盧云 梁江 邰灣 周靜 黃維琛 徐宇
基于GCBI平臺(tái)骨關(guān)節(jié)炎芯片數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析
盧云 梁江 邰灣 周靜 黃維琛 徐宇
目的從已知的GCBI公共基因芯片分析平臺(tái)著手初步探索骨關(guān)節(jié)炎的機(jī)制,尋找該病的關(guān)鍵性靶點(diǎn)基因,為今后的研究和治療指明方向。方法從公共基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)GEO(Gene Expression Omnibus)選取GCBI平臺(tái)支持后期處理分析的人類(lèi)骨關(guān)節(jié)炎組織全基因組RNA芯片(樣本為OA患者和正常人的滑膜及軟骨組織),下載芯片數(shù)據(jù),利用 GCBI 在線實(shí)驗(yàn)室篩選出骨關(guān)節(jié)炎差異基因,分別對(duì)差異基因進(jìn)行 GO 富集分析、KEGG通路分析以及參與生物功能的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析。結(jié)果從符合研究納入條件的5 個(gè)基因表達(dá)芯片數(shù)據(jù)集最終得到648個(gè)差異性基因,查到PRKCA、ITGB3、PLCB1、ADCY4、PIK3R3、 NRAS 、ITPR1等7個(gè)功能性蛋白在OA疾病發(fā)展進(jìn)程中意義重大,PI3K-AKT、MAPK 信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、粘附相關(guān)通路、Wnt通路、P53通路,VEGF通路共9條通路與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病密切相關(guān)。結(jié)論利用生物信息學(xué)有助于分析骨關(guān)節(jié)炎基因芯片數(shù)據(jù),探索參與OA進(jìn)程的核心蛋白和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,為探索治療靶點(diǎn)和發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。
骨關(guān)節(jié)炎; 基因芯片; 生物信息分析; 滑膜; 軟骨
骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是以一種常見(jiàn)慢性退行性疾病,可引起受累關(guān)節(jié)疼痛、活動(dòng)受限并最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能障礙,據(jù)我國(guó)流行病學(xué)研究報(bào)道,中國(guó)人大于 40 歲的人群中,OA整體患病率約 46.3%[1],國(guó)外研究顯示,OA 患者的全球傷殘調(diào)整生命年在非傳染疾病中位居前十[2],既往觀點(diǎn)認(rèn)為該病病理特征以關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行性退變?yōu)橹?包含軟骨細(xì)胞凋亡、軟骨下骨重建、骨贅形成),但近年來(lái)發(fā)現(xiàn)低水平的炎癥參與了OA的進(jìn)程(滑膜水腫增生、炎癥因子釋放)[3],因此此前有許多關(guān)于OA的研究聚焦于滑膜或軟骨標(biāo)本差異性基因研究上,這類(lèi)基因芯片研究數(shù)據(jù)相當(dāng)一部分匯集于公共數(shù)據(jù)庫(kù)GEO(Gene Expression Omnibus)上,而國(guó)內(nèi)GCBI生物信息分析平臺(tái)匯集了GEO在內(nèi)的多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)及分析技術(shù)模塊,這為我們提供了綜合該病現(xiàn)有生物信息數(shù)據(jù)、進(jìn)行病灶與正常組織差異性基因發(fā)掘的有利條件,使探索該病致病基因、信號(hào)通路甚至治療靶點(diǎn)的手段更為豐富。本研究利用公共基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)(GEO)中的骨關(guān)節(jié)炎R(shí)NA基因芯片數(shù)據(jù),對(duì)該病的相關(guān)基因進(jìn)行挖掘,并進(jìn)行生物信息學(xué)分析,現(xiàn)報(bào)道如下:
在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載OA芯片數(shù)據(jù)。每個(gè)數(shù)據(jù)集均需符合以下條件:(1)數(shù)據(jù)集來(lái)自全基因組 RNA 表達(dá)芯片;(2)因OA病理核心表現(xiàn)與軟骨退變和滑膜炎癥相關(guān),因此選取差異性基因樣本研究來(lái)源于滑膜和軟骨,實(shí)驗(yàn)使用人類(lèi)骨關(guān)節(jié)炎滑膜或軟骨組織與正常滑膜或軟骨組織對(duì)照,每組樣本至少不小于3個(gè)。(3)GCBI平臺(tái)支持已獲取的芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行后期運(yùn)算分析。
