閻 紅，雒江菡，關(guān)樺楠，王宏宇，呂 明，姜 珊

（哈爾濱商業(yè)大學(xué) 細(xì)胞與分子生物學(xué)研究所，黑龍江 哈爾濱150076）

乙醇法提取魚腥草總黃酮提取工藝研究*

閻 紅，雒江菡*，關(guān)樺楠，王宏宇，呂 明，姜 珊

（哈爾濱商業(yè)大學(xué) 細(xì)胞與分子生物學(xué)研究所，黑龍江 哈爾濱150076）

魚腥草作為一種常見的植物，廣泛分布在中國的東南、中部和西南地區(qū)。它不僅可以作為食物，還可作為治療各種疾病的藥物。本論文以魚腥草為原料，進(jìn)行總黃酮的提取，篩選并優(yōu)化其最佳工藝條件，并對其進(jìn)行抑菌作用研究。魚腥草總黃酮含量通過紫外可見分光光度法測定。最佳條件為：提取溫度為80℃，料液比為1∶10，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，提取時間為90min，提取率為1.868%。該研究為魚腥草資源的合理利用和天然抗菌劑的開發(fā)提供了依據(jù)。

魚腥草；總黃酮；提取

魚腥草（學(xué)名：Houttuynia cordata）在分類學(xué)上屬雙子葉植物三白草科蕺菜屬，原名蕺菜，又名折耳根、蕺兒根、截兒根、豬鼻孔、九節(jié)蓮等。由于其干莖和葉子經(jīng)過粉碎后有魚的腥味，所以將其命名為魚腥草。魚腥草廣泛分布于我國的中部地區(qū)、西南地區(qū)及長江流域以南各地。魚腥草具備很多的藥理功效，可以提高人體免疫力，有抗菌、抗病毒及抗腫瘤等作用，有清熱解毒、化痰、消腫排膿、利尿通淋等功能[1，2]，是衛(wèi)生部確認(rèn)的一種藥食兩用的植物。

魚腥草的主要成分之一是黃酮，大部分是以糖苷形式存在的苷類，主要是蘆丁、槲皮甙、異槲皮苷、瑞諾苷、金絲桃甙等槲皮素和以槲皮素為甙元的黃酮類化合物。研究表明，它的花、葉、果實(shí)中均含有黃酮類物質(zhì)，尤其是魚腥草葉，其總黃酮含量是魚腥草根莖的2至5倍。黃酮類物質(zhì)只能從植物中提取得到，無法在人體中合成[3]，魚腥草就是一種黃酮類化合物的主要來源。

本試驗(yàn)考察單因素提取時間、提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)和固液比對魚腥草中總黃酮提取效果的影響，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上用正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化醇提法提取魚腥草中總黃酮的工藝，為擴(kuò)大魚腥草的經(jīng)濟(jì)價值，擴(kuò)大使用范圍具有重要的指導(dǎo)意義[4，5]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器設(shè)備及藥品

本實(shí)驗(yàn)的原料為魚腥草葉，呈棕色，有特異腥味，產(chǎn)地為江蘇，由黑龍江藺氏盛泰藥業(yè)有限公司提供。

本次實(shí)驗(yàn)所用試劑:蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（上海昕明生物科技有限公司）；無水乙醇，NaNO2，NaOH，Al（NO3）3等購自重慶化學(xué)試劑總廠。

索氏提取器；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；紫外可見分光光度計(jì)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品置于105℃常壓干燥至質(zhì)量恒定，精密量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5mg于50mL容量瓶，用70%乙醇定容至50mL，搖勻，備用。

取6個25mL容量瓶，分別標(biāo)號為1至6號，精確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液 0，1.0，2.0，3.0，4.0 和 5.0mL，依次放入1至6號容量瓶中，用70%乙醇補(bǔ)足10mL后加入5%NaNO2溶液0.8mL，搖勻，放置6min，加入 10%Al（NO3）3溶液 0.8mL，搖勻，放置6min，再加入 4%NaOH溶液10mL，搖勻，顯色，用70%乙醇定容至刻度，放置15min后于510nm處測定其吸光度。以不同濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，510nm下的吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[6]。

