田琴琴，朱 輝，黃正旭,3*，黃 保，鄒 星，林利泉，李 輝，尹 琛

(1.暨南大學(xué) 質(zhì)譜儀器與大氣環(huán)境研究所，廣東 廣州 510632；2.昆山禾信質(zhì)譜技術(shù)有限公司，江蘇 昆山 215300；3.廣東省大氣污染在線源解析系統(tǒng)工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510632；4.廣州禾信儀器股份有限公司，廣東 廣州 510632)

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用接口技術(shù)的研制及性能表征

田琴琴1，朱 輝2，黃正旭1,3*，黃 保4，鄒 星4，林利泉4，李 輝4，尹 琛4

(1.暨南大學(xué) 質(zhì)譜儀器與大氣環(huán)境研究所，廣東 廣州 510632；2.昆山禾信質(zhì)譜技術(shù)有限公司，江蘇 昆山 215300；3.廣東省大氣污染在線源解析系統(tǒng)工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510632；4.廣州禾信儀器股份有限公司，廣東 廣州 510632)

自制了一套液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用接口，接口包含大氣壓接口、離子源及連接高效液相色譜進(jìn)樣器和質(zhì)譜采集軟件的電子通訊接口。成功地將賽默飛世爾高效液相色譜戴安U3000與團(tuán)隊自主研制的API-TOFMS10000相連。實(shí)驗結(jié)果表明，自行搭建的液質(zhì)聯(lián)用儀有很好的穩(wěn)定性(RSD=5.6%)，線性相關(guān)系數(shù)(r2)為0.995 8，線性范圍為2～2 000 pg，定量下限為2 pg，檢出限為0.5 pg。可明顯檢出吡羅昔康、茶堿和潑尼松3種標(biāo)準(zhǔn)藥品。實(shí)驗數(shù)據(jù)表明自行研發(fā)的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用接口滿足應(yīng)用要求，搭建的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀在生物化學(xué)、醫(yī)藥分析、食品安全、環(huán)境檢測等領(lǐng)域具有應(yīng)用潛力。

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀；接口技術(shù)；大氣壓接口；離子源

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)以液相色譜作為分離系統(tǒng)，質(zhì)譜為檢測系統(tǒng)[1]。LC-MS結(jié)合了液相色譜儀有效分離熱不穩(wěn)定性及高沸點(diǎn)化合物的分離能力和質(zhì)譜儀的組分鑒定能力，解決了極性大、揮發(fā)度低、熱穩(wěn)定性差的化合物的電離檢測問題[2]，能夠準(zhǔn)確鑒定和定量分析復(fù)雜樣品基質(zhì)中的微量化合物，是一種分離分析復(fù)雜混合物的有效手段，在生物化學(xué)、醫(yī)藥分析、食品安全、環(huán)境檢測等領(lǐng)域中發(fā)揮著越來越重要的作用[3-12]。

高效液相色譜儀與質(zhì)譜儀的成功聯(lián)用需要解決3大難題：①解決色譜到質(zhì)譜的真空過渡問題；②離子源在霧化樣品時需產(chǎn)生足夠多的氣相離子；③去除流動相中雜質(zhì)對質(zhì)譜造成的污染。因此高效液相色譜儀和質(zhì)譜儀聯(lián)機(jī)的關(guān)鍵是接口技術(shù)的開發(fā)。針對第一個難題，一些儀器廠商分別采用了取樣錐或毛細(xì)管作為大氣壓接口的前半部分，采用小型四極桿、透鏡或離子漏斗作為大氣壓接口的后半部分，有效地解決了真空過渡問題。為了減少樣品對質(zhì)譜的污染和提高霧化效果，儀器廠商對離子源進(jìn)行了特殊設(shè)計，離子源噴霧與質(zhì)譜口的角度有0°，60°和90° 3種，另外會采用加熱輔氣輔助去溶，采取加熱輔氣裝置與噴霧同軸，或者加熱輔氣位于噴霧兩側(cè)，這些措施有效提高了樣品霧化效果并減少了污染。

本文綜合液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的需求、特點(diǎn)及發(fā)展趨勢，基于氣體超音速膨脹、電噴霧、電路設(shè)計等已有原理[13-22]，研制了一款液質(zhì)聯(lián)用接口裝置，包括大氣壓接口、離子源和電子通訊接口，成功將賽默飛世爾高效液相色譜戴安U3000和課題組自主研制的大氣壓電離飛行時間質(zhì)譜儀API-TOFMS10000相連，通過對儀器性能的表征，證明該接口裝置性能和市售商品儀器相當(dāng)，能滿足市場需求，展示了該聯(lián)用儀在生物化學(xué)、醫(yī)藥分析、食品安全、環(huán)境檢測等領(lǐng)域的應(yīng)用潛力。