在GEO下載的原始芯片數(shù)據(jù),導(dǎo)入GCBI(http://www.gcb.com.cn)在線平臺(tái)。在該平臺(tái)實(shí)驗(yàn)室內(nèi),創(chuàng)建一個(gè)分析基因芯片差異基因的實(shí)驗(yàn)方案,平臺(tái)自動(dòng)按設(shè)計(jì)的方案為導(dǎo)入的芯片數(shù)據(jù)分組如下,按照GCBI生物信息分析模塊構(gòu)建如圖分析路線圖(圖1),獲得多個(gè)研究中正常組織和患者組織的差異基因并取得交集差異基因(若差異基因少于10,則取并集),依次針對(duì)差異基因的功能和生物過(guò)程進(jìn)行 Gene Ontology 功能富集分析(GO 分析),信號(hào)通路富集分析(KEGG分析)、趨勢(shì)分析,String網(wǎng)站(https://string-db.org)上進(jìn)行差異基因蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)分析(PPI并繪制網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖,)以上分析取前20項(xiàng)最顯著的條目,不足20條者羅列全部條目。
圖1 基于GCBI平臺(tái)構(gòu)建的模塊分析路線圖
表1
GCBI平臺(tái)對(duì)上傳的原始芯片數(shù)據(jù),首先進(jìn)行芯片信號(hào)值的預(yù)處理與預(yù)過(guò)濾,然后使用差異分析方法 SAM法,依次對(duì)所納入的 5套芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行差異基因的篩選?;?biāo)本組:差異基因的篩選條件為:Q 值 < 0.05,差異倍數(shù)≥1.5倍,其中從GSE55235中獲得差異性基因1804個(gè),表達(dá)上調(diào)的基因有884個(gè),下調(diào)的基因920個(gè);從GSE82107中獲得差異性基因1342個(gè),表達(dá)上調(diào)的基因有693個(gè),下調(diào)基因649個(gè);從GSE12021中獲得差異性基因1150個(gè),表達(dá)上調(diào)的基因有10個(gè),下調(diào)基因1140個(gè);3個(gè)差異性基因數(shù)據(jù)集取交集得53個(gè)差異基因。軟骨標(biāo)本組,2塊芯片:差異基因的篩選條件為:Q 值 <0.05,差異倍數(shù)≥1.2倍,因樣本量少,取交集得差異基因較少,僅11個(gè),考慮OA同時(shí)有滑膜增生和軟骨退變,為避免遺漏差異性基因,我們將滑膜來(lái)源的差異性基因交集(53個(gè))與軟骨來(lái)源的差異基因并集(606個(gè))合并,得648個(gè)差異基因,進(jìn)行進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析。
取并集后的 648個(gè)差異基因,用 GCBI平臺(tái)自帶的GO分析模塊分別作生物學(xué)進(jìn)程和分子功能 GO 富集分析(FDR<0.01),結(jié)果顯示這些基因富集在膠原蛋白生成代謝、血管新生等生物學(xué)進(jìn)程和細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成、相關(guān)受體結(jié)合、金屬離子、部分細(xì)胞因子(生長(zhǎng)因子為主)結(jié)合或活化等分子功能上。見(jiàn)表 2。
表2 GO 富集分析生物過(guò)程的結(jié)果
表3 GO富集分析分子功能的結(jié)果
續(xù)表3
GO編號(hào)注釋基因數(shù)FDR值GO:0048407血小板源生長(zhǎng)因子結(jié)合65.46E?07GO:0005102受體的結(jié)合196.03E?06GO:0005178整合素的結(jié)合116.15E?06GO:0004867西林類(lèi)肽鏈內(nèi)切酶抑制劑的活性111.55E?05GO:0002020蛋白酶綁定91.55E?05GO:0008083生長(zhǎng)因子活性141.55E?05GO:0043184血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2結(jié)合41.82E?05GO:0042802同源蛋白結(jié)合204.48E?05GO:0005096鳥(niǎo)苷三磷酸酶的激活124.61E?05GO:0070492低聚糖的結(jié)合30.000211125GO:0004222金屬內(nèi)肽酶的活化100.000232253
取并集后的 648 個(gè)差異基因,用 GCBI平臺(tái)自帶的Pathway分析模塊作通路分析,共獲得富集通路107條,最顯著的20條通路結(jié)果顯示,這些基因顯著富集于細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)建、補(bǔ)體系統(tǒng)與凝血、黏著斑以及免疫炎癥相關(guān)的PI3K-Akt 信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路,與某些特殊感染、癌癥相關(guān)疾病通路也有密切聯(lián)系。(P值<0.05)。在此基礎(chǔ)上對(duì)這107條通路做信號(hào)通路間功能方面互相作用網(wǎng)絡(luò)分析,得到46條顯著互相作用的信號(hào)通路,其中交互作用最顯著9條的核心通路為MAPK 信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、粘附以及鈣離子相關(guān)通路、Wnt通路、P53通路,VEGF通路,與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病密切相關(guān),見(jiàn)表 3。
