陳靜思 孫晨 陽(yáng)海平 甘立強(qiáng) 譚春花 王華 羅曉燕

400014重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院皮膚科（陳靜思、甘立強(qiáng)、譚春花、王華、羅曉燕），兒童發(fā)育疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 兒科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（孫晨），兒童發(fā)育重大疾病國(guó)家國(guó)際科技合作基地（陽(yáng)海平）

·論著·

過(guò)敏性紫癜患者中性粒細(xì)胞及其IgA Fc受體對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制

陳靜思 孫晨 陽(yáng)海平 甘立強(qiáng) 譚春花 王華 羅曉燕

400014重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院皮膚科（陳靜思、甘立強(qiáng)、譚春花、王華、羅曉燕），兒童發(fā)育疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 兒科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（孫晨），兒童發(fā)育重大疾病國(guó)家國(guó)際科技合作基地（陽(yáng)海平）

目的研究中性粒細(xì)胞及其IgA Fc受體（CD89）在過(guò)敏性紫癜（HSP）發(fā)病中的作用和對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷效應(yīng)及調(diào)控機(jī)制。方法入組30例急性期HSP患兒及9例健康對(duì)照兒童，分離外周血中性粒細(xì)胞；Jacalin親和層析分離HSP患者血清IgA后，采用聚丙烯葡聚糖凝膠純化IgA。實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）、Western印跡分別檢測(cè)中性粒細(xì)胞CD89 mRNA和蛋白表達(dá)，流式細(xì)胞儀分析中性粒細(xì)胞活化標(biāo)志分子CD11b的表達(dá)。分別將HSP患兒中性粒細(xì)胞、健康對(duì)照中性粒細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC共培養(yǎng)，以HSP患兒血清分離的IgA（HSP IgA）、單體IgA（mIgA）、磷酸鹽緩沖液（空白對(duì)照組）分別處理，流式細(xì)胞儀檢測(cè)HUVEC細(xì)胞凋亡，ELISA檢測(cè)上清液中白細(xì)胞介素8（IL?8）、腫瘤壞死因子α（TNF?α）水平。結(jié)果HSP患兒組中性粒細(xì)胞CD89 mRNA表達(dá)與健康對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.98），但蛋白表達(dá)（0.60±0.16）低于健康對(duì)照組（0.83±0.24，P=0.03）。HSP患者中性粒細(xì)胞CD11b表達(dá)（1 880.25±388.29）顯著高于健康對(duì)照組（1 109.25±364.25，P＜0.01）。與HSP患者中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)組HUVEC凋亡率（37.44%±5.49%）高于與健康對(duì)照中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)組（17.14%±4.45%，P＜0.01）。HSP IgA處理組HUVEC凋亡率明顯高于mIgA處理組（均P＜0.01）和空白對(duì)照組（P＜0.01），且上清液中IL?8、TNF?α濃度明顯高于mIgA處理組（均P＜0.01）和空白對(duì)照組（P值分別為0.01、0.02）。結(jié)論HSP患者外周血中性粒細(xì)胞活化，并可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。而且HSP IgA能促進(jìn)中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和炎癥因子IL?8、TNF?α分泌，而mIgA則可能具有一定抑制效應(yīng)。

紫癜，過(guò)敏性；免疫球蛋白A；受體，F(xiàn)c；中性白細(xì)胞；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；凋亡；白細(xì)胞介素8；腫瘤壞死因子α