1 接口的研制

本文大氣壓接口和離子源的研制是基于自主研制的大氣壓電離飛行時間質(zhì)譜儀(API-TOFMS10000)，大氣壓電離飛行時間質(zhì)譜儀主要由離子源、大氣壓接口、離子傳輸裝置、質(zhì)量分析器及檢測器組成。本文改進(jìn)了大氣壓電離飛行時間質(zhì)譜儀的大氣壓接口和離子源部分，使其與高效液相色譜聯(lián)用時解決了靈敏度不高和高通量去溶效果不佳的問題，并制作了連接高效液相色譜和質(zhì)譜的電子通訊接口，實(shí)現(xiàn)了液質(zhì)聯(lián)用檢測采集自動化。

圖1 大氣壓接口結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic diagram of atmosphere pressure interface

1.1 大氣壓接口

大氣壓接口由毛細(xì)管和分子離子反應(yīng)器裝置(MIR)組成(圖1)，詳細(xì)的結(jié)構(gòu)已有報道[23]，考慮到真空度、靈敏度等因素，采用了內(nèi)徑為0.5 mm，長為118 mm的金屬毛細(xì)管。金屬毛細(xì)管位于加熱套筒中部，加熱套筒內(nèi)有加熱棒和溫度傳感器，用于金屬毛細(xì)管控溫，達(dá)到進(jìn)一步去除樣品中溶劑的效果。MIR裝置距毛細(xì)管末端1～2 mm處，為一組直徑4 mm，長25 mm的多節(jié)式四極桿，置于聚焦極片(focus)和引出極片(out-plate)之間。分子離子反應(yīng)裝置(MIR)作為大氣壓接口的一部分，其主要功能除了提高離子化效率及真空過渡之外，還可使離子在一定的電壓條件下，發(fā)生分子離子反應(yīng)進(jìn)而導(dǎo)致離子的碰撞誘導(dǎo)解離(Collision induced dissociation，CID)[24]，而母離子及碎片離子信息可為分子結(jié)構(gòu)的分析提供參考，提高儀器定性能力。

圖2 離子源結(jié)構(gòu)示意圖Fig.2 Schematic diagram of ESI source

1.2 離子源

傳統(tǒng)電噴霧電離源的最佳進(jìn)樣通量為1～10 μL/min，而液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用的進(jìn)樣通量為μL級，傳統(tǒng)電噴霧電離源在高通量進(jìn)樣的情況下，去溶效果不佳。為解決上述問題，本課題組自制了一套離子源(圖2)，該裝置包含離子源室、加熱輔氣裝置、霧化器裝置和廢液廢氣排出口等。在電噴霧電離源的噴霧器兩側(cè)增加兩個加熱輔氣裝置，可根據(jù)需要自由調(diào)節(jié)加熱輔氣裝置與噴霧的距離以及加熱的溫度。加熱輔氣裝置使ESI源能適應(yīng)10～1 000 μL/min流速范圍，達(dá)到與LC聯(lián)用的高通量要求。加熱輔氣裝置加熱路徑短，加熱效率高，能將氣體加熱至500 ℃高溫，兩束高溫氮?dú)饬魍瑫r以60°對準(zhǔn)噴霧，使樣品得以充分快速去溶，達(dá)到有效去除溶劑的目的。采用金屬毛細(xì)管噴針，克服了石英毛細(xì)管長時間使用針頭塌陷及不能長時間高溫烘烤的問題，同時高壓可直接加在不銹鋼噴針上，樣品更易帶電，霧化效果更好。另外離子源內(nèi)部正下方設(shè)有排氣口便于排出廢氣廢液。

圖3 電子通訊接口與自動進(jìn)樣器和采集軟件連接的示意圖Fig.3 Schematic diagram of the electronic communication interface with the autosampler and the acquisition software