1.3 總黃酮的提取和含量測定

取適量魚腥草粉末，以一定比例加入一定體積分?jǐn)?shù)乙醇，置于50mL提取罐中，在一定溫度下回流提取一定時間，待提取液冷卻后，抽濾，取濾液置離心機(jī)中離心20min，離心后取上清液置50mL容量瓶中，用70%乙醇定容后按2.1方法待測[7]。

1.4 單因素試驗(yàn)

1.4.1 乙醇體積分?jǐn)?shù) 操作同1.3部分，料液比為1∶10，溫度為70℃，提取時間為120min，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、60%、70%、80%、90%對魚腥草總黃酮提取率的影響。

1.4.2 提取時間 操作同1.3部分，料液比為1∶10，溫度為70℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，考察提取時間60、90、120、150、180min 對魚腥草總黃酮提取率的影響。

1.4.3 提取溫度 操作同1.3部分，料液比為1∶10，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，提取時間為120min，考察提取溫度 50、60、70、80、90℃對魚腥草總黃酮提取率的影響。

1.4.4 料液比 操作同1.3部分，溫度為70℃，提取時間為120min，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，考察料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 對魚腥草總黃酮提取率的影響。

1.5 正交試驗(yàn)

以上單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為參考，考慮各因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響的大小，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，確定提取魚腥草總黃酮的最佳工藝。

1.6 最優(yōu)提取方案含量測定

根據(jù)1.5節(jié)正交試驗(yàn)結(jié)果，確定魚腥草提取總黃酮的最佳工藝，在最佳工藝下按照1.3節(jié)方法提取總黃酮并測定其吸光度[8]。

1.7 方法學(xué)考察

1.7.1 精密度 取2mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液至50mL容量瓶中，加70%乙醇補(bǔ)足10.0mL，按2.1方法測其510nm下的吸光度（以不加蘆丁的空白管為對照調(diào)零），重復(fù)測定6次，根據(jù)吸光度值計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差判斷其精密度。

1.7.2 穩(wěn)定性 取最優(yōu)提取方案提取液2mL于50mL容量瓶中，加70%乙醇補(bǔ)足10.0mL，按2.1方法測其510nm下的吸光度，在180min內(nèi)，每隔30min，于510nm處測一次吸光度。根據(jù)吸光度值計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，判斷吸光度是否穩(wěn)定。

1.7.3 重復(fù)性 按最優(yōu)方案以統(tǒng)一的條件提取魚腥草中的總黃酮，重復(fù)5份，分別取提取液2mL，置于5個50mL容量瓶中，分別加70%乙醇補(bǔ)足10.0mL，按2.1方法測其510nm下的吸光度。根據(jù)吸光度值計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，判斷重復(fù)性是否良好。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，得回歸方程A=9.9429C-0.0041，R2=0.9976。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮含量的影響 如圖2所示，乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取液總黃酮含量影響明顯，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，提取液中總黃酮含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時，提取液總黃酮含量最高，為0.0292mg·mL-1。由此確定，提取魚腥草總黃酮時最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮含量的影響Fig.2 Effect of alcohol volume on extraction efficiency of total flavonoids

2.2.2 提取時間對總黃酮含量的影響 如圖3所示，提取時間對提取液總黃酮含量影響明顯，隨提取時間的延長，提取液中總黃酮含量呈現(xiàn)先上升后下降趨勢。當(dāng)提取時間為120min時，提取液中總黃酮含量最高，為0.0243mg·mL-1。由此確定，提取魚腥草總黃酮最佳時間為120min。

圖3 時間對總黃酮含量的影響Fig.3 Effect of extraction time on total flavonoids content

2.2.3 提取溫度對總黃酮含量的影響 如圖4所示，提取溫度對提取液總黃酮含量影響明顯，隨提取溫度的提高，提取液中總黃酮含量先上升后下降。當(dāng)提取溫度為70℃時，提取液總黃酮含量最高，為0.0334mg·mL-1。由此確定，提取魚腥草總黃酮最佳溫度為70℃。

