王 浩，盧梓熒，譚⒈斯，劉 芳，丁利君*,劉 丹，藍德安

（1.廣東工業(yè)大學(xué) 輕工化工學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.廣州市華琪生物科技有限公司，廣東 廣州 510250）

響應(yīng)面法優(yōu)化米曲霉液體發(fā)酵生產(chǎn)中性蛋白酶工藝

王 浩1，盧梓熒1，譚⒈斯1，劉 芳1，丁利君1*,劉 丹1，藍德安2

（1.廣東工業(yè)大學(xué) 輕工化工學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.廣州市華琪生物科技有限公司，廣東 廣州 510250）

為提高米曲霉（Aspergillus oryzae）液體發(fā)酵生產(chǎn)中性蛋白酶的能力，采用單因素試驗、Plackett-Burman（PB）試驗篩選碳源、氮源和無機鹽，并通過響應(yīng)面法優(yōu)化其最佳配比，提高米曲霉液體發(fā)酵生產(chǎn)中性蛋白酶的活性。結(jié)果表明，米曲霉液體發(fā)酵生產(chǎn)中性蛋白酶的最佳碳源、氮源和無機鹽分別為玉米粉、牛肉膏和氯化鈣，發(fā)酵的最優(yōu)條件為玉米粉添加量17 g/L，牛肉膏添加量10 g/L，氯化鈣添加量0.04 g/L，接種量5%，裝液量60 mL/250 mL，于30℃條件下發(fā)酵84 h。在此優(yōu)化條件下，產(chǎn)生的中性蛋白酶活性從最初的21.4 U/mL提高至110.5 U/mL。

米曲霉；液體發(fā)酵；中性蛋白酶；Plackett-Burman試驗；響應(yīng)面

中性蛋白酶作用條件溫和，最適作用pH介于6.0～7.5之間[1]，是一類胞外酶，易于下游加工過程分離提取[2-3]，并且是最早發(fā)現(xiàn)并廣泛應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的蛋白酶制劑[4-5]。作為一種生物催化劑，中性蛋白酶具有催化反應(yīng)速度快、無工業(yè)污染等優(yōu)點[6]，在經(jīng)濟、社會、環(huán)保等方面發(fā)揮著巨大效益，已經(jīng)成為相關(guān)領(lǐng)Ⅱ的研究熱點[7]。據(jù)統(tǒng)計，微生物蛋白酶占據(jù)了整個酶銷售市場約40%的份額，已成為市場上蛋白酶生產(chǎn)的主要來源[8-9]。

米曲霉（Aspergillus oryzae）是醬油釀造中的常用生產(chǎn)菌，是一種食品安全菌株，穩(wěn)定性高，能耐較高的溫度，具有很強的產(chǎn)中性蛋白酶的能力[10]。目前，國內(nèi)外主要通過固體發(fā)酵生產(chǎn)中性蛋白酶，但固體發(fā)酵培養(yǎng)時間長，且反應(yīng)條件不易控制，重復(fù)性較差，而液體發(fā)酵培養(yǎng)時間相對較少，反應(yīng)條件容易實時監(jiān)控，易于工業(yè)擴大化生產(chǎn)[11-12]。利用米曲霉液體發(fā)酵生產(chǎn)中性蛋白酶在國外已有相關(guān)報道，而在國內(nèi)則研究很少。因此，本實驗通過單因素試驗、Plackett-Burman試驗篩選出對米曲霉液體發(fā)酵生產(chǎn)中性蛋白酶有顯著影響的碳源、氮源和無機鹽成分，并利用響應(yīng)面試驗分析法，優(yōu)化液體發(fā)酵生產(chǎn)中性蛋白酶的工藝條件，以期提高中性蛋白酶的活性，為米曲霉液體發(fā)酵生產(chǎn)中性蛋白酶提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米曲霉（Aspergillus oryzae）：廣州市華琪生物科技有限公司。

斜面培養(yǎng)基（查氏培養(yǎng)基）：以100mL計，蔗糖3g，NaNO30.3 g，K2HPO4·3H2O 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，KCl 0.05 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001 g，瓊脂2 g，pH自然，121℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基：玉米粉20 g/L，酵母粉10 g/L，蔗糖10 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KNO32 g/L，K2HPO4·3H2O 1 g/L，pH自然，121℃滅菌20 min。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉20g/L，牛肉膏15g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KNO32 g/L，K2HPO4·3H2O 1 g/L，pH自然，121℃滅菌20 min。