表4
續(xù)表4
編號(hào)注釋基因數(shù)P值5146阿米巴病141.74106E?094270血管平滑肌收縮146.26743E?095200癌癥相關(guān)通路214.83776E?084066HIF?1信號(hào)通路111.01875E?064540縫隙連接101.60154E?064726含血清素的神經(jīng)突觸通路112.12086E?064912促性腺激素信號(hào)通路102.18308E?064010MAPK信號(hào)通路163.86923E?064730抑郁癥相關(guān)85.52384E?065166人類(lèi)T淋巴細(xì)胞細(xì)胞性病毒感染165.72222E?065210結(jié)腸直腸癌相關(guān)87.11345E?064380破骨細(xì)胞分化111.11713E?055144瘧疾71.46051E?054970唾液分泌91.507E?05
圖2 差異蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖注:圖中每個(gè)圓圈代表一個(gè)蛋白,連線代表兩個(gè)蛋白直接有相互作用關(guān)系。一個(gè)蛋白與多個(gè)蛋白之間有線相連,代表與多個(gè)蛋白有相關(guān)作用關(guān)系,連線代表該蛋白在網(wǎng)絡(luò)中的地位越重要
取并集后的 648個(gè)差異基因,用 GCBI平臺(tái)自帶的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析模塊分析其單一基因之間的相互作用網(wǎng)絡(luò),最終得到88個(gè)作用顯著的蛋白,將這些蛋白帶入蛋白分析數(shù)據(jù)平臺(tái)STRING(https://string-db.org/)進(jìn)行蛋白互相作用分析,作圖結(jié)果如圖2可見(jiàn):其中最核心的蛋白包括PRKCA 、ITGB3 、PLCB1 、ADCY4、PIK3R3、 NRAS 、 ITPR1,這些蛋白與周?chē)鞍椎年P(guān)系數(shù)目均大于10(稱(chēng)之為度,即圓圈所示某一蛋白的外周連線數(shù)目超過(guò)10,表示該蛋白直接聯(lián)系的上下游基因數(shù)目總和)。
基于公共基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)的挖掘性生物信息分析是目前關(guān)注度較熱的一種預(yù)測(cè)性研究方法[4],這種方法可以協(xié)助研究者從自己關(guān)注的領(lǐng)域和角度出發(fā),在前人基因芯片研究數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上探索病理組織與正常組織差異性基因,找到潛在的罪犯基因或信號(hào)通路,為接下來(lái)的研究方向提供指導(dǎo)依據(jù),但國(guó)內(nèi)骨關(guān)節(jié)炎方面的此類(lèi)研究尚較少報(bào)道。
骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)程中存在滑膜增生水腫以及軟骨退行性變,本研究從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載5套骨關(guān)節(jié)炎R(shí)NA基因芯片數(shù)據(jù)(3塊芯片滑膜組織來(lái)源研究、2塊芯片來(lái)自軟骨標(biāo)本),利用GCBI生物信息分析平臺(tái)進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘與分析,因滑膜來(lái)源芯片數(shù)據(jù)多,而軟骨組織來(lái)源芯片數(shù)據(jù)少,為減少遺漏,我們選擇取滑膜來(lái)源數(shù)據(jù)芯片交集,軟骨組織來(lái)源芯片數(shù)據(jù)取并集,以上二者再取并集得到差異性基因648個(gè),在此基礎(chǔ)上進(jìn)行差異性基因功能歸類(lèi)注釋(GO分析)、信號(hào)通路富集分析(Pathway分析)以及蛋白之間、信號(hào)通路之間的交互作用網(wǎng)絡(luò)分析以求探索導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生的核心功能基因和信號(hào)通路,研究結(jié)果顯示:相對(duì)于正常組織,OA組差異性基因主要表現(xiàn)在膠原蛋白生成代謝、血管新生等生物學(xué)進(jìn)程和細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成方面,這與骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變、含水率下降,滑膜一定程度上水腫增生的病理表現(xiàn)相符。我們發(fā)掘出差異顯著的基因RGS2、IER3、RAM1、AP-1在后續(xù)的研究文獻(xiàn)溯源查閱中得到了一定的證實(shí),如:RGS2(G蛋白信號(hào)調(diào)節(jié)因子2)是一個(gè)蛋白編碼基因,既往發(fā)現(xiàn)RGS2與高血壓、焦慮癥及肥胖相關(guān)[5],但近期的研究證實(shí):RGS2可以協(xié)同RGS5,RGS7 RGS10促進(jìn)軟骨細(xì)胞發(fā)育分化,而RGS4可抑制軟骨細(xì)胞分化,與NOTCH炎癥通路導(dǎo)致的軟骨退變也有關(guān)聯(lián)[6],而目前這方面的研究報(bào)道尚少。