李翔 柯欣怡,2 劉紅佶 袁銘悅 李祥玉 李華宏 王泰 田夢瑤 楊鳳嬌

補(bǔ)精益視片對SD大鼠慢性高眼壓模型外側(cè)膝狀體腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)的影響

李翔1柯欣怡1,2劉紅佶3袁銘悅3李祥玉3李華宏3王泰3田夢瑤3楊鳳嬌3

目的觀察補(bǔ)精益視片對慢性高眼壓模型(elevated intraocular pressure,EIOP)大鼠外側(cè)膝狀體中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)表達(dá)的影響,探討補(bǔ)精益視片視功能保護(hù)的作用機(jī)理。方法選取30只SD大鼠,隨機(jī)分為對照組、給藥組及模型組,每組各10只。采用烙閉鞏膜上靜脈方法制作慢性高眼壓大鼠動物模型,每組連續(xù)灌胃8周后處死大鼠,觀察補(bǔ)精益視片對EIOP大鼠眼壓、外側(cè)膝狀體(lateral geniculate nucleus,LGN)BDNF表達(dá)的影響。結(jié)果 相比造模前,從造模即刻開始至造模后8周,給藥組及模型組大鼠的眼壓均有明顯升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)；造模后8周與造模即刻相比,給藥組眼壓有降低趨勢,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),而模型組眼壓無降低趨勢；模型組BDNF總面積(55863.31±10264.399 S/μm2)及積分光密度(15931.84±3403.742)較對照組(114106.08±17849.482 S/μm2,29209.88±5725.992)及給藥組(97567.06±22224.041 S/μm2,29199.65±7865.087)明顯偏低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01),給藥組BDNF總面積及積分光密度較對照組稍偏低,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論補(bǔ)精益視片能補(bǔ)精益視片能促進(jìn)慢性EIOP模型大鼠LGN中BDNF的表達(dá),從而發(fā)揮視功能保護(hù)作用。

青光眼； 補(bǔ)精益視片； 視功能保護(hù)； 大鼠慢性高眼壓模型； 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子； 外側(cè)膝狀體

青光眼是一類以視神經(jīng)萎縮和進(jìn)行性視野缺損為共同特征的眼病,是目前世界第一位的不可逆性致盲眼病,發(fā)病率和致盲率在世界范圍內(nèi)都在不斷上升[1]。根據(jù)世界各地流行病學(xué)統(tǒng)計資料估算,2020年全球患者將上升至7960萬,雙眼失明人數(shù)也隨之上升為1120萬,病史在16 年以上青光眼患者至少有一眼盲的概率約為28.6%,而2020年中國的青光眼患者人數(shù)將達(dá)到600萬[2]。很多青光眼患者早期發(fā)病隱匿,發(fā)現(xiàn)時已有嚴(yán)重視功能損害。青光眼作為一種不可逆致盲眼病嚴(yán)重影響了人類的生存質(zhì)量,做好青光眼理論研究、診斷及治療工作具有重大意義。

本實驗通過烙閉上鞏膜靜脈的方法[3]誘導(dǎo)產(chǎn)生眼壓維持穩(wěn)定、持續(xù)時間較長的慢性高眼壓(elevated intraocular pressure,EIOP)動物模型,選取補(bǔ)精益視片作為干預(yù)藥物,通過觀察其對EIOP大鼠外側(cè)膝狀體中BDNF含量的影響來探討補(bǔ)精益視片視功能保護(hù)的作用機(jī)理,為補(bǔ)精益視片在青光眼治療的臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

1.1.1實驗動物 選取健康清潔級Sprague-Dawley(SD)大鼠,雌雄不受限,8～12周齡,體重約160～200g,并在裂隙燈下檢查見眼前節(jié)無異常,瞳孔對光反射正常,眼壓測定正常,無歪頸者共30只。飼養(yǎng)室溫20～25℃,空氣流通,相對濕度55%～75%,12小時光照維持,晝夜循環(huán)。自由攝食飲水。

1.1.2分組

以SPSS統(tǒng)計軟件產(chǎn)生隨機(jī)數(shù)字,將大鼠分為3組:給藥組、對照組及模型組,每組各10只。

1.2 藥品與試劑

補(bǔ)精益視片(批號20130215)購于成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。BDNF 多克隆抗體,購于博士德生物工程有限公司。FFA固定液,由成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院病理科提供。

1.3 實驗方法

1.3.1造模方法

選擇烙閉鞏膜上靜脈的方法進(jìn)行造模:模型組與給藥組在眼科手術(shù)顯微鏡下烙閉右眼上鞏膜靜脈進(jìn)行造模處理,對照組暴露鞏膜上靜脈后未行上鞏膜靜脈熱處理,為假烙閉。均對其右眼進(jìn)行處理,左眼不做處理。