1.3 電子通訊接口的制作

自行搭建的液質(zhì)聯(lián)用儀需通過電子通訊接口來實(shí)現(xiàn)全自動進(jìn)樣及樣品檢測。液相色譜自動進(jìn)樣器在進(jìn)樣時會發(fā)出進(jìn)樣信號，通過示波器檢測到進(jìn)樣信號后對信號進(jìn)行分析，然后采用電子通訊接口將進(jìn)樣信號轉(zhuǎn)發(fā)為觸發(fā)信號，觸發(fā)采集軟件開始采集樣品，從而達(dá)到高效液相色譜儀一開始進(jìn)樣，質(zhì)譜采集軟件就開始采集樣品的目的。電子通訊接口包括信號輸入口、信號輸出口和電路板，信號輸入口與自動進(jìn)樣器相連，將進(jìn)樣信號傳給電路板，電路板將進(jìn)樣信號轉(zhuǎn)化為觸發(fā)信號，通過信號輸出口與質(zhì)譜采集軟件相連，控制軟件的采集(圖3)。

2 實(shí)驗與結(jié)果

2.1 儀器與實(shí)驗藥品

賽默飛世爾高效液相色譜儀戴安U3000；大氣壓電離飛行時間質(zhì)譜儀API-TOF MS10000(自主研發(fā))；Sartorius萬分之一天平購自賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；實(shí)驗標(biāo)準(zhǔn)品利血平(批號：32709)、甲醇(色譜純，批號：I1510043)購于阿拉丁試劑有限公司，吡羅昔康(批號：100177-200603)購于中國食品藥品檢定研究院，茶堿、潑尼松購于中國藥品生物制品檢定所。

2.2 方法與結(jié)果

2.2.1色譜條件使用的色譜柱為Biopearl-HC Column C18(5 μm，2.1 mm×150 mm)；流動相為純甲醇；流速為0.3 mL/min(穩(wěn)定性實(shí)驗時)和0.2 mL/min(線性范圍實(shí)驗時)。

2.2.2質(zhì)譜條件電噴霧電離源(ESI)，采集模式：正模式和負(fù)模式，質(zhì)荷比范圍m/z30～1 000，優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometry parameters

2.2.3溶液的制備精密稱取利血平5 mg，置于250 mL容量瓶中，加適量甲醇使其溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取0.125、0.250、1.25、2.5 mL置于50 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別得到0.05、0.1、0.5、1 mg/L的利血平溶液。精密量取0.1 mg/L利血平溶液各0.75、1.0、5.0 mL置于50 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別得到0.001 5、0.002、0.01 mg/L的利血平溶液。精密稱取吡羅昔康、茶堿和潑尼松各1 mg，分別置于100 mL容量瓶中，加甲醇適量使其溶解并稀釋至刻度，搖勻，繼續(xù)稀釋分別得到0.001 mg/L的3種樣品溶液。

2.2.4穩(wěn)定性考察取0.002 mg/L的利血平溶液，每次進(jìn)樣10 μL，在3 h內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣100次，結(jié)果表明連續(xù)進(jìn)樣100次得到的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為5.6%，有很好的穩(wěn)定性。

圖4 利血平的線性范圍Fig.4 The linear range of reserpine

圖5 吡羅昔康、茶堿和潑尼松的質(zhì)譜圖Fig.5 Mass spectrum of piroxicam,theophylline and prednisone

2.2.5線性關(guān)系考察分別取空白(純甲醇)、2、50、100、200、500、1 000、2 000 pg利血平溶液，每個量進(jìn)樣7次，記錄峰面積，各個梯度平行進(jìn)樣峰面積的RSD分別為5.9%、6.9%、1.6%、1.4%、2.1%、1.6%和2.9%，表明方法具有很好的穩(wěn)定性。以峰面積(y)對進(jìn)樣量(x,pg)進(jìn)行回歸分析，利血平的線性方程為y=648 538.48x- 9 481 329.71,r2=0.995 8。結(jié)果表明利血平在進(jìn)樣量2～2 000 pg范圍內(nèi)與峰面積的線性良好(圖4)，線性范圍達(dá)到3個數(shù)量級，與國際水平相當(dāng)。

2.2.6定量下限與檢出限對利血平溶液逐步稀釋后，以0.002 mg/L利血平溶液進(jìn)樣1 μL,當(dāng)信噪比為11時,測得利血平的定量下限(LOQ)為2 pg，進(jìn)樣7次的峰面積的RSD為5.9%。以3倍信噪比計算得出檢出限(LOD)為0.5 pg。