過(guò)敏性紫癜（Henoch Sch?nlein purpura，HSP）在組織病理上是一種累及小血管、以中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主的白細(xì)胞碎裂性血管炎，其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。有研究表明，氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過(guò)氧化、中性粒細(xì)胞激活在發(fā)病中起重要作用［1］。中性粒細(xì)胞激活后可誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，釋放髓過(guò)氧化物酶（myeloperoxidase，MPO），產(chǎn) 生 活 性 氧 自 由 基（reactive oxygen species，ROS）等，參與對(duì)小血管的損傷［2］。中性粒細(xì)胞表面表達(dá)多種免疫識(shí)別受體，包括Toll樣受體、補(bǔ)體受體、IgG Fc受體（FcγR）、IgA Fc受體（FcαR I/CD89）等，其中 IgA Fc受體（FcαR I/CD89）能通過(guò)2個(gè)胞外結(jié)合域與IgA的Fc段發(fā)生特異性高親和力結(jié)合。IgA與Fc受體結(jié)合后吸引循環(huán)中抗IgA自身抗體（包括IgG與IgA）是循環(huán)免疫復(fù)合物形成的基礎(chǔ)，并可激發(fā)吞噬、抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用（ADCC）等［3］。目前中性粒細(xì)胞在HSP發(fā)病中的具體作用及機(jī)制仍不清楚。本研究擬觀察急性HSP患兒外周血中性粒細(xì)胞活化及其IgA Fc受體CD89表達(dá)水平，構(gòu)建HSP患者中性粒細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞即人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）共培養(yǎng)模型，評(píng)估IgA及Fc受體對(duì)共培養(yǎng)HUVEC細(xì)胞凋亡的影響，以闡明中性粒細(xì)胞參與HSP發(fā)病及其損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞的機(jī)制。

對(duì)象與方法

1.病例收集：2014年2月至2015年6月重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院皮膚科門診就診的初發(fā)急性期HSP患兒30例，其中男19例，女11例，年齡（7.42±2.22）歲，均符合2006年歐洲風(fēng)濕聯(lián)合會(huì)（EULAR）HSP診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］。9例健康體檢兒童作為對(duì)照，其中男4例，女5例，年齡（8.46±2.36）歲，兩組性別構(gòu)成及年齡差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。30例HSP患兒各取外周血3～5 ml，采用Percoll密度梯度離心法分離，每例約收獲4×106～1×107中性粒細(xì)胞，其純度＞90%，臺(tái)盼藍(lán)染色示細(xì)胞活力＞92%。其中，8例用于分離中性粒細(xì)胞檢測(cè)CD11b及CD89表達(dá)，5例用于分離中性粒細(xì)胞與HUVEC共培養(yǎng)檢測(cè)HUVEC凋亡，12例分離血清提取IgA，5例與HUVEC共培養(yǎng)并用不同類型IgA處理。健康對(duì)照組中，8例外周血分離中性粒細(xì)胞檢測(cè)CD11b及CD89表達(dá)，5例分離的中性粒細(xì)胞與HUVEC共培養(yǎng)。本研究通過(guò)重慶醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

2.材料：Nycoprep分離液（挪威Axis?shield公司），Jacalin親和層析柱（美國(guó)Thermo公司），人單體IgA（mIgA，美國(guó)Abcam公司），胎牛血清（美國(guó)Gibco公司），HUVEC細(xì)胞株、異硫氰酸熒光素/碘化丙錠標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V（Annexin V?FITC/PI）、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（南京凱基公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光實(shí)時(shí)定量試劑盒（日本TakaRa公司），蛋白提取試劑盒、鼠抗人β肌動(dòng)蛋白單克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司），鼠抗人CD11b單克隆抗體（美國(guó)BD公司），鼠抗人CD89單克隆抗體（美國(guó)AbD Serotec公司），F(xiàn)ITC-羊抗鼠IgG二抗（美國(guó)Abcam公司），辣根過(guò)氧化物酶（HRP）-羊抗鼠IgG二抗（北京中山金橋公司），人白細(xì)胞介素8（IL-8）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA試劑盒（美國(guó)R&D公司）。實(shí)時(shí)定量PCR儀（美國(guó)Bio?Rad公司），Western印跡凝膠成像儀（日本Fujifilm公司），BD FACS CantoⅡ流式分析儀（美國(guó)BD公司）。