福林酚：上海麥克林生化科技有限公司；酪氨酸、干酪素：天津市進豐化工有限公司；所有試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1200型紫外/可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；KDC-40低速離心機：科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；YX-280手提式壓力蒸汽滅菌器：合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司；PHS-3C型實驗室pH計：上海智光儀器儀表有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；HZQ-F160A搖床：上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 米曲霉初始發(fā)酵條件

將凍干米曲霉轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基，30℃活化3～4 d，直到有綠色孢子生成。挑取斜面菌種3環(huán)，接種至裝液量為100 mL/250 mL三角瓶的液體種子培養(yǎng)基中，于30℃、120 r/min的搖床上培養(yǎng)54 h。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為70 mL/250 mL，接種量5%，于30℃、100r/min，發(fā)酵84h。發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液4000r/min離心20min，取上清液用1mol/LNaOH調(diào)pH至6.0～7.5備用。

1.3.2 單因素試驗

在米曲霉初始發(fā)酵條件的基礎(chǔ)上，以中性蛋白酶活性為指標，分別考察40g/L碳源（玉米粉、甘蔗渣、茶籽殼、紅薯粉、麩皮、淀粉、葡萄糖、蔗糖、乳糖）、玉米粉添加量（10g/L、20 g/L、40 g/L、60 g/L、80 g/L）、20 g/L氮源（牛肉膏、蛋白胨、豆餅粉、羅非魚粉、酵母粉、硫酸銨、干酪素）、牛肉膏添加量（5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L）、發(fā)酵時間（66 h、72h、78h、84h、90h、96h）、種齡（48h、54h、60h、66h、72h）、接種量（1%、3%、5%、7%、9%）、裝液量（50 mL/250 mL、60mL/250mL、70mL/250mL、80mL/250mL、100mL/250mL）對米曲霉液體發(fā)酵生產(chǎn)中性蛋白酶活性的影響。其中，在對某一因素水平進行探討時，先將其他因素固定在其最優(yōu)水平上，然后對目標因素進行考察[13]。

1.3.3 Plackett-Burman試驗

使用Design-Expert 7.0.0軟件進行Plackett-Burman試驗[14]。無機鹽是微生物生長和代謝不可或缺的重要成分，本實驗在查閱相關(guān)文獻的基礎(chǔ)上[15]，選取了MgSO4·7H2O、KCl、KNO3、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4·3H2O、（NH4）2SO4、ZnSO4、CaCl2這八種無機鹽作為影響因素進行全面考察。選擇試驗次數(shù) N=12及11因子試驗設(shè)計，以 X4、X8、X11作為空白用以估計實驗誤差，以 X1、X2、X3、X5、X6、X7、X9、X10分別代表MgSO4·7H2O、KCl、KNO3、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4·3H2O、（NH4）2SO4、ZnSO4、CaCl2添加量。 每個因素取高低2個水平，低水平為0，PB試驗因素與水平見表1。

表1 Plackett-Burman試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments

1.3.4 響應(yīng)面試驗優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗和Plackett-Burman試驗結(jié)果，確定了最佳的碳源、氮源和無機鹽，運用數(shù)據(jù)分析軟件Design-Expert 7.0.0中的中心組合設(shè)計（central composite design，CCD）法，以玉米粉添加量（A）、牛肉膏添加量（B）、氯化鈣添加量（C）為變量，設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面試驗，因素與水平設(shè)計見表2。

表2 響應(yīng)面試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface experiments g/L

中性蛋白酶酶活采用國標GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》[13]中的方法測定，其計算公式如下：

式中：OD600nm為樣品適當稀釋后酪氨酸吸光度值；K為吸光常數(shù)，即當吸光度值為1時的酪氨酸的量，97.01 μg；4為4 mL反應(yīng)液取出1 mL測定（即稀釋4倍）；N為發(fā)酵液稀釋的倍數(shù)；10為反應(yīng)時間，min。

中性蛋白酶活性定義：在40℃條件下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸，定義為1個中性蛋白酶活力單位，以U/mL表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 酪氨酸標準曲線的建立

以酪氨酸質(zhì)量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，繪制酪氨酸標準曲線，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，酪氨酸標準曲線回歸方程為y=0.010 1x+0.020 2（相關(guān)系數(shù)R2=0.999 26），表明二者呈良好的線性關(guān)系。根據(jù)酪氨酸標準曲線方程，計算發(fā)酵液中中性蛋白酶活性。

