菌；F.1%蛋白酶隔夜接種乳酸菌；G.2%蛋白酶同時接種乳酸菌；H.2%蛋白酶隔夜接種乳酸菌。

2.2.1 乳酸含量分析

乳酸(C3H6O3)能維持動物腸道菌群平衡，減少腹瀉，促進(jìn)鈣質(zhì)的吸收。從乳酸含量來看(圖2)，G.添加2%蛋白酶同時接種乳酸菌的條件下乳酸含量最高為7.435 g/L，其次是D.添加0.5%蛋白酶隔夜添加乳酸菌、F.添加1%蛋白酶隔夜添加乳酸菌和C.0.5%蛋白酶同時添加乳酸菌的條件，乳酸含量分別為6.495 g/L、6.470 g/L和6.385 g/L，與對照組A相比，分別增加了31.9%、32.4%、33.0%。由此可見，若想提高豆粕中的乳酸含量，可以選擇添加2%蛋白酶同時接種乳酸菌。

圖2 發(fā)酵豆粕乳酸含量Fig.2 Lactic acid content in fermented soybean meal

2.2.2 乙酸含量分析

乙酸(C2H4O2)是很好的抗微生物劑、酸度調(diào)節(jié)劑和酸味劑，但是有較為刺激的氣味。從乙酸含量來看(圖3)，G.添加2%蛋白酶同時接種乳酸菌的條件下乙酸含量最高為4.261 g/L，其次分別是C.添加0.5%蛋白酶隔夜添加乳酸菌、D.0.5%蛋白酶同時添加乳酸菌和E.添加1%蛋白酶同時添加乳酸菌，產(chǎn)酸量分別為3.650 g/L、3.575 g/L、3.680 g/L。對照組(A)乙酸的含量為3.07g/L。

圖3 發(fā)酵豆粕乙酸含量Fig.3 Acetic acid content in fermented soybean meal

2.2.3 丙酸含量分析

丙酸(C3H6O2)具有很好的防真菌和霉菌的作用，效果優(yōu)于苯甲酸，是極佳的食品防腐劑。從丙酸含量看(圖4)，D.添加0.5%蛋白酶隔夜接種乳酸菌的條件下發(fā)酵，丙酸含量最高，為2.840 g/L，而對照組A丙酸的含量為1.945 g/L。其次是H.添加2%蛋白酶隔夜接種乳酸菌，丙酸含量為2.525 g/L。發(fā)酵豆粕中丙酸的積累，能有效延長發(fā)酵豆粕存儲的時間。另外，實驗發(fā)現(xiàn)糖蜜的添加與否與丙酸的積累存在緊密聯(lián)系，不添加糖蜜組基本不積累丙酸。

圖4 發(fā)酵豆粕丙酸含量Fig.4 Propionic acid content in fermented soybean meal

2.2.4 檸檬酸含量分析

檸檬酸(C6H8O7)具有抗氧化、增加酸味、抑制細(xì)菌、護(hù)色、改進(jìn)風(fēng)味、清除有害金屬的作用，是良好的食物酸味劑。由圖5分析，從檸檬酸含量看，各種發(fā)酵條件下都明顯比對照組產(chǎn)量多，都在1.000 g/L左右。

圖5 發(fā)酵豆粕檸檬酸含量Fig.5 Citric acid content in fermented soybean meal

2.2.5 蘋果酸含量分析

蘋果酸(C4H6O5)是很好的穩(wěn)定劑，有較好的抗氧化能力，在酸性條件下殺菌性很強(qiáng)，能促進(jìn)氨基酸的吸收。與檸檬酸相比，酸度更大，產(chǎn)生熱量更低，口味上更柔和。由圖6可知，從蘋果酸含量來看，C.添加0.5%蛋白酶同時接種乳酸菌的條件下產(chǎn)量最高為0.940 g/L，其他條件下蘋果酸的產(chǎn)量相差不大。

圖6 發(fā)酵豆粕蘋果酸含量Fig.6 Malic acid content in fermented soybean meal

2.2.6 琥珀酸含量分析

琥珀酸(C4H6O4)可以產(chǎn)生酸味、呈味，也可以用作防腐劑。由圖7可知，H. 2%蛋白酶隔夜接種乳酸菌的條件下琥珀酸含量最高為0.695 g/L，其他條件下琥珀酸含量明顯比對照組A產(chǎn)琥珀酸量高，且差別不大。

圖7 發(fā)酵豆粕琥珀酸含量Fig.7 Succinate content in fermented soybean meal

2.2.7 總酸含量分析

發(fā)酵豆粕中，各種有機(jī)酸的含量和總酸的量決定了發(fā)酵豆粕的品質(zhì)。添加糖蜜的發(fā)酵豆粕，由圖8可以看出，C.0.5%蛋白酶同時接種乳酸菌、D.0.5%蛋白酶隔夜接種乳酸菌和G.2%蛋白酶同時接種乳酸菌這3種條件下總酸量相對較高，分別為14.646、14.818和14.854 g/L。綜合各種有機(jī)酸的情況，且考慮生產(chǎn)成本，不難看出，條件G.2%蛋白酶同時接種乳酸菌的情況下乳酸、乙酸含量最高；C.0.5%蛋白酶，同時接種乳酸菌的條件產(chǎn)蘋果酸最多，D.0.5%蛋白酶，隔夜接種乳酸菌的條件下產(chǎn)丙酸最多，其他有機(jī)酸的含量在3種條件下大體相當(dāng)。若要使發(fā)酵豆粕保存時間長，則選擇D.0.5%蛋白酶隔夜接種乳酸菌的條件；若要發(fā)酵豆粕中乳酸乙酸含量最高、總酸含量最高，要選擇G.2%蛋白酶同時接種乳酸菌的條件；若要提高發(fā)酵豆粕的風(fēng)味和適口性，需要選擇C.0.5%蛋白酶同時接種乳酸菌的條件來制備發(fā)酵豆粕。