1.3.2給藥方法

每天在16:00～18:00之間給大鼠進(jìn)行灌胃,連續(xù)灌胃8周.對照組、模型組每天予3ml生理鹽水灌胃。將補(bǔ)精益視片磨成粉狀,加入生理鹽水,每18g配置成100ml混懸液,濃度為0.18g/ml,給藥組混懸液灌胃1.8g/kg.d。實驗中,根據(jù)大鼠體重選取混懸液劑量,每只大鼠每天灌胃總量3ml,所需混懸液劑量不足3ml的用生理鹽水補(bǔ)足。每2周稱體重1次,根據(jù)大鼠體重調(diào)整給藥量。實驗過程中動物死亡7只。

1.3.3檢測指標(biāo)及方法

1.3.3.1眼壓測量

采用TONO-PEN筆試眼壓計每日固定時間進(jìn)行眼壓測量。分別測量3組大鼠造模前、造模后即刻、造模后2周、造模后4周、造模后6周、造模后8周右眼的IOP。

1.3.3.2尼氏小體含量的測定

(1)取材及固定:給藥8周后處死大鼠,方法使用頸椎脫臼法。在顯微鏡下完整剝出大鼠腦組織,將剝下的腦組織置于固定液中固定72小時后,參照大鼠腦組織解剖圖譜,按大鼠中樞神經(jīng)解剖定位,根據(jù)鄰近核團(tuán)形狀判斷,切取LGN,梯度脫水、透明、浸蠟、包埋,常規(guī)切片4um,烘干備用。(2)免疫組化檢測LGN內(nèi)BDNF的表達(dá)水平:所用抗體為大鼠 BDNF 多克隆抗體。石蠟切片脫蠟,蒸餾水沖洗,滴加一抗,37 ℃孵育1～2 h； PBS 沖洗,滴加二抗,37℃孵育10～30 min,PBS沖洗；顯色劑顯色,充分沖洗復(fù)染封片。陽性結(jié)果判定:反應(yīng)部位產(chǎn)生棕黃色沉淀物,位于神經(jīng)元周圍。半定量分析:BDNF 染色的組織內(nèi)出現(xiàn)細(xì)顆粒狀、細(xì)絲狀棕黃色著色為BDNF 陽性染色。每張切片隨機(jī)選5個視野,每組共30個視野,用Mias-2000型圖形圖像分析儀測量LGN部位BDNF陽性染色灰度,取每個視野均值代表該切片的測量值,表示BDNF的表達(dá)強(qiáng)度。

1.4 統(tǒng)計方法

2 實驗結(jié)果

2.1 眼壓

各組大鼠造模前后及組間眼壓比較見表1。由表1可見,造模前比較各組之間IOP,差異無統(tǒng)計學(xué)差異(均為P>0.05)。造模后即刻,對照組IOP較造模前略有升高,但前后比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；給藥組、模型組IOP較造模前升高明顯,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；造模后即刻,給藥組、模型組與對照組IOP相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。造模后8周,給藥組及模型組IOP與造模前相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；造模后8周,與造模后即刻相比,給藥組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 補(bǔ)精益視片對慢性EIOP大鼠外側(cè)膝狀體BDNF表達(dá)的影響

結(jié)果見表2,圖1-3。由表2可見:各組以對照組BDNF總面積和積分光密度最高；給藥組BDNF總面積和積分光密度相較對照組稍有偏低,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.01)；模型組BDNF總面積和積分光密度相較對照組及給藥組均明顯偏低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表1 各組大鼠組間及造模、用藥前后眼壓比較(單位:mmHg)

注：與對照組相比,▲P<0.01；與給藥組相比,★P<0.01

表2 每組大鼠LNG BDNF比較

注：與對照組相比,▲P<0.01；與給藥組相比,★P<0.01

圖1 對照組LGN BDNF染色圖(×200) 圖2 模型組LGN BDNF染色圖(×200) 圖3 給藥組LGN BDNF染色圖(×200)