圖1 酪氨酸標準曲線Fig.1 Standard curve of tyrosine

2.2 碳源的篩選

在米曲霉初始發(fā)酵條件的基礎(chǔ)上，研究40g/L玉米粉、甘蔗渣、茶籽殼、紅薯粉、麩皮、淀粉、葡萄糖、蔗糖、乳糖對中性蛋白酶活性影響，結(jié)果見圖2。由圖2可知，茶籽殼作碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基得到的中性蛋白酶活性最低，而用玉米粉和蔗糖兩種碳源獲得的中性蛋白酶活性較高。其中，玉米粉發(fā)酵得到的中性蛋白酶活性最高，達到了21.4 U/mL，又由于玉米粉的價格便宜，性價比高，所以選擇玉米粉為最佳碳源。

圖2 不同碳源對中性蛋白酶活性的影響Fig.2 Effects of different carbon sources on neutral protease activity

圖3 玉米粉添加量對中性蛋白酶活性的影響Fig.3 Effect of corn flour addition on neutral protease activity

玉米粉添加量對中性蛋白酶活性的影響見圖3。由圖3可知，以不同質(zhì)量濃度的玉米粉為碳源，配制發(fā)酵培養(yǎng)基，隨著玉米粉質(zhì)量濃度的增大，中性蛋白酶活性先增后減。而且由圖3中不難看出玉米粉添加量的不同對中性蛋白酶活性的影響較大，10 g/L和40 g/L的玉米粉添加量得到的中性蛋白酶活性都在20 U/mL左右，但20 g/L的玉米粉添加量最后得到的酶活卻最高，為32.9 U/mL，提高了約1/3。因此，選擇玉米粉添加量為20 g/L。

2.3 氮源的篩選

在米曲霉初始發(fā)酵條件的基礎(chǔ)上，固定玉米粉添加量為20 g/L，研究20 g/L牛肉膏、蛋白胨、豆餅粉、羅非魚粉、酵母粉、硫酸銨、干酪素對中性蛋白酶活性影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知，以硫酸銨為無機氮源獲得的中性蛋白酶活性很低，而以有機氮源牛肉膏、蛋白胨、豆餅粉、羅非魚粉等發(fā)酵得到的中性蛋白酶活性都較高，說明米曲霉液體發(fā)酵使用有機氮源比無機氮源好。而且以牛肉膏為有機氮源獲得的中性蛋白酶活性最高，所以選擇最佳氮源為牛肉膏。

圖4 不同氮源對中性蛋白酶活性的影響Fig.4 Effects of different nitrogen sources on neutral protease activity

圖5 牛肉膏添加量對中性蛋白酶活性的影響Fig.5 Effect of beef extract addition on neutral protease activity

牛肉膏添加量對中性蛋白酶活性的影響見圖5。由圖5可知，當牛肉膏添加量＞15 g/L時，中性蛋白酶活性逐漸降低，20 g/L牛肉膏添加量得到的中性蛋白酶活性只有24.7 U/mL，降低了約40%，這可能是因為過多的氮源用于菌體生長，產(chǎn)中性蛋白酶少；而牛肉膏添加量為5～15 g/L時，中性蛋白酶活性隨牛肉膏添加量的增加而增大；當牛肉膏添加量為15g/L時，中性蛋白酶活性最大為40.8U/mL。因此，選擇牛肉膏添加量為15 g/L。

2.4 其他培養(yǎng)條件對中性蛋白酶活性的影響

在確定了米曲霉液體發(fā)酵的碳源、氮源及其添加量的基礎(chǔ)上，以20 g/L玉米粉為碳源，15 g/L牛肉膏為氮源，研究其他培養(yǎng)條件（發(fā)酵時間、種齡、接種量、裝液量）對中性蛋白酶活性的影響，單因素試驗結(jié)果見圖6。由圖6a可知，發(fā)酵時間過短，則發(fā)酵不完全，中性蛋白酶活性較低；發(fā)酵時間過長，則菌體自溶，消耗了大部分中性蛋白酶；當發(fā)酵時間為72～84 h時，中性蛋白酶活性較大，最佳發(fā)酵時間為84 h。由圖6b可知，當米曲霉的種齡為48～60 h時，中性蛋白酶活性較大，說明該時段的菌體細胞達到了對數(shù)生長期，活力旺盛，產(chǎn)中性蛋白酶能力強，最佳種齡為54 h。由圖6c可知，添加3%～7%種子液的發(fā)酵培養(yǎng)基中性蛋白酶活性較大，說明該接種量的菌體恰好能利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)中性蛋白酶，既不會造成營養(yǎng)富集，也不會造成營養(yǎng)不夠，最佳接種量為5%。由圖6d可知，裝液量過高，則溶氧較少，不能滿足菌體生長；裝液量過低，則溶氧豐富，營養(yǎng)成分被大量用于菌體自身生長繁殖，產(chǎn)中性蛋白酶少；最佳裝液量為60 mL/250 mL，中性蛋白酶活性達到最大53.6 U/mL。