而AP-1是明確參與了骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病的明星分子,且有報(bào)道[7]發(fā)現(xiàn)黃芩素這一中藥單體成分通過(guò)在轉(zhuǎn)錄水平上抑制κc-fos和AP-1的活性從而阻斷了滑膜的慢性炎癥,保護(hù)了軟骨的降解,其相關(guān)途徑包括MAPK、RET信號(hào)等通路。而經(jīng)過(guò)pathway分析,這些差異基因顯著富集的MAPK 信號(hào)通Wnt通路、VEGF通路、P53通路都是近10年來(lái)與骨關(guān)節(jié)炎炎癥發(fā)生、滑膜水腫增生密切相關(guān)的通路,而細(xì)胞凋亡、粘附以及鈣離子相關(guān)通路也與軟骨變性、破壞相關(guān)。蛋白交互作用作網(wǎng)絡(luò)分析中我們發(fā)現(xiàn)了88個(gè)作用顯著的蛋白,其中(PRKCA、ITGB3、PLCB1、ADCY4、PIK3R3)是最顯著的5個(gè)核心蛋白,文獻(xiàn)溯源[8]提示:PRKCA(Protein kinase C alfa,蛋白激酶C-a)參與了細(xì)胞粘附、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、細(xì)胞周期和細(xì)胞體積變化等多種生物過(guò)程,是激活MAPK炎癥信號(hào)通路的重要激酶,對(duì)OA的炎癥發(fā)生有重要意義。而ITGB3(integrin,beta 3,整合素beta-3)是細(xì)胞黏附分子家族的重要成員之一[9],主要介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)之間的相互黏附,并介導(dǎo)細(xì)胞與 ECM 之間的雙向信號(hào)傳導(dǎo),參與了血管生成,侵襲轉(zhuǎn)移、炎癥、傷口愈合和凝血等生理和病理過(guò)程,在PI3K炎癥相關(guān)通路中扮演重要角色,參與了OA滑膜炎癥的的發(fā)生,目前以整合素為治療靶點(diǎn)的含精-甘-天冬序列的多肽,(Arg-Gly-Asp,RGD)[10]能抑制破骨細(xì)胞之間、破骨細(xì)胞與基質(zhì)之間的黏附,阻止破骨細(xì)胞的增殖、遷移、分化,從而促進(jìn)骨組織的再生。ADCY4(adenylate cyclase 4,腺苷酸環(huán)化酶4)[11]廣泛分布于哺乳動(dòng)物的細(xì)胞膜中,催化ATP生成cAMP并釋放焦磷酸,對(duì)軟骨細(xì)胞的能量代謝、老化凋亡有重要意義,這些蛋白在軟骨組織滑膜組織中含量較多,提示了潛在的致病機(jī)理和成為治療靶點(diǎn)的可行性,部分研究已經(jīng)進(jìn)展至相應(yīng)的靶向藥物,為未來(lái)臨床治療用藥指出了方向。
本研究尚存在一些缺陷和問(wèn)題:①GCBI生物信息分析平臺(tái)雖然整合了GEO數(shù)據(jù)庫(kù),KEGG數(shù)據(jù)庫(kù),STRINBG數(shù)據(jù)庫(kù)及分析平臺(tái)的部分資源和功能,較大程度實(shí)現(xiàn)了數(shù)據(jù)共享、一次進(jìn)行多種方法和角度分析,迅速顯示結(jié)果的需求,但并不能完全涵蓋所有數(shù)據(jù),即使是GEO數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)的RNA芯片數(shù)據(jù)也不能全部支持匹配分析,因此納入數(shù)據(jù)有一定局限性。②同一差異性基因存在多個(gè)別名,各大網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫(kù)難以涵蓋所有別名,為研究帶來(lái)困難,③目前國(guó)內(nèi)大量的生物信息研究通常是在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)找到目的芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行找到差異性基因,分別帶入DAVID網(wǎng)站進(jìn)行GO分析、KEGG網(wǎng)站進(jìn)行pathway 分析,STRING網(wǎng)站進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)化分析,較少有直接利用國(guó)內(nèi)GCBI一站式完成所有數(shù)據(jù)獲取和分析的研究,且更缺乏同一對(duì)象同時(shí)利用上述多網(wǎng)站平臺(tái)分析和GCBI一站式分析的對(duì)比分析,以評(píng)價(jià)哪種研究遺漏數(shù)據(jù)較多、偏倚性如何,這是今后必須關(guān)注的方向。④不同研究的芯片數(shù)據(jù)或因?yàn)闃颖颈旧泶嬖趥€(gè)體化差異,或因?yàn)樾酒O(shè)計(jì)(如探針敏感性特異性有差異)導(dǎo)致同一基因在A研究中疾病組表現(xiàn)為表達(dá)上調(diào),而在B研究中表現(xiàn)為下調(diào)或差異不明顯,多個(gè)研究數(shù)據(jù)差異基因的交集難以確認(rèn)表達(dá)量情況,導(dǎo)致后期篩選出來(lái)的差異基因必須進(jìn)行浩繁的文獻(xiàn)回溯驗(yàn)證才能使結(jié)論更加嚴(yán)謹(jǐn)。⑤生物信息分析畢竟只是對(duì)既往研究數(shù)據(jù)的歸納整理,與真實(shí)世界的基因表達(dá)尚存在距離,尤其現(xiàn)有文獻(xiàn)無(wú)報(bào)道的情況下,找到的顯著差異性基因可能與發(fā)病本身無(wú)關(guān),因此有必要進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,如再獲取標(biāo)本進(jìn)行免疫組化分析或細(xì)胞層面上的基因表達(dá)量研究。