高娜 任麗

圓錐角膜組織與正常角膜組織差異蛋白的表達(dá)

高娜1任麗2

目的運用比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),比較圓錐角膜組織和正常角膜組織的差異表達(dá)蛋白,篩選出圓錐角膜特異性分子標(biāo)記物,探討其與圓錐角膜發(fā)病機制的關(guān)系。方法收集12例圓錐角膜組織和4例正常人角膜組織,提取角膜組織總蛋白,行固相PH梯度雙向凝膠電泳,分析凝膠電泳圖譜,篩選差異表達(dá)蛋白,采用基質(zhì)輔助激光解吸離子化一串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜(MOLDI-TOF/TOF-MS)和數(shù)據(jù)庫檢索對差異蛋白質(zhì)進行鑒定。結(jié)果圓錐角膜組織和正常角膜組織的雙向電泳代表膠的蛋白點數(shù)分別為1035 和1070,匹配點數(shù)為869個,匹配率為84%。選取有明顯表達(dá)差異的7個蛋白質(zhì)點,其中6個蛋白質(zhì)點在圓錐角膜組織中表達(dá)下調(diào),1個蛋白質(zhì)點表達(dá)上調(diào)。這7 個蛋白質(zhì)點分別為轉(zhuǎn)化生長因子B誘導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)黏附蛋白(TGFBIp/βig-h3)、VI型膠原蛋白α1鏈前體(collagen alpha-1(VI)chain precursor)、αA-晶體蛋白(alpha-crystallin A)、βB-晶體蛋白(alpha-crystallin B)、βB2-晶體蛋白(beta-crystallin B2)、谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase)、碳酸酐酶(carbonic anhydrase),除VI型膠原蛋白α1鏈前體在圓錐角膜組織中表達(dá)上調(diào)外,其余6個蛋白成分在圓錐角膜組織中均表達(dá)下調(diào)。結(jié)論TGFBIp/βig-h3、alpha-crystallin A、alpha-crystallinB 、beta-crystallin B2、glutamine synthetase、collagen alpha-1(VI)chain precursor6種在圓錐角膜中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)成分可能與圓錐角膜發(fā)病相關(guān)。

圓錐角膜; 比較蛋白質(zhì)組學(xué); 基質(zhì)輔助激光解吸離子化一串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜(MOLDI-TOF/TOF-MS)

圓錐角膜(keratoconus)是一種以角膜擴張為特征,致角膜中央部向前呈圓 錐形凸起,及產(chǎn)生高度不規(guī)則近視散光和不同視力損害的原發(fā)性疾病。若病變持續(xù)發(fā)展,最終的結(jié)果是行角膜移植術(shù)。所以探明病因及發(fā)病機制,采取有效的控制手段,是防治圓錐角膜的根本。

圓錐角膜病因錯綜復(fù)雜,其發(fā)生是一個多因素、多基因及多途徑改變的過程。目前難以用一種理論來解釋所有的病例。以往的研究大多在基因水平或者是對某些特定的分子做相應(yīng)分析,從而推測圓錐角膜可能的發(fā)病機理,其局限性在于DNA或RNA水平的改變并不能完全 反應(yīng)蛋白質(zhì)水平的變化(如信使RNA與蛋白質(zhì)兩者的相關(guān)系數(shù)大約在0.4～0.5之間)或者只能反應(yīng)疾病的部分特征,若能從蛋白質(zhì)整體水平直接入手來研究圓錐角膜,并與圓錐角膜基因組、轉(zhuǎn)錄組等方面的研究結(jié)果相互整合、互相驗證,無疑將更加全面而真實地揭示圓錐角膜發(fā)病的本質(zhì),也將為圓錐角膜的病因發(fā)病學(xué)、診斷和防治開辟新的思路、提供新的線索。蛋白質(zhì)組學(xué)為我們提供了新的方法和思路。蛋白質(zhì)組學(xué)的研究主要包括以下三個方面:(1)蛋白質(zhì)的大規(guī)模鑒定和轉(zhuǎn)錄后修飾的微特征研究;(2)比較蛋白質(zhì)組學(xué),比較疾病與正常狀態(tài)下蛋白質(zhì)表達(dá)的差異,為疾病的診斷尋找生物學(xué)標(biāo)志;(3)通過各種技術(shù),如質(zhì)譜技術(shù)和酵母雙雜交體系對蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)間相互作用的研究,并繪制蛋白質(zhì)作用的圖譜。在與臨床的結(jié)合應(yīng)用中最常用的是比較蛋白質(zhì)組學(xué),通過生理和病理條件下(如疾病狀態(tài)或疾病的不同發(fā)展階段)蛋白質(zhì)組各成員表達(dá)水平、翻譯后修飾等情況進行比較研究,發(fā)現(xiàn)和鑒定出有特征性的蛋白質(zhì),從而為疾病的發(fā)病機制,診斷及治療的研究提供理論依據(jù)。