圖6 不同培養(yǎng)條件對中性蛋白酶活性的影響Fig.6 Effect of different culture conditions on neutral protease activity

2.5 無機鹽的篩選

8種無機鹽的Plackett-Burman試驗結(jié)果與分析見表3，各因素主效應(yīng)分析結(jié)果見表4。由表4可知，Prob＞F值大于0.1表示該因子不顯著，應(yīng)該舍去；該模型的Prob＞F值0.029 7＜0.05，表示該模型是顯著的。其中CaCl2的Prob＞F值為0.005 9，是所有八種無機鹽中最小的，所以氯化鈣是對中性蛋白酶活性影響最顯著的無機鹽。然而卻觀察到CaCl2對中性蛋白酶活性有相對較大的負影響，可能是高濃度的CaCl2造成米曲霉細胞膜內(nèi)外滲透壓失去平衡，使米曲霉失活，抑制了米曲霉液體發(fā)酵生產(chǎn)中性蛋白酶的能力。

表3 Plackett-Burman試驗結(jié)果Table 3 Results of Plackett-Burman experiments

表4 各因素主效應(yīng)分析結(jié)果Table 4 Analytic results of main effects of each factor

添加CaCl2對中性蛋白酶活性作用明顯，這可能是因為大多數(shù)微生物中性蛋白酶是含有金屬元素的，部分酶蛋白含有一分子鈣，起著酶同底物之間的橋梁作用，所以適宜的鈣離子濃度能增加中性蛋白酶的穩(wěn)定性[16]。進一步考察氯化鈣添加量（0、0.01 g/L、0.06 g/L、0.12 g/L、0.18 g/L、0.24 g/L）對中性蛋白酶活性影響，結(jié)果見圖7。由圖7可知，添加CaCl2的發(fā)酵培養(yǎng)基中性蛋白酶活性比未添加的高，當氯化鈣添加量為0.06 g/L時，中性蛋白酶活性達到了最高的83.5 U/mL，較之前單因素試驗結(jié)果最好的53.6 U/mL提高了約56%，再繼續(xù)添加氯化鈣，則中性蛋白酶活性降低。因此，本次實驗選擇氯化鈣添加量為0.06 g/L。

圖7 氯化鈣添加量對中性蛋白酶活性的影響Fig.7 Effect of calcium chloride addition on neutral protease activity

2.6 響應(yīng)面試驗結(jié)果分析

根據(jù)單因素試驗和Plackett-Burman設(shè)計結(jié)果，可明顯看出，玉米粉添加量（A）、牛肉膏添加量（B）和氯化鈣添加量（C）3個因素對中性蛋白酶活性的影響最大。所以，采用響應(yīng)面試驗中的中心組合設(shè)計（CCD）法對玉米粉添加量、牛肉膏添加量和氯化鈣添加量進行3因素3水平優(yōu)化，以中性蛋白酶活性（Y）為響應(yīng)值，響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果見表5?；貧w模型的方差分析結(jié)果見表6。

表5 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 5 Design and results of response surface experiments

利用Design-Expert7.0.0對表5結(jié)果進行擬合，得到以中性蛋白酶活性Y為響應(yīng)值，對自變量玉米粉添加量、牛肉膏添加量和氯化鈣添加量3個因素的多元二次回歸方程回為：Y=325.293 57+0.048 720A-9.755 49B-5 281.431 65C+0.056 750AB+76.812 50AC+151.875 00BC-0.109 48A2-0.162 85B2+9 664.753 57C2。

表6 回歸模型方差分析Table 6 Variance analysis of regression model

由表6可知，回歸模型P值＜0.000 1，說明該回歸模型具有顯著性；失擬項P值為0.069 3＞0.05，不顯著，說明回歸擬合的情況較好，模型復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.944 7，表示有94.47%的響應(yīng)值變化可用該模型來解釋，說明試驗可靠性較高，可以用其進行米曲霉液體發(fā)酵生產(chǎn)中性蛋白酶的活性預(yù)測和分析。對回歸方程各項的方差分析結(jié)果表明，方程的一次項A、B，交互項AC、BC及二次項A2的P值均＜0.01，極顯著，一次項C是顯著的（P＜0.05），而交互項AB不顯著（P＞0.05）。各因素對中性蛋白酶活性影響依次為B（牛肉膏添加量）＞A（玉米粉添加量）＞C（氯化鈣添加量）。