3 討論

作為目前世界第一位的不可逆性致盲眼病,青光眼的發(fā)病機(jī)制仍在進(jìn)一步研究中。正常視覺的形成主要與視網(wǎng)膜、外側(cè)膝狀體(lateral geniculate nucleus,LGN)、視皮質(zhì)有關(guān)。視路中各級神經(jīng)元對視功能的維持都有重要作用。青光眼的視功能障礙是從視網(wǎng)膜到中樞視覺系統(tǒng)廣泛區(qū)域發(fā)生損傷的過程,青光眼的神經(jīng)損害包括了整個視路,青光眼是一種中樞神經(jīng)退行變性疾病[4]。神經(jīng)退行性病變的特征是跨神經(jīng)元變性[5],視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells,RGCs)的死亡對LGN、視皮質(zhì)等產(chǎn)生影響,損傷的LGN、視皮質(zhì)等又反過來對殘存的RGCs產(chǎn)生影響。中樞視覺系統(tǒng)的損害不僅僅作為一種結(jié)果,還在青光眼視功能損傷的進(jìn)展中起了重要作用。故僅僅將將眼壓控制到安全水平并不能完全阻止青光眼的繼續(xù)進(jìn)展[6],青光眼的治療還應(yīng)針對繼發(fā)性損害對視功能進(jìn)行保護(hù)。青光眼的視功能保護(hù)已成為青光眼研究的熱點難點問題。作為視路上直接接受視神經(jīng)纖維投射的重要中轉(zhuǎn)核團(tuán),外側(cè)膝狀體在中樞視覺系統(tǒng)損傷研究中倍受關(guān)注。BDNF是一種小分子量的堿性蛋白,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要在神經(jīng)元內(nèi)合成,是一種具有代表性的神經(jīng)營養(yǎng)因子在視覺系統(tǒng)中,BDNF是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞賴以生存的主要神經(jīng)營養(yǎng)因子之一,目前已廣泛認(rèn)同腦源性神經(jīng)生長因子的剝奪是RGCs凋亡的誘發(fā)因素[7]。當(dāng)視神經(jīng)損傷后,RGCs本身存在的保護(hù)性反應(yīng)表現(xiàn)之一就是BDNF及其受體的表達(dá)增高。BDNF對青光眼視功能保護(hù)的研究具有重大意義。所以,選擇LGN 部位的BDNF的表達(dá)作為觀察指標(biāo)對說明視功能保護(hù)的機(jī)理具有一定的作用。

青光眼屬中醫(yī)“五風(fēng)內(nèi)障”范疇,其視功能損害導(dǎo)致的特異性視神經(jīng)萎縮和視野缺損類似于“青盲”,主要病機(jī)是肝腎虛損、脈絡(luò)瘀滯,滋養(yǎng)肝腎、活血通絡(luò)是防治青光眼視功能損害的基本方法。以往的研究也證實補(bǔ)腎活血法(杞菊地黃丸和復(fù)方丹參片合用)對SD大鼠慢性EIOP模型視網(wǎng)膜、視神經(jīng)、視中樞損傷及眼壓控制后青光眼視功能均有一定的保護(hù)作用[8-12]。以滋養(yǎng)肝腎、活血化瘀為主要功效的補(bǔ)精益視片(原名益視片)已在視功能的保護(hù)及改善方面取得了良好療效[13]。

本實驗通過觀察慢性EIOP 大鼠LGN 部位BDNF的表達(dá),進(jìn)一步探討補(bǔ)腎活血中藥補(bǔ)精益視片對青光眼視功能保護(hù)的作用機(jī)理。結(jié)果表明:慢性高眼壓模型會造成LGN BDNF表達(dá)的減少,使用補(bǔ)精益視片提高了慢性高眼壓模型BDNF表達(dá)。在慢性高眼壓的影響下,外側(cè)膝狀體 BDNF的表達(dá)明顯減少,而BDNF是RGCs賴以生存的主要神經(jīng)營養(yǎng)因子之一,LGN BDNF表達(dá)的減少會削弱對視覺通路中的下級神經(jīng)元的下行營養(yǎng)支持而加重RGCs的病變,這即前所言跨神經(jīng)元變性的病理循環(huán)。實驗結(jié)果提示補(bǔ)精益視片通過提高慢性高眼壓模型BDNF表達(dá),一方面增強(qiáng)LGN細(xì)胞的存活能力,減少死亡,另一方面改善了對下級神經(jīng)元的下行營養(yǎng)支持,從而發(fā)揮其治療作用。實驗結(jié)果表明,補(bǔ)精益視片可作為臨床青光眼視神經(jīng)保護(hù)藥物推廣應(yīng)用。

[1] Wang Y X,Xu L,Yang H,et al.Prevalence of glaucoma in North China:the Beijing Eye Study [J].Am J Ophthalmol,2010,150(6):917-924.

[2] Quigley H A,Broman A T.The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020 [J].Br.J.Ophthalmology,2006,90(3):262-267.

[3] Akira S,Neufeld AH．Confirmation of the rat model of chronic,moderately elevated intraocular pressure[J].Exp Eye Res,1999,69(5):525-531.

[4] Gupta N,Yucel YH.Glaucoma and the brain.J Glaucoma,2001;10(l1):S28-29 .