3.實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）檢測(cè)中性粒細(xì)胞CD89 mRNA表達(dá)：提取外周血中性粒細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，行 qPCR，反應(yīng)體積 20 μl，反應(yīng)條件：95℃ 2 min，94 ℃ 1 min，60℃ 1 min，72℃ 2 min，共30個(gè)循環(huán)。CD89：正向引物5′?GAGCACAGTCAGT AGACTTC?3′，反向引物5′?GATTCCGAGCGTGAGT CCA?3′；內(nèi)參照β肌動(dòng)蛋白：正向引物5′?TGGCACC CAGCACAATGAA?3′，反向引物5′?TGGAAGGTGGA CAGCGAGGC?3′。結(jié)果采用2?ΔΔCt表示，每個(gè)樣本重復(fù)3次取平均值。

4.Western印跡檢測(cè)中性粒細(xì)胞CD89蛋白表達(dá)：提取外周血中性粒細(xì)胞蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS?PAGE），轉(zhuǎn)膜并加入抗體反應(yīng)，顯影、定影，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的分子量和靜吸光度。以CD89蛋白與β肌動(dòng)蛋白的比值表示蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

5.流式細(xì)胞儀檢測(cè)中性粒細(xì)胞活化標(biāo)志CD11b：分離外周血中性粒細(xì)胞，鼠抗人CD11b單克隆流式抗體染色后上機(jī)檢測(cè)，藻紅蛋白標(biāo)記的鼠IgG1為陰性對(duì)照，每個(gè)樣本設(shè)1個(gè)復(fù)孔，以平均熒光強(qiáng)度（MFI）表示CD11b表達(dá)量。

6.HSP患兒血清IgA（HSP IgA）提取和純化［5］：采用Jacalin親和層析柱法分離患者血清IgA，將洗脫液過(guò)聚丙烯葡聚糖凝膠Sephacryl 200層析柱，并收集第1峰洗脫液，BCA法測(cè)定濃度后備用。

7.中性粒細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)模型的構(gòu)建及分組：取HUVEC鋪6孔板（1.7×106細(xì)胞/孔），分別加入5例HSP患兒或5例健康對(duì)照外周血分離的中性粒細(xì)胞（5×105/孔），每個(gè)樣本設(shè)1個(gè)復(fù)孔，于37℃孵箱共培養(yǎng)24 h后流式檢測(cè)HUVEC凋亡率。再分別取5例HSP患兒、5例健康對(duì)照外周血中性粒細(xì)胞與HUVEC同上建立共培養(yǎng)模型，分為3組，每個(gè)樣本設(shè)復(fù)孔，①空白對(duì)照組：向共培養(yǎng)體系中加入等體積PBS；②mIgA組：加入最適濃度mIgA；③HSP IgA組：加入最適濃度HSP IgA。IgA最適濃度確定：配制20、30、40、50 mg/L mIgA以及25、50、100、200 mg/L HSP IgA，分別加入共培養(yǎng)模型干預(yù)24 h，流式細(xì)胞儀檢測(cè)HUVEC凋亡，經(jīng)5次預(yù)實(shí)驗(yàn)確定mIgA最適濃度為40 mg/L，此時(shí)HUVEC早期凋亡率最低，HSP IgA最適濃度為100 mg/L，此時(shí)HUVEC早期凋亡率最高。

8.HUVEC凋亡檢測(cè)：采用流式細(xì)胞儀分析。收集共培養(yǎng)的HUVEC和HSP中性粒細(xì)胞，以中性粒細(xì)胞CD11b為標(biāo)記，采用陰選圈定HUVEC，Annexin V?FITC/PI Q4象限（Annexin V?FITC陽(yáng)性，PI陰性）代表早期凋亡細(xì)胞。

9.ELISA法檢測(cè)共培養(yǎng)模型上清液中IL?8、TNF?α水平：按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

10.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：Flowjo軟件分析流式細(xì)胞儀檢測(cè)數(shù)據(jù)，采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示。計(jì)量資料兩組間比較采用t檢驗(yàn)，3組及以上組間比較用單因素方差分析，兩兩比較采用最小顯著性差異（LSD）法。計(jì)數(shù)資料比較采用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.CD89 mRNA及蛋白表達(dá)：急性HSP患兒外周血中性粒細(xì)胞CD89 mRNA表達(dá)與健康對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.98），而CD89蛋白表達(dá)顯著低于健康對(duì)照組（P=0.03），見(jiàn)圖1、表1。