基于以上認(rèn)識,為了闡明圓錐角膜的發(fā)病機制和建立有效的治療和預(yù)防方法,本研究應(yīng)用固相PH梯度雙向凝膠電泳技術(shù)分離圓錐角膜病變組織及正常角膜組織的總蛋白質(zhì),建立雙向電泳圖譜,并用基質(zhì)輔助激光解吸離子化一串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜(MOLDI-TOF/TOF-MS)分析和數(shù)據(jù)庫檢索對差異蛋白質(zhì)進行鑒定,以期篩選出圓錐角膜的特異分子標(biāo)志物,為圓錐角膜發(fā)病機制的闡明提供新的方法和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

12例圓錐角膜組織來源于行部分穿透性角膜移植手術(shù)的16～26歲圓錐角膜患者,患者術(shù)前完善輔助檢查,排除全身結(jié)締組織性疾病及其他全身性疾病,術(shù)中選用7.0～7.75mm大小環(huán)鉆鉆取病變角膜組織,術(shù)后均取部分病變組織經(jīng)中山眼科中心病理室確診。4例正常角膜組織由眼庫提供。直徑為10～12mm,尸眼均于死亡后4～16小時取材。將收集好的角膜組織置于 eppendorf tube中,-80°C冰箱深低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 組織總蛋白提取-80℃

將收集的圓錐角膜組織隨機分為4組,每組3例,分別編號為l、2、3、4組,正常角膜組織一例為一組,分別編號為5、6、7、8組。采用眼科顯微角膜剪于冰上充分剪碎角膜組織,將各組角膜組織碎片分別收集于預(yù)冷的EP管中,按照l: 3體積比例加入裂解緩沖液充分混勻后,采用組織勻漿機冰上勻漿,勻漿強度選 用3.5級,每次勻漿8秒,間隔30秒后重復(fù)勻漿,共3次;勻漿結(jié)束后用封口膠將 EP管封口,置于液氮中2min,再于37°C水域中復(fù)溫、解凍,反復(fù)3次。最后用低 溫高速離心機4°C150009/min離心60min,小心吸取上清,即為組織總蛋白質(zhì),按照不同用量分裝,置于一80°C冰箱中待用。

1.3 固相pH梯度雙向凝膠電泳

2-DE方法主要參考文獻(xiàn)和Bio-Rad儀器操作手冊進行。

凝膠通過IIIlage Scanner II透射掃描儀及Labscan掃描軟件進行掃描獲取圖像,利用ImageMaster 2D Elite 5.0分析軟件對圖像進行強度效正、點檢測、背景消減及匹配等。比較對應(yīng)蛋白點表達(dá)豐度,獲得差異蛋白點的缺失、出現(xiàn)及表達(dá)量的變化等信息,選取有明顯差異的蛋白點進行質(zhì)譜分析。

1.4 質(zhì)譜檢查

沿邊緣切取凝膠上的差異蛋白斑點,經(jīng)水洗、脫色、膠內(nèi)酶切等步驟后采用美國ABI公司的4700 TOF-TOT質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜分析。