圖4 提取溫度對總黃酮含量的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on total flavonoids content

2.2.2.4 料液比對總黃酮含量的影響 如圖5所示，料液比對提取液總黃酮含量影響明顯，隨著溶劑體積的增加，總黃酮含量先上升后下降。當(dāng)料液比為1∶20時，提取液總黃酮含量最高，為 0.0208mg·mL-1。由此確定，提取魚腥草總黃酮最佳料液比為1∶20。

圖5 料液比對總黃酮含量的影響Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on total flavonoids content

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

在上述單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行四因素三水平實(shí)驗(yàn)，具體正交試驗(yàn)因素及水平見表1。

表1 L9（34）魚腥草總黃酮提取工藝正交試驗(yàn)Tab.1 Orthogonal experiment of extracting total flavonoids from Houttuynia cordata

由表2可見，影響魚腥草中總黃酮提取率的因素依次為D＞A＞B＞C，即料液比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取時間＞提取溫度；最佳工藝為A1B2C3D1，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、料液比為1∶10（g·mL-1）、提取溫度為80℃，提取時間為90min。在此條件下魚腥草的提取率為1.868%。

表2 L9（34）魚腥草總黃酮提取工藝正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Orthogonal experiment results of extracting total flavonoids from Houttuynia cordata

2.4 方法學(xué)考察結(jié)果

2.4.1 精密度

試驗(yàn)結(jié)果見表3。吸光度RSD（n=6）為0.34%，表明此方法精密度良好。

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果Tabl.3 Accuracy test results

2.4.2 穩(wěn)定性 試驗(yàn)結(jié)果見表4。吸光度RSD（n=6）為0.06%，表明供試品在3h內(nèi)穩(wěn)定。

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Stability test results

2.4.3 重復(fù)性 試驗(yàn)結(jié)果見表5。吸光度RSD（n=5）為0.73%，表明此方法重復(fù)性良好，方案可行。

表5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Repetitive test results

3 結(jié)論

本研究是從魚腥草中提取具有抑菌作用的黃酮，選用醇提法提取黃酮，由于影響醇提法的主要因素是乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度和提取時間，因此，對這4個因素分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)，并根據(jù)所得結(jié)果確定較好的三水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，通過正交試驗(yàn)結(jié)果可知，提取黃酮的最優(yōu)條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比1∶10，提取溫度80℃，提取時間90min，總黃酮得率為1.868%。

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Study on extraction technology of total flavonoids from Houttuynia cordata thunb by alcohol*

YAN Hong，LUO Jiang-han*，GUAN Hua－nan，WANG Hong-yu，LV Ming，JIANG Shan
（Institute of Cell and Molecular Biology，Harbin University of Commerce，Harbin 150076，China）

As a common plant，Houttuynia cordata is widely distributed in the area of southeast，central region and southwest of China.It is not only used as great food material，but also a medicine for curing various diseases.This paper used Houttuynia cordata as a raw material to extract total flavonoids，screen and optimize the best process conditions，and in vitro antibacterial test.The total flavonoids quality of Houttuynia cordata are determined by UV-V spectrophotometry.The results showed that the best extraction condition of flavonoids from Houttuynia cordata includes:the extraction temperature is 80℃，solid-liquid ratio is 1∶10，solvent is 60%ethanol，extraction time is 90 min.The extraction efficiency was 1.868%.This study provided a basis for the reasonable utility of the resource and the development of natural antimicrobials.

Houttuynia cordata；Total flavonoids；extraction

R932

A

10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20171218

2017-09-19

大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（No.201610240007）

閻 紅（1993-），女，哈爾濱，漢，在讀本科生，從事制藥工程研究。

導(dǎo)師簡介：雒江菡（1980-），女，漢，講師，博士，主要從事中藥學(xué)研究。