2.CD11b表達(dá)：HSP患兒中性粒細(xì)胞CD11b MFI顯著高于健康對(duì)照組（P＜0.01），見(jiàn)表1。

3.中性粒細(xì)胞對(duì)HUVEC凋亡的影響：與HSP患者中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)的HUVEC凋亡率高于與健康對(duì)照中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)組（P＜0.01），見(jiàn)表1。

圖1 Western印跡檢測(cè)中性粒細(xì)胞CD89蛋白表達(dá) 1～4：健康對(duì)照；5～8：過(guò)敏性紫癜患兒

表1 過(guò)敏性紫癜（HSP）患兒中性粒細(xì)胞CD89、CD11b表達(dá)水平及對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）凋亡的影響（±s）

表1 過(guò)敏性紫癜（HSP）患兒中性粒細(xì)胞CD89、CD11b表達(dá)水平及對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）凋亡的影響（±s）

注：aHUVEC凋亡率檢測(cè)中兩組例數(shù)均為5

組別健康對(duì)照組HSP組t值P值例數(shù)a 88 CD89 mRNA 1.11±0.12 1.11±0.04 0.02 0.98 CD89蛋白0.83±0.24 0.60±0.16 2.36 0.03 CD11b平均熒光強(qiáng)度1 109.25±364.25 1 880.25±388.29 4.10＜0.01 HUVEC凋亡率（%）17.14±4.45 37.44±5.49 6.43＜0.01

表2 HSP患者IgA和mIgA對(duì)共培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及上清液中IL?8、TNF?α水平的影響（±s）

表2 HSP患者IgA和mIgA對(duì)共培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及上清液中IL?8、TNF?α水平的影響（±s）

注：n=5。與HSP IgA組比較，aP ＜0.01，bP ＜0.05。HSP：過(guò)敏性紫癜；HUVEC：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；IL?8：白細(xì)胞介素8；TNF?α：腫瘤壞死因子α

組別HSP IgA組mIgA組空白對(duì)照組F值P值HUVEC凋亡率（%）63.99±14.90 27.07±8.21a 34.90±7.99a 16.08＜0.01 IL?8（μg/L）8 423.99±2 659.48 3 135.36±1 153.84a 4 706.28±1 502.94b 10.34＜0.01 TNF?α（μg/L）275.98±40.39 168.49±48.16a 210.44±24.80b 9.64＜0.01

4.不同IgA處理對(duì)中性粒細(xì)胞與HUVEC共培養(yǎng)模型中HUVEC凋亡及上清液中IL?8、TNF?α水平的影響：HSP IgA組HUVEC平均凋亡率高于mIgA組（P＜0.01）及空白對(duì)照組（P＜0.01），mIgA組凋亡率低于空白對(duì)照組，但兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.28）。HSP IgA組上清液中IL?8、TNF?α濃度均顯著高于mIgA組（均P＜0.01）及空白對(duì)照組（P值分別為0.01、0.02），mIgA與空白對(duì)照組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