1.5 數(shù)據(jù)庫檢索

利用軟件Mascot distiller過濾基線峰、識別信號峰。利用Matrixscience公司的Mascot軟件搜索NCBInr數(shù)據(jù)庫(http://www.matrixscience.com),尋找匹配的相關(guān)蛋白質(zhì),同時查詢其功能,來明確鑒定的蛋白質(zhì)為何種蛋白質(zhì)。

2 結(jié)果

2.1 雙向電泳圖像的分析

利用ImageMaSter 2D Elite 5.0分析軟件分析對圓錐角膜和正常角膜組織的兩張代表膠圖譜進行分析匹配,發(fā)現(xiàn)其蛋白點數(shù)分別為1035和1070,匹配點數(shù)為869個,匹配率為84%。通過對二者的凝膠圖譜分析,根據(jù)以下幾個條件篩選出7個明顯的差異蛋白點進行質(zhì)譜鑒定:1)在圖像分析軟件中蛋白點的灰度差異在兩倍以上,并可人工識別;2)相同組織重復(fù)兩次凝膠電泳,在兩張圖譜都出現(xiàn)相同差異的蛋白點;3)至少在50%的相同類型的角膜組織的凝膠圖譜中出現(xiàn);4)位于圖譜下方的小分子量的蛋白點忽略不計,因為這些很可能為降解的蛋白片段。圖1-1和圖1-2分別是圓錐角膜組織和正常角膜組織的代表性雙向凝膠電泳圖譜,圖中以“↖□”標(biāo)記的為差異蛋白質(zhì)。為了清晰顯示蛋白質(zhì)斑點的匹配和差異表達(dá)情況,我們以A3蛋白斑點為例,進行局部放大顯示。圖2為A3的局部放大圖。

圖1-1 圓錐角膜組織雙向凝膠電泳圖譜(pH 5～8,上樣量230μg)

圖1-2 正常人角膜組織雙向凝膠電泳圖譜(pH 5～8,上樣量230μg)

圖2 左側(cè)為圓錐角膜組織凝膠電泳蛋白質(zhì)A3的局部放大圖,右側(cè)為正常角膜組織的A3放大圖

2.2 質(zhì)譜分析結(jié)果

利用ImageMaster 2D Elite 5.0分析軟件對圓錐角膜和正常角膜組織的凝膠電泳圖譜進行分析匹配,篩選出7個明顯的差異蛋白點,其中有6個蛋白成分在圓錐角膜組織中表達(dá)下調(diào),1個蛋白成份表達(dá)上調(diào),分別進行 MALDI-ToF/ToF-Ms質(zhì)譜分析,獲得蛋白質(zhì)點的肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)及二級質(zhì)譜圖。最后利用Mascot軟件搜索NcBInr數(shù)據(jù)庫尋找匹配的相關(guān)蛋白質(zhì)信息,7個蛋白質(zhì)點均鑒定成功,其中6個在圓錐角膜中低表達(dá)的蛋白質(zhì)成分包括TGFBIp/βig-h3、alpha-crystallin A、alpha-crystallinB 、beta-crystallin B2、glutamine synthetase、carbonic anhydrase,1個在圓錐角膜中高表達(dá)的蛋白質(zhì)成分為collagen alpha-1(VI)chain precursor。各蛋白點的質(zhì)譜分析見表1。