為進一步直觀分析響應(yīng)面優(yōu)化效果，根據(jù)回歸模型繪制各因素交互作用對中性蛋白酶活性影響的響應(yīng)曲面和等高線圖，結(jié)果見圖8。響應(yīng)面及其等高線的形狀可直觀反⒊各因素間的交互作用對中性蛋白酶活性的影響[17]。玉米粉添加量和牛肉膏添加量對中性蛋白酶活性影響的的交互作用不顯著；表明玉米粉添加量和氯化鈣添加量對中性蛋白酶活性影響的交互作用極顯著；牛肉膏添加量和氯化鈣添加量對中性蛋白酶活性影響的的交互作用較顯著。且它們對響應(yīng)值的交互影響顯著性為：AC＞BC＞AB。

通過對模型分析確定米曲霉液體發(fā)酵生產(chǎn)中性蛋白酶的最優(yōu)條件為玉米粉添加量16.85g/L，牛肉膏添加量10g/L，氯化鈣添加量0.04g/L。此條件下中性蛋白酶活性的理論值為107.48 U/mL。根據(jù)所得的最優(yōu)條件進行3組平行試驗進行驗證。為方便實際操作，將上述最優(yōu)條件簡化為玉米粉添加量17g/L，牛肉膏添加量10g/L，氯化鈣添加量0.04 g/L，得到的中性蛋白酶活性為110.5 U/mL，此結(jié)果與最優(yōu)條件下所得的結(jié)果相差不大。由此可見，采用響應(yīng)面法對米曲霉液體發(fā)酵生產(chǎn)中性蛋白酶工藝進行優(yōu)化是有效的。

圖8 玉米粉添加量、牛肉膏添加量和氯化鈣添加量交互作用對中性蛋白酶活性影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig．8 Response surface plots and contour line of effects of interaction between corn flour addition，beef extract addition and calcium chloride addition on neutral protease activity

3 結(jié)論

本研究通過單因素試驗、Plackett-Burman試驗和響應(yīng)面法優(yōu)化得到米曲霉液體發(fā)酵生產(chǎn)中性蛋白酶的最優(yōu)條件為：玉米粉添加量17 g/L，牛肉膏添加量10 g/L，氯化鈣添加量0.04 g/L，接種量5%，裝液量60 mL/250 mL，于30℃條件下發(fā)酵84 h。在此條件下，中性蛋白酶活性從最初的21.4 U/mL提高至110.5 U/mL。結(jié)果表明，響應(yīng)面法優(yōu)化米曲霉液體發(fā)酵生產(chǎn)中性蛋白酶的工藝條件是合理可靠的，本實驗?zāi)転檫M一步的液體發(fā)酵生產(chǎn)中性蛋白酶研究提供一定的理論依據(jù)。

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Optimization of liquid-state fermentation conditions for production of neutral protease by Aspergillus oryzaewith response surface methodology

WANG Hao1,LU Ziying1,TAN Yingsi1,LIU Fang1,DING Lijun1*,LIU Dan1,LAN Dean2
（1.School of Chemical Engineering and Light Industry,Guangdong University of Technology,Guangzhou 510006,China;2.Guangzhou Huaqi Biological Science and Technology Co.,Ltd.,Guangzhou 510250,China）

To improve the neutral protease-producing ability ofAspergillus oryzaewith liquid-state fermentation,the carbon source,nitrogen source and inorganic salts were screened by single factor tests and Plackett-Burman （PB）experiments.The optimum formulas were optimized by response surface methodology to improve the activity of neutral protease in the production ofA.oryzaefermentation.The results showed that the optimum carbon source,nitrogen source and inorganic salts were corn flour,beef extract and calcium chloride,respectively.The optimum fermentation conditions were corn flour 17 g/L,beef extract 10 g/L,calcium chloride 0.04 g/L,inoculum 5%,liquid volume 60 ml/250 ml,fermentation temperature 30℃and time 84 h.Under the conditions,the activity of neutral protease increased from 21.4 U/ml to 110.5 U/ml.

Aspergillus oryzae;liquid-state fermentation;neutral protease;Plackett-Burman experiments;response surface methodology

TS201.3

0254-5071（2017）12-0040-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.12.009

2017-10-12

廣東省教育部產(chǎn)學(xué)研合作重大專項項目（2013A090100009）

王 浩（1994-），男，碩士研究生，研究方向為微生物發(fā)酵。

*通訊作者：丁利君（1965-），女，教授，碩士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工與天然產(chǎn)物化學(xué)。