2.2.7藥品檢測將0.001 mg/L的吡羅昔康、茶堿和潑尼松溶液分別進(jìn)樣檢測，進(jìn)樣量為20 μL。潑尼松采用正離子模式，吡羅昔康和茶堿采用負(fù)離子模式進(jìn)行UPLC-MS分析，3個成分的保留時間分別為7.67、6.25、6.00 min，準(zhǔn)分子離子分別為m/z330.06、179.06、381.18。圖5為3個成分的質(zhì)譜圖，3種藥品均被成功檢出，與已有文獻(xiàn)[25-26]一致。

3 結(jié) 論

本文設(shè)計了一套液質(zhì)聯(lián)用接口，包括大氣壓接口和離子源，并制作了電子通訊接口，搭建了液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng),并對儀器的性能指標(biāo)進(jìn)行了測試。實(shí)驗結(jié)果表明，自行搭建的液質(zhì)聯(lián)用儀穩(wěn)定性良好，RSD為5.6%，相關(guān)系數(shù)為0.995 8，檢測范圍達(dá)3個數(shù)量級，LOQ為2 pg，LOD為0.5 pg。自行研發(fā)的液質(zhì)聯(lián)用接口可滿足應(yīng)用要求，搭建的液質(zhì)聯(lián)用儀在生物化學(xué)、醫(yī)藥分析、食品安全、環(huán)境檢測等領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用潛力。

[1] Gao J,Cheng X K,Ban L,Liu Y,Zhu S Q.Contemp.Chem.Res.(高佳,程曉昆,班璐,劉月,祝仕清.當(dāng)代化工研究),2016,5:86-87.

[2] Yang Y,Jiang A L.Chin.J.HealthLab.Technol.(楊陽,蔣愛玲.中國衛(wèi)生檢驗雜志),2003,(6):783-785.

[3] Bakhtiar R,Tse F L.RapidCommun.MassSpectrom.,2015,14(13):1128-1135.

[4] Zhang J Y,Qiao Y J,Zhang Q,Gao X Y,Lu J Q.Chin.J.Pharm.Anal.(張加余,喬延江,張倩,高曉燕,盧建秋.藥物分析雜志),2013,2:349-354.

[5] Liu F Y,Liu F Q,Xie Y C,Yu Y J.DrugStandardsofChina(劉福艷,劉福強(qiáng),謝元超,于英俊.中國藥品標(biāo)準(zhǔn)),2008,6:443-446.

[6] Meng F F,Tian B P,Zhang G Y,Wang Y B.OccupationandHealth(孟凡飛,田葆萍,張光友,王育兵.職業(yè)與健康),2014,16:2344-2345,2348.

[7] An R.Mod.Sci.Instrum.(安蓉.現(xiàn)代科學(xué)儀器),2003,1:20-23.

[8] Liu R X,Guo D A,Ye M,Wang Q,Zhang J L.WorldSci.Technol.(劉榮霞,果德安,葉敏,王巧,張金蘭.世界科學(xué)技術(shù)),2005,5:33-40,84.

[9] Liu X D，Liang Q L，Luo G A，Wang Y M.Chin.J.Pharm.Anal.(劉祥東,梁瓊麟,羅國安,王義明.藥物分析雜志),2005,1:110-116.

[10] Qi X C,Zhang H Y,Liang Q L,Wang Y M,Luo G A.Chin.Med.(齊小城,章弘揚(yáng),梁瓊麟,王義明,羅國安.中成藥),2009,1:106-112.

[11] Wang T.J.Agric.Catastrophol.(王緹.農(nóng)業(yè)災(zāi)害研究),2013,6:55-57.

[12] Zhang W J,Li M M,Zhang F.ShandongChem.Ind.(張文君,李敏敏,張鳳.山東化工),2014,11:121-122.

[13] Kim T,Udseth H R,Smith R D.Anal.Chem.,2000,72(20):5014-5019.

[14] Shaffer S A,Tang K,Anderson G A,Prior D C,Udseth H R,Smith R D.RapidCommun.MassSpectrom.,1997,11(16):1813-1817.

[15] Mo T,Hu F,Zhu H,Huang Z X,Guo C J,Gao W.J.Instrum.Anal.(莫婷,胡帆,朱輝,黃正旭,郭長娟,高偉.分析測試學(xué)報),2014,33(3):307-312.

[16] Mo T.ImproveandCharacterizeaDesktopTime-of-FlightMassSpectrometerwithAtmosphericPressureInterface.Shanghai：Shanghai University(莫婷.臺式大氣壓接口飛行時間質(zhì)譜儀的改進(jìn)及表征.上海：上海大學(xué)),2014.