[5] Timothy M.Woods,Catherine G.Cusick,Tim P.Pons,Edward Taub,and Edward G.Jones.Progressive Transneuronal Changes in the Brainstem and Thalamus after Long-Term Dorsal Rhizotomies in Adult Macaque Monkeys[J].The Journal of Neuroscience.2000,20(10):3884-3899.

[6] Parc CE,Johnson DH,Oliver JE,et al.The long-term outcome of glaucoma filtration surgery[J].Am J Oph-thalmol,2001,108(3).956-959.

[7] Osbrone NN:et al.Ganglion cell death in glaueoma:what do we really know?[J].B.J.Oph .1999,83(8):980-986.

[8] 毛欣,李翔．補(bǔ)腎活血中藥對慢性高眼壓模型大鼠視功能損害的干預(yù)作用[J]．國際眼科雜志,2010,10(2):238-240．

[9] 李翔,文曉霞,張敏,等．中藥聯(lián)合甲鈷胺片治療眼壓控制后青光眼的HRT-Ⅱ觀察[J]．中國實用眼科雜志,2010,28(5):515-517.

[10] 李翔,謝釗,郭紅建,等．補(bǔ)腎活血中藥對大鼠慢性高眼壓模型外側(cè)膝狀體病理改變的影響[J]．眼科新進(jìn)展,2012,32(1):20-23．

[11] 李翔,謝釗,郭紅建,等．補(bǔ)腎活血中藥對大鼠慢性高眼壓模型外側(cè)膝狀體腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子改變的影響[J]．眼科新進(jìn)展,2012,32(10):18-21.

[12] Xiang LI,Hong-Jian Guo,Xiao-Xia Wen,et al.Influence of BuShenHuoXue on primary visual cortex’s Nissl bodies damage in rat model of chronic elevated intraocular pressure[J].Int Eye Sci,2012,12 (12):2256-2260.

[13] 汪輝,汪娟,張玲．補(bǔ)精益視片對孔源性視網(wǎng)膜脫離復(fù)位術(shù)后視功能的影響[J]．成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2011,34(2):23-24.

EffectsofBuJingYiShitabletsonexpressionofbrain-derivedneurotrophinfactorinlateralgeniculateinratmodelofchronicelevatedintraocularpressure

LIXiang1,KEXin-yi1,2,LIUHong-ji3,YUANMing-yue3,LiXiang-yu3,LIHua-hong3,WANGTai3,TIANMeng-yao3,YANGFeng-jiao3

(1.DepartmentofOphthalmology,TheTeachingHospitalofChengduUniversityofTCM,Chengdu,Sichuan,610072;2.LongquanyiDistrictHospitalofTraditionalChineseMedicial,Chengdu,Sichuan,610100 ;3.ChengduUniversityofTCM,Chengdu,Sichuan,610075)

ObjectiveTo observe the effect of BuJingYiShi tablets on the expression of brain-derived neurotrophic factor(BDNF) in lateral geniculate nucleus(LGN) in rat model of chronic elevated intraocular pressure (EIOP),and explore the mechanism of it initially．MethodsThe rats were randomly divided into 3 groups:control group,model group and treatment group,10 rats in each group.The model of chronic EIOP was established by unilaterally cauterizing 3 episcleral vessels.After given BuJingYiShi tablets and normal saline for 8 weeks,killed the rats and taken out the brains.IOP,expression of brain-derived neurotrophic factor in lateral geniculate nucleus(LGN)were observed.ResultsImmediately modeling and 8 weeks after-modeling,IOP were highly significant different from before modeling(allP<0.01).there was a decreasing tendency in treatment group between 8 weeks after-modeling and immediately modeling (P<0.01).While model group was not statistically significant(P>0.05).The total area(55863.31±10264.399 S/μm2)and integrated optical density (15931.84±3403.742)of BDNF in model groups were lower than treatment group(114106.08±17849.482 S/μm2,29209.88±5725.992)and control group(97567.06±22224.041 S/μm2,29199.65±7865.087)(allP<0.01);Though total area and integrated optical density in treatment group were little lower than control group,there was no significant difference in statistics(P>0.05 ).ConclusionBuJingYiShi tablets can protect the visual function on the rat model of chronic EIOP by improving the expression of BDNF.

Glaucoma; BuJingYiShi tablets; Optic neuroprotection; The rat model of chronic elevated intraocular pressure; Brain-derived neurotrophic factor; Lateral geniculate nucleus

1.610072,四川成都,成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院；2.610100,四川成都,龍泉驛區(qū)中醫(yī)醫(yī)院；3.610075,四川成都,成都中醫(yī)藥大學(xué)

李翔,教授,E-mail:jeannelxiang@126.com

10.3969/j.issn.1674-9006.2017.04.005

R77