3 討論

本實驗將圓錐角膜組織和正常角膜組織的蛋白質(zhì)表達(dá)進行對比分析研究,發(fā)現(xiàn)了TGFBIp等幾種可能與圓錐角膜發(fā)病相關(guān)的差異蛋白質(zhì),研究所利用的是蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)中的比較蛋白質(zhì)組學(xué)策略。比較蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)路線首先用雙向凝膠電泳技術(shù)分離復(fù)雜的蛋白質(zhì)組分,并用專門的計算機軟件對雙向凝膠電泳結(jié)果進行數(shù)據(jù)采集和圖像分析,然后采用氨基酸組成分析、微量蛋白質(zhì)測序、質(zhì)譜分析等技術(shù)將從凝膠上采集的蛋白質(zhì)作進一步的鑒定,結(jié)合相關(guān)的數(shù)據(jù)庫檢索,獲取有關(guān)蛋白質(zhì)的性質(zhì)、表達(dá)變化和翻譯后的修飾加工等多方面的大量信息,建立蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫,通過生理和病理條件下(如疾病狀態(tài)或疾病不同發(fā)展階段)蛋白質(zhì)組各成員表達(dá)水平、翻譯后的修飾加工以及亞細(xì)胞定位等情況的比較研究,發(fā)現(xiàn)和鑒定出有特征性的蛋白質(zhì)(群),為疾病的發(fā)病機理研究、診斷和治療提供線索。

對于圓錐角膜的蛋白質(zhì)組學(xué)研究,目前國際國內(nèi)上已經(jīng)開展了部分工作。1989年Noorjuahan[1]及其同事利用雙向電泳技術(shù)分析圓錐角膜與正常角膜差異表達(dá)蛋白,發(fā)現(xiàn)在圓錐角膜組織的凝膠電泳圖譜中有兩個異常蛋白成分表達(dá)(分子量分別為54KD、26KD),有三個正常的角膜蛋白成分(分子量分別為12KD、 14KD、39KD)出現(xiàn)高表達(dá),同時還有三個正常角膜蛋白成分(分子量分別為 66KD、55l1、13KD)表達(dá)減少或者不表達(dá)。但是這部分研究結(jié)果沒有做進一步的蛋白質(zhì)譜分析,所以不能得出這些差異蛋白的確切成分。通過對比蛋白分子量及蛋白等電點,Noorjuahan等發(fā)現(xiàn)其中一個低表達(dá)的正常角膜蛋白成分與脯氨酰-4-羥化酶的亞基十分相似,而該酶正是膠原脯氨酸殘基羥基化所必需的酶類;另外,Noorjuahan推測某些正常角膜蛋白成分由于異常的翻譯后修飾作用如過度糖基化等,成為研究中所出現(xiàn)的異常表達(dá)蛋白質(zhì)。后續(xù)的研究選擇角膜的某些成分進行蛋白質(zhì)組學(xué)研究。如Nielsen等[2]選擇近視眼患者的角膜上皮細(xì)胞作為對照組尋找圓錐角膜上皮細(xì)胞中的差異蛋白,通過Melanie II分析軟件及質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn),有十幾個差異蛋白表達(dá),包括cytokeratin 3,gelsolin,S100A4以及 enolase-1等。Nielsen認(rèn)為這些蛋白可能參與了圓錐角膜的發(fā)病過程。Srivastava等[3]也對圓錐角膜的上皮細(xì)胞進行蛋白質(zhì)組學(xué)分析,他們選用正常角膜組織上皮細(xì)胞為對照組,采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)及免疫組織化學(xué)方法分析后發(fā)現(xiàn)α-enolase和β-actin兩種蛋白在圓錐角膜組織的翼狀細(xì)胞層及表面細(xì)胞層中呈低表達(dá)或不表達(dá),Srivastava認(rèn)為這與圓錐角膜中這兩種蛋白的降解增強有關(guān)。

表1差異蛋白質(zhì)點質(zhì)譜檢索結(jié)果

目前對圓錐角膜全層組織的總蛋白進行差異蛋白篩選和質(zhì)譜分析的蛋白質(zhì) 組學(xué)研究還未見報道。為了更加真實揭示圓錐角膜的蛋白表達(dá)狀況、識別鑒定與其發(fā)病密切相關(guān)的差異蛋白質(zhì),本實驗以正常角膜組織為對照組,提取角膜組織的總蛋白質(zhì),采用蛋白質(zhì)組學(xué)圖像分析軟件分析圓錐角膜組織與對照組的雙向電泳凝膠圖譜,篩選出兩者間的差異表達(dá)蛋白,利用MALDI/TOF-TOF/MS鑒定,共獲得7張蛋白質(zhì)點的肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF),為進一步的研究提供條件。