雖然有問(wèn)題和缺陷,GCBI整合國(guó)際上多個(gè)權(quán)威基因數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái),構(gòu)建一站式獲取、分析的國(guó)內(nèi)生物信息分析平臺(tái)的思路是值得肯定的,該平臺(tái)的營(yíng)運(yùn)技術(shù)人員也擴(kuò)大支持分析的芯片類(lèi)型和數(shù)據(jù)資源,積極完善分析計(jì)算模塊的功能,提高其分析精度,數(shù)據(jù)資源的局限性、不同類(lèi)型或格式芯片數(shù)據(jù)的歸一化、多平臺(tái)分析的兼容性這些問(wèn)題是有望得到解決的。而本研究選出的潛在致病信號(hào)通路和關(guān)鍵基因經(jīng)現(xiàn)階段文獻(xiàn)查閱驗(yàn)證大多存在合理性,我們將在接下來(lái)的實(shí)際標(biāo)本免疫組化及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證這些潛在靶點(diǎn)。
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BioinformaticsanalysisofosteoarthritisgenemicroarraybasedonGCBIdatabase
LUYun,LIANGJiang,TAIWan,ZHOUJing,HUANGWei-chen,XUYu
(GuiyangCollegeofTraditionalChineseMedicine,MiaoMedicineCollaborativeInnovationCenter,Guiyang,Guizhou,550000)
ObjectiveTo explore the mechanism of osteoarthritis(OA)and search the key genes as new treating target for future research.MethodsGene microarray profiles on osteoarthritis(samples of synovial membranes or cartilage tissues came from osteoarthritis patients and healthy donors)were download from GEO(Database of Gene Expression Omnibus),then different expressed genes were identified through lab data analytics platform named GCBI,then key functions,pathways and Internal relations between these genes were explored through three methods include gene oncology(GO),KEGG pathway and protein-protein interaction analysis(PPI).Results648 different expressed genes were got from 5 gene expression data sets met the inclusion criteria,7 genes(PRKCA、ITGB3、PLCB1、ADCY4、PIK3R3、 NRAS 、ITPR1)may play important roles in OA,9 bio-pathways appeared to be important in OA,including PI3K-AKT signaling pathway、MAPK signaling pathway、cell apoptosis and adhesion pathway,P53 signaling pathway,VEGF pathway.ConclusionBioinformatics analysis may be helpful to research OA gene microarray data and study key proteins and signaling pathways for treating targets or pathogenesis.
Osteoarthritis; Gene microarray; Bioinformatics analysis; Synovial membrane; Cartilage
基金編號(hào):1)貴州省重大基礎(chǔ)研究專(zhuān)項(xiàng)資助項(xiàng)目;項(xiàng)目編號(hào):黔科合J重大字[2015]2002;2)貴州省自然科學(xué)技術(shù)基金資助項(xiàng)目:黔科合J字[2013]2074號(hào),3)國(guó)家自然基金(地區(qū)基金):項(xiàng)目批準(zhǔn)號(hào) 81560817
550000,貴州貴陽(yáng),貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院 苗族醫(yī)學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心
梁江,E-mail:165372999@qq.com
10.3969/j.issn.1674-9006.2017.04.008
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