討 論

中性粒細(xì)胞在HSP發(fā)病機(jī)制中具有重要意義。首先，HSP的病理基礎(chǔ)是以中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主的白細(xì)胞碎裂性血管炎，其次在免疫復(fù)合物介導(dǎo)的血管炎模型Arthus反應(yīng)中，免疫復(fù)合物沉積導(dǎo)致補(bǔ)體活化和炎癥細(xì)胞募集，而中性粒細(xì)胞活化和聚集是免疫復(fù)合物致血管損傷所必需的條件［6］。另外有研究發(fā)現(xiàn)，HSP患兒急性期皮損處趨化中性粒細(xì)胞黏附的細(xì)胞間黏附分子1（ICAM?1）、E選擇素、P選擇素水平明顯上調(diào)，而ICAM?1、E選擇素、P選擇素配體下調(diào)可使中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，從而減輕水腫、出血等血管炎表現(xiàn)［7］。CD11b是中性粒細(xì)胞活化后表達(dá)的黏附分子，在靜息狀態(tài)下貯存于中性粒細(xì)胞胞質(zhì)的三級(jí)顆粒中，在炎癥狀態(tài)下CD11b表達(dá)持續(xù)增加且分子活性增高，是中性粒細(xì)胞早期活化的特異性指標(biāo)和HSP血管炎癥產(chǎn)生的始動(dòng)環(huán)節(jié)［8］。本研究證實(shí)，急性期HSP患兒中性粒細(xì)胞CD11b表達(dá)明顯增高。我們還發(fā)現(xiàn)急性期HSP患兒外周血中性粒細(xì)胞CD89 mRNA表達(dá)正常，而蛋白水平較健康對(duì)照組降低。體外研究及多項(xiàng)疾病動(dòng)物模型表明，CD89在介導(dǎo)血管炎癥反應(yīng)、組織免疫損傷中起重要作用，可通過(guò)配體IgA調(diào)控其在體內(nèi)的功能［3］。在與HSP發(fā)病機(jī)制相似的IgA腎病患者中，中性粒細(xì)胞表面及胞質(zhì)內(nèi)CD89表達(dá)下調(diào)，推測(cè)可能與CD89在IgA作用下胞外段脫落至循環(huán)中導(dǎo)致效應(yīng)細(xì)胞表面表達(dá)降低有關(guān)［9］。中性粒細(xì)胞表面CD89的持續(xù)下調(diào)可導(dǎo)致循環(huán)中IgA免疫復(fù)合物降解障礙，加劇循環(huán)中IgA免疫復(fù)合物的沉積［10］。

IgA是HSP重要的致病因素，血清IgA以mIgA、多聚IgA（pIgA）等多種形式共存，IgA受體CD89可能作為雙功能受體發(fā)揮不同生理效應(yīng)［11］。mIgA在無(wú)抗原刺激下能抑制多種炎癥應(yīng)答過(guò)程，而pIgA及免疫復(fù)合物則發(fā)揮促炎作用［12?14］。為進(jìn)一步探討不同類型IgA對(duì)HSP中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的HUVEC凋亡的作用及可能機(jī)制，我們構(gòu)建HSP中性粒細(xì)胞-HUVEC共培養(yǎng)炎癥模型，分別用自HSP患兒分離的IgA（以pIgA為主）及mIgA干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pIgA可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的HUVEC凋亡，而mIgA對(duì)凋亡顯示出一定的抑制效應(yīng)。中性粒細(xì)胞損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞可經(jīng)由以下幾種途徑：血管內(nèi)皮細(xì)胞激活，細(xì)胞因子、趨化因子、抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體、抗血管內(nèi)皮細(xì)胞抗體，免疫復(fù)合物沉積及補(bǔ)體激活［15?16］。本研究發(fā)現(xiàn)，不同類型IgA對(duì)促炎癥細(xì)胞因子IL?8、TNF?α的產(chǎn)生有不同影響：pIgA可誘導(dǎo)IL?8、TNF?α產(chǎn)生，而mIgA則顯示出一定抑制作用。IL?8作為一種促炎癥細(xì)胞因子和趨化因子能誘導(dǎo)骨髓中性粒細(xì)胞，并與中性粒細(xì)胞上受體結(jié)合后誘導(dǎo)其向血管內(nèi)皮細(xì)胞移行和黏附，參與免疫復(fù)合物介導(dǎo)血管炎的發(fā)?。?7］。

綜上所述，本研究提示，HSP患兒血清IgA可能通過(guò)與中性粒細(xì)胞表面受體CD89結(jié)合，使中性粒細(xì)胞活化，進(jìn)而導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，CD89可能是HSP血管炎癥調(diào)控的潛在靶點(diǎn)。

［1］Carlson JA,Ng BT,Chen KR.Cutaneous vasculitis update:diagnostic criteria,classification,epidemiology,etiology,patho?genesis,evaluation and prognosis［J］.Am J Dermatopathol,2005,27（6）:504?528.DOI:10.1097/01.dad.0000181109.54532.c5.

［2］Ece A,Kelek?i S,Hekimoglu A,et al.Neutrophil activation,protein oxidation and ceruloplasmin levels in children with Henoch ?Sch?nlein purpura［J］.Pediatr Nephrol,2007,22（8）:1151?1157.DOI:10.1007/s00467?007?0475?5.