在本研究中,對組織標(biāo)本的收集、組織總蛋白質(zhì)的提取以及雙向凝膠電泳總蛋白質(zhì)的上樣量進行了最優(yōu)條件的摸索,結(jié)果顯示,選擇PH值寬度為5-8的17cm非線性口G膠條,采用硝酸銀染色方法,總蛋白上樣量以230 u g為佳,從而建立了重復(fù)性較好的人角膜組織的雙向凝膠電泳圖譜。質(zhì)譜技術(shù)作為蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)平臺的支撐技術(shù)之一,因其可靠性直接影響到整個研究的可信性,所以質(zhì)譜技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)實驗中具有非常重要的地位,故選擇高效、可靠、穩(wěn)定的質(zhì)譜分析儀十分必要。

在圓錐角膜與正常角膜組織的比較分析中,我們發(fā)現(xiàn)6種可能與圓錐角膜發(fā)病相關(guān)的蛋白質(zhì),包括TGFBIp/βig-h3、collagen alpha-1(VI)chain precursor、alpha-crystallin A、beta-crystallin B2、alpha-crystallinB 、glutamine synthetase、這些蛋白成分有些參與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附,有些影響膠原的穩(wěn)定性和成熟性,有些參與細(xì)胞的氧化應(yīng)激等,為此還需進行更為詳細(xì)的探討。

[1] Noorjahan P,Jim D,Brian C,etal.Protein-related abnormalities in keratoconus.Invest Ophthalmol Vis Sci,1989,30:2481-2487.

[2] Nielsen K,Henrik V,Fagerholm P,etal.Proteome profiling of corneal epithelium and identification of marker protein for keratoconus,a pilot study.Exp Eye Res,2006,82(2):201-209.

[3] Srivastava OP,Chandrasekaran D,Pfister RR.Molecular changes in selected epithelial protein in human keratoconus comes compared to nornal corneas.Mol Vis,2006,12:1615-1625.

Initialstudyofproteinsdifferentiallyexpressedinhumankeratoconuscorneascomparedtonormalcorneas

GAONa1,RENLi2

(TeachingHospitalofChengduUniversityofTCM/ClinicalMedicalCollege,ChengduUniversityofTCM,Chengdu,Sichuan,610075;2.ChengduUniversityofTCM,Chengdu,Sichuan,610075)

ObjectiveThe proteins differentially expressed in keratoconus and normal corneas was analyzed by comparative proteomine technology,and then identify protein markers that may be specific to the disease.Methods12 human keratoconus buttons and 4 normal human central human corneas were collected.Cornea proteins were separeted on immobilized pH gradient-based two dimension electrophoresis SDS polyacrylamide gels and silver stained,spots were defined and quantified.Differentially expressend protein spots were then identified by matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry(MALDI-TOF/TOF-MS)and databese searching.ResultsSeven differentially expressed proteins were identified by MALDI-TOF/TOF-MS,peptide mass fingerprint(PMF)and MS/MS maps were obtained.The proteins successfully identified were TGFBIp/βig-h3、collagen alpha-1(VI)chainprecursor、alpha-crystallin A、beta-crystallin B2、alpha-crystallinB 、glutamine synthetase、carbonic anhydrase.All of them were down-regulation in keratoconus except collagen alpha-1(VI)chain precursor.ConclusionTGFBIp/βig-h3、alpha-crystallin A、alpha-crystallinB 、beta-crystallin B2、glutamine synthetase、collagen alpha-1(VI)chain precursor were identified to be differentially expressed in keratoconus compared to normal corneas and thus may be involved in the pathogenesis.

Keratoconus; Comparativeproteomics; MALDI-TOF/TOF-MS

1.610075,四川成都，成都中醫(yī)藥大學(xué)/附屬醫(yī)院；2.610075，四川成都，成都中醫(yī)藥大學(xué)

任麗,E-mail:jnl.scrhi@163.com

10.3969/j.issn.1674-9006.2017.04.002

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