呂天琪，杜 超，曹小彥，王海鳴，錢 和*

（1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.廣州廣電計(jì)量檢測股份有限公司，廣東 廣州 510000）

鎖擲酵母破壁技術(shù)的研究

呂天琪1，杜 超1，曹小彥2，王海鳴2，錢 和1*

（1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.廣州廣電計(jì)量檢測股份有限公司，廣東 廣州 510000）

分析比較了酸熱法、二甲基亞砜法、細(xì)胞自溶法、高壓均質(zhì)法及酶促法對(duì)鎖擲酵母的破壁效果，及對(duì)類胡蘿卜素提取率的影響。結(jié)果表明，與其他4種破壁方法相比，高壓均質(zhì)法具有破壁效果好（破壁率達(dá)72.4%）、類胡蘿卜素提取率高（67.3%）、破壁時(shí)間短、工藝簡單、安全無污染等優(yōu)點(diǎn)。通過均質(zhì)壓力、均質(zhì)次數(shù)和菌液濃度這3個(gè)因素對(duì)高壓均質(zhì)法進(jìn)行工藝優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)均質(zhì)壓力80 MPa、均質(zhì)3次、菌液濃度為8%時(shí)，細(xì)胞破壁及類胡蘿卜素提取效果最佳，分別是78.3%和82.5%。該研究結(jié)果為鎖擲酵母的開發(fā)利用及類胡蘿卜素的提取提供了理論依據(jù)及技術(shù)支持。

鎖擲酵母；細(xì)胞破壁；高壓均質(zhì)；工藝優(yōu)化

類胡蘿卜素具有預(yù)防癌癥和心血管疾病等多種生理功能，目前已廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中[1-2]。動(dòng)物體內(nèi)無法合成類胡蘿卜素，必須通過食物來攝入，植物中的類胡蘿卜素含量低，難以大規(guī)模生產(chǎn)，而化學(xué)合成的類胡蘿卜素生物活性較低[3]。酵母培養(yǎng)時(shí)間較短、異氧代謝快速且易于實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)，因而利用酵母工業(yè)化生產(chǎn)天然類胡蘿卜素一直是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，有廣泛的實(shí)用價(jià)值和開發(fā)前景[4]。當(dāng)前，鎖擲酵母屬（Sporidiololus）、紅酵母屬（Rhodotorula）、法夫酵母屬（Phaffia）、紅冬孢酵母屬（Rhodosporidium）、擲孢酵母屬（Sporobolomyces）和三孢布拉霉（blakeslea trispora）等是生產(chǎn)天然類胡蘿卜素的主要菌種[5-8]。

但是類胡蘿卜素是鎖擲酵母的胞內(nèi)產(chǎn)物，破壁后才能被加以利用，所以破壁效果直接影響到鎖擲酵母生產(chǎn)類胡蘿卜素的產(chǎn)量和質(zhì)量[9]。酵母細(xì)胞除了含類胡蘿卜素外，還含有豐富的人體必需氨基酸、B族維生素、不飽和脂肪酸等營養(yǎng)物質(zhì)[10]。因此，為充分利用酵母細(xì)胞內(nèi)豐富的營養(yǎng)資源，研究鎖擲酵母的高效破壁方法尤為重要，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。目前已被應(yīng)用于酵母破壁的方法有物理[11]、化學(xué)[12]及生物破壁[13-16]等方法。本研究以一株自行分離的鎖擲酵母為試驗(yàn)材料，比較酸熱法、二甲亞砜法、細(xì)胞自溶法、高壓均質(zhì)法及酶促法的破壁效果，選擇一種工藝簡單、安全衛(wèi)生、破壁效果好、類胡蘿卜素保留率高的破壁方法，并對(duì)其工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為將來高效利用鎖擲酵母提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鎖擲酵母（Sporidiobolus pararoseus）JD-2-8：由本實(shí)驗(yàn)室篩選而得；濃鹽酸、二甲亞砜、氯化鈉、丙酮（分析純）：國藥上?；瘜W(xué)試劑有限公司；堿性蛋白酶：美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JHG-Q54-P100高壓均質(zhì)機(jī)：上海普麗盛融合機(jī)械設(shè)備有限公司；XSP-2C生物光學(xué)顯微鏡：蘇州歐卡精密光學(xué)儀器有限公司；XB-K-25血細(xì)胞計(jì)數(shù)板：上海求精生化試劑儀器有限公司；AB204-N電子天平：Mettler-Toledo Group；centrifugae5804R離心機(jī)：德國Eppendorf AG；ZNCL-GS智能磁力攪拌器：鄭州科華儀器設(shè)備有限公司；HWS-24電熱恒溫水浴鍋：上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；WFJ7200可見分光光度計(jì)：龍尼柯上海儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理方法

酸熱法：取發(fā)酵液10 mL，8 000 r/min離心10 min，收集菌泥，用去離子水清洗2～3遍，加入等體積的3 mol/L鹽酸室溫浸泡1 h，沸水浴加熱3 min，迅速進(jìn)行冰浴，冷卻后離心（4 000 r/min、5 min），洗滌沉淀2次，加入足量丙酮振蕩萃取20 min，得類胡蘿卜素浸提液。

二甲亞砜法：取發(fā)酵液10 mL，8 000 r/min離心10 min；棄上清，加入30 mL預(yù)熱至55℃的二甲基亞砜，在磁力攪拌器上55℃攪拌5 h；4 000 r/min離心10 min，洗滌沉淀2次，加足量丙酮振蕩萃取20 min，得類胡蘿卜素浸提液。

細(xì)胞自溶法：在50 mL發(fā)酵液中加入4 g無菌NaCl，40℃、100r/min搖床中自溶72 h；取10 mL自溶后的發(fā)酵液，4 000 r/min離心10 min，洗滌沉淀2次，用足量丙酮振蕩萃取20 min，得類胡蘿卜素浸提液。

高壓均質(zhì)法：發(fā)酵液在60 MPa的壓力下，連續(xù)高壓均質(zhì)3次，均質(zhì)流速為250 mL/min；取10 mL高壓均質(zhì)后的發(fā)酵液，4000r/min離心10min，洗滌沉淀2次后加入足量丙酮振蕩萃取相同時(shí)間（20 min），得類胡蘿卜素浸提液。

酶促法：在發(fā)酵液中，按4 mg/g酵母干質(zhì)量的添加量加入堿性蛋白酶，用NaOH溶液將pH值調(diào)至10.0；于37℃酶解9 h，煮沸5 min滅酶活，取10 mL酶解后的發(fā)酵液，4 000 r/min離心10 min，洗滌沉淀后加足量丙酮振蕩萃取20 min，得類胡蘿卜素浸提液。

1.3.2 工藝優(yōu)化試驗(yàn)方案

以鎖擲酵母細(xì)胞破壁率及類胡蘿卜素提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