［3］Monteiro RC,Van De Winkel JG.IgA Fc receptors［J］.Annu Rev Immunol,2003,21:177?204.DOI:10.1146/annurev.immunol.21.120601.141011.

［4］Ortiz?Sanjuán F,Blanco R,Hernández JL,et al.Applicability of the 2006 European League Against Rheumatism （EULAR）criteria for the classification of Henoch?Sch?nlein purpura.An analysis based on 766 patients with cutaneous vasculitis［J/OL］.Clin Exp Rheumatol,2015,33（2 Suppl 89）:S?44?7［2017?06?10］.http://www.clinexprheumatol.org/abstract.asp?a=8633.

［5］Leung JC,Chan LY,Saleem MA,et al.Combined blockade of angiotensinⅡand prorenin receptors ameliorates podocytic apoptosis induced by IgA?activated mesangial cells［J］.Apoptosis,2015,20（7）:907?920.DOI:10.1007/s10495?015?1117?1.

［6］Sylvestre DL,Ravetch JV.Fc receptors initiate the Arthus reaction:redefining the inflammatory cascade［J］.Science,1994,265（5175）:1095?1098.DOI:10.1126/science.8066448.

［7］Gok F,Ugur Y,Ozen S,et al.Pathogenesis?related adhesion molecules in Henoch ?Schonlein vasculitis［J］.Rheumatol Int,2008,28（4）:313?316.DOI:10.1007/s00296?007?0437?z.

［8］Kallenberg CG,Heeringa P,Stegeman CA.Mechanisms of disease:pathogenesisand treatmentofANCA?associated vasculitides［J］.Nat Clin Pract Rheumatol,2006,2（12）:661 ?670.DOI:10.1038/ncprheum0355.

［9］Grossetête B,Launay P,Lehuen A，et al.Down-regulation of Fc alpha receptors on blood cells of IgA nephropathy patients:evidence for a negative regulatory role of serum IgA［J］.Kidney Int,1998,53（5）:1321?1335.DOI:10.1046/j.1523?1755.1998.00885.x.

［10］Roccatello D,Picciotto G,Torchio M,et al.Removal systems of immunoglobulin A and immunoglobulin A containing complexes in IgA nephropathy and cirrhosis patients.The role of asialogly?coprotein receptors［J］.Lab Invest,1993,69（6）:714?723.

［11］Aleyd E,Heineke MH,van Egmond M.The era of the immunoglobulin A Fc receptor FcαRI;its function and potential as target in disease［J］.Immunol Rev,2015,268（1）:123?138.DOI:10.1111/imr.12337.

［12］Bakema JE,van Egmond M.The human immunoglobulin A Fc receptor FcαRI:a multifaceted regulator of mucosal immunity［J］.MucosalImmunol,2011,4（6）:612?624.DOI:10.1038/mi.2011.36.

［13］Blank U,Launay P,Benhamou M,et al.Inhibitory ITAMs as novel regulators of immunity［J］.Immunol Rev,2009,232（1）:59?71.DOI:10.1111/j.1600?065X.2009.00832.x.

［14］Heineke MH,van Egmond M.Immunoglobulin A:magic bullet or Trojan horse?［J］.Eur J Clin Invest,2017,47（2）:184?192.DOI:10.1111/eci.12716.

［15］Pitanga TN,de Arag?o Fran?a L,Rocha VC,et al.Neutrophil?derived microparticles induce myeloperoxidase?mediated damage of vascular endothelial cells［J］.BMC Cell Biol,2014,15:21.DOI:10.1186/1471?2121?15?21.

［16］Bergin DA,Reeves EP,Meleady P,et al. α ?1 Antitrypsin regulates human neutrophil chemotaxis induced by soluble immune complexes and IL?8［J］.J Clin Invest,2010,120（12）:4236?4250.DOI:10.1172/JCI41196.