[17] Gao W,Huang Z X,Guo C J,Nian H Q,Dong J G,Fu Z,Chen S D,Zhou Z.J.Chin.MassSpectrom.Soc.(高偉,黃正旭,郭長娟,粘慧青,董俊國,傅忠,陳少得,周振.質(zhì)譜學(xué)報),2008,4:209-212,217.

[18] Guo C J,Huang Z X,Gao W,Nian H Q,Zhou Z.Anal.Instrum.(郭長娟,黃正旭,高偉,粘慧青,周振.分析儀器),2007,2:17-21.

[19] Huang Z X.PrincipleandDesignofHighMassResolvingPowerTime-of-FlightMassSpectrometerwithOrthogonalExtraction.Guangzhou:Graduate University of Chinese Academy of Sciences(黃正旭.高分辨垂直引入式飛行時間質(zhì)譜儀原理及設(shè)計.廣州:中國科學(xué)院研究生院),2009.

[20] Zhu H,Guo C J,Zhang S F,Huang Z X,Gao W,Nian H Q,Fu Z,Zhou Z．J.Instrum.Anal.(朱輝,郭長娟,張紹飛,黃正旭,高偉,粘慧青,傅忠,周振.分析測試學(xué)報),2011,30(8):927-932.

[21] Ye Q L,Hu F,Sun N,Guo C J,Zhu H,Mo T,Huang Z X,Zhou Z.J.Instrum.Anal.(葉啟亮,胡帆,孫寧,郭長娟,朱輝,莫婷,黃正旭,周振.分析測試學(xué)報),2014,33(10):1166-1172.

[22] Qing J,Huang Z X,Zhang Y,Zhu H,Tan G B,Gao W,Yang P Y.Analyst,2013,138(12):3394-3401.

[23] Guo C J,Huang Z X,Gao W,Nian H Q．Eur.J.MassSpectrom.,2007,13:249-257.

[24] Papayannopoulos I A.MassSpectro.Rev.,1995,14(1):49-73.

[25] Li X Q,Lu Y,Wang T J,Yin G,Han D Q,Jiang K.ChinaMed.Herald.(黎雪清,魯藝,王鐵杰,殷果,韓東岐,江坤.中國醫(yī)藥導(dǎo)報),2015,12(6):86-90.

[26] Ling X,Xu Z M,Tan H J,Chen Q.Chin.J.Pharm.Anal.(凌霄,許竹梅,譚會潔,陳青.藥物分析雜志),2007,(12):1920-1923.

Development and Characterization of LC-MS Interface Technology

TIAN Qin-qin1,ZHU Hui2,HUANG Zheng-xu1,3*,HUANG Bao4,ZOU Xing4,LIN Li-quan4,LI Hui4,YIN Chen4

(1.Institute of Mass Spectrometry and Atmospheric Environment,Jinan University,Guangzhou 510632,China;2.Kunshan Hexin Mass Spectrometry Technology Co.,Ltd.,Kunshan 215300，China;3.Guangdong Provincial Engineering Research Center for On-line Source Apportionment System of Air Pollution,Guangzhou 510632,China;4.Guangzhou Hexin Instrument Co.,Ltd.,Guangzhou 510632,China)

A homemade LC-MS interface was developed.The interface included atmospheric interface,ion source and electronic communication interface which connected to high-performance liquid chromatography and mass spectrometry′s software.The team self-developed API-TOFMS 10000 was successfully linked to Thermo Fisher Scientific Diana U3000.Experimental results showed that the self-built LC-MS was operated with a good stability(RSD=5.6%),the linear correlation coefficient(r2) was 0.995 8,the detection range:2-2 000 pg,the limit of quantitation:2 pg,and the detection limit:0.5 pg.Piroxicam,theophylline and prednisone could be obviously detected.The experimental data showed that the self-developed LC-MS interface could meet the testing requirements,and the self-built LC-MS has an application potential in biochemistry,pharmaceutical analysis,food safety,environmental detection etc.

LC-MS;interface technology;atmospheric pressure interface;ion source

2017-06-19；

2017-09-06

廣州市產(chǎn)學(xué)研項目(201604010065)；廣州市產(chǎn)學(xué)研項目(201604040007)；廣州珠江新星項目(201710010005)資助

*

黃正旭，博士，副研究員，研究方向：質(zhì)譜儀器研究，Tel:020-85225991，E-mail:zx.huang@hxmass.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.12.010

O657.7；O657.63

A

1004-4957(2017)12-1476-05