圖8 加糖蜜組總酸情況Fig.8 Total acids content in add molasses group

2.3 糖蜜對發(fā)酵豆粕有機(jī)酸含量影響分析

由圖9分析得出，各條件下，未加糖蜜組的總酸量在3.594～10.463 g/L。而加入糖蜜組有機(jī)酸總量在8.819～14.818 g/L，可見不同的發(fā)酵工藝下添加糖蜜后總酸產(chǎn)量提高4.355～5.225 g/L。由圖10、圖11在不同的發(fā)酵條件下，未加糖蜜組和加糖蜜組發(fā)酵豆粕產(chǎn)各種有機(jī)酸含量對比可見，糖蜜對于乳酸菌發(fā)酵豆粕產(chǎn)乙酸、檸檬酸、蘋果酸等影響較大。同時未加糖蜜組不產(chǎn)乳酸、丙酸，加入糖蜜組產(chǎn)生的乳酸、丙酸量則較高。由此可見糖蜜對于乳酸菌發(fā)酵豆粕產(chǎn)有機(jī)酸的種類、有機(jī)酸的總含量均有重要的影響。

圖9 加糖蜜組及未加糖蜜組總酸含量比較Fig.9 Comparison of total acid content in molasses group and control group

圖10 添加糖蜜組有機(jī)酸含量Fig.10 Various organic acids content in add molasses group

圖11 未添加糖蜜組有機(jī)酸含量Fig.11 Various organic acids content in control group

2.4 SDS-PAGE凝膠電泳分析

大豆球蛋白是豆粕的主要營養(yǎng)成分之一，其中伴7S大豆球蛋白及11S大豆球蛋白是大豆球蛋白最重要的成分[12]。其中，7S伴大豆球蛋白由3個亞基組成，其相對分子質(zhì)量分別為60 466 Da，55 029 Da，49 043 Da，11S大豆球蛋白也由3個亞基組成，其相對分子質(zhì)量分別為44 634 Da，39 779 Da和17 952 Da。根據(jù)SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果圖12可知，利用乳酸菌，在少量酶的作用下能夠完全降解伴7S和11S大豆蛋白，而且效果非常明顯。

圖12 發(fā)酵豆粕中大豆蛋白的降解情況Fig.12 Degradation of soybean proteins in fermented soybean meal

3 結(jié)論

發(fā)酵豆粕中的酸譜根據(jù)發(fā)酵工藝的不同有較大的差別，主要含有3種有機(jī)酸：乳酸、乙酸和檸檬酸。在添加了糖蜜的情況下，發(fā)酵豆粕中可積累較大量的丙酸，且植物乳桿菌的生長情況明顯較未添加糖蜜組好，未加糖蜜組的總酸量在3.594～10.463 g/L。而加入糖蜜組有機(jī)酸總量在8.819～14.818 g/L，明顯較未加糖蜜組高。堿性蛋白酶添加量0.5%，糖蜜添加量為3%的條件下發(fā)酵豆粕，產(chǎn)生有機(jī)酸含量峰值為14.646 g/L，比不添加堿性蛋白酶僅使用乳酸菌發(fā)酵的情況下提高了23.1%。實際生產(chǎn)中應(yīng)根據(jù)具體目的調(diào)整發(fā)酵工藝以滿足生產(chǎn)要求。SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果顯示，發(fā)酵豆粕中的大豆蛋白降解為小分子多肽。

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ResearchonproductionoforganicacidsinsoybeanmealbyfermentationwithLactobacillusplantarum

MAO Yin, ZOU Zong-sheng, DENG Yu*

(National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

JNU-DY-6 was isolated from soybean meal and identified asLactobacillusplantarum.It had great potential in acid production and it grew rapidly. we analyzed the composition of organic acids in fermented soybean meal by high performance liquid chromatography (HPLC).The results showed that there were 6 kinds of organic acids in fermented soybean meal,mainly including lactic acid,acetic acid,propionic acidandcitric acid. And the addition of molasses had great influence on the composition and yield ofpropionic acidin soybean meal.we worked out the optimum mass ratio for soybean meal fermentation(100g): Alcalase 0.5%,molasses 3%,the total organic acids content reached 14.643 g/L,which was 1.231 fold higher than that of normal contro lgroup respectively. By SDS-PAGE we found that soybean protein degraded into small molecular peptides.

Lactobacillusplantarum; soybean meal;fermentation techniques;organic acids

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014341

碩士研究生(鄧禹教授為通訊作者,E-mail：dengyu@jiangnan.edu.cn)。

國家自然科學(xué)基金(31500070)；江蘇省自然科學(xué)基金青年基金(BK20150136)

2017-03-20，改回日期：2017-05-23