［17］Yang YH,Lai HJ,Huang CM,et al.Sera from children with active Henoch ?Sch?nlein purpura can enhance the production of interleukin 8 by human umbilical venous endothelial cells［J］.Ann Rheum Dis,2004,63（11）:1511 ?1513.DOI:10.1136/ard.2003.016196.

Effect of neutrophils and their IgA Fc receptor on vascular endothelial cell apoptosis in patients with Henoch ?Sch?nlein purpura and its mechanism

Chen Jingsi,Sun Chen,Yang Haiping,Gan Liqiang,Tan Chunhua,Wang Hua,Luo Xiaoyan
Department of Dermatology,Children′s Hospital of Chongqing Medical University（Chen JS,Gan LQ,Tan CH,Wang H,Luo XY）;Ministry of Education Key Laboratory of Child Development and Disorders,Chongqing Key Laboratory of Pediatrics,Chongqing 400014,China（Sun C）;China International Science and Technology Cooperation Base of Child Development and Critical Disorders,Chongqing 400014,China（Yang HP）

Luo Xiaoyan,Email:luoxycq@hotmail.com

ObjectiveTo investigate the role of neutrophils and their IgA Fc receptor CD89 in the occurrence of Henoch?Sch?nlein purpura（HSP）,to evaluate their effects on vascular endothelial cell apoptosis,and to explore their mechanisms.MethodsPeripheral blood neutrophils were isolated from 30 children with acute HSP and 9 age?matched healthy controls separately.After isolation of serum IgA by Jacalin affinity chromatography,IgA was purified by polypropylene dextran gel chromatography.Real?time fluorescence?based quantitative PCR（qPCR）and Western blot analysis were performed to determine the mRNA and protein expression of CD89 on neutrophils respectively,and flow cytometry was conducted to measure the expression of neutrophil activation marker CD11b.Human umbilical vein endothelial cells（HUVEC）were co?cultured with neutrophils isolated from patients with HSP（HSP group）and healthy controls（healthy control group）separately.Moreover,the HSP group were divided into 3 subgroups to be treated with serum IgA isolated from the HSP patients（HSP IgA group）,monomeric IgA（mIgA group）and phosphate?buffered saline（blank control group）respectively.Then,flow cytometry was conducted to detect apoptosis of co?cultured HUVEC,and enzyme?linked immunosorbent assay（ELISA）to measure levels of interleukin?8（IL?8）and tumor necrosis factor?alpha（TNF?α）in the supernatant of co?cultured cells.ResultsThere was no significant difference in the mRNA expression of CD89 on neutrophils between the patients with HSP and healthy controls（P=0.98）,but the protein expression of CD89 was significantly lower in the patients with HSP than in the healthy controls（0.60± 0.16vs.0.83± 0.24,P=0.03）.The expression of CD11b on neutrophils was significantly higher in the patients with HSP than in the healthy controls（1 880.25 ± 388.29vs.1 109.25 ± 364.25,P＜ 0.01）.The apoptosis rate of co?cultured HUVEC was also significantly higher in the HSP group than in the healthy control group（37.44% ±5.49%vs.17.14% ± 4.45%,P＜ 0.01）.In addition,the HSP IgA group showed significantly higher apoptosis rate of co?cultured HUVEC and levels of IL?8 and TNF?α in the supernatant compared with the mIgA group（allP＜0.01）and blank control group（P＜ 0.01,=0.01,=0.02,respectively）.ConclusionsPeripheral blood neutrophils in patients with HSP are activated,which can induce the apoptosis of vascular endothelial cells.HSP IgA can promote the neutrophil?mediated apoptosis of vascular endothelial cells and secretion of IL?8 and TNF?α,while mIgA may show a certain inhibitory effects.

Purpura,Schoenlein?Henoch;Immunoglobulin A;Receptors,Fc;Neutrophils;Human umbilical vein endothelial cells;Apoptosis;Interleukin?8;Tumor necrosis factor?alpha

Fund program:National Natural Science Foundation of China（81301362）

羅曉燕，Email：luoxycq@hotmail.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.11.005

國(guó)家自然科學(xué)基金（81301362）

2017?04?13）

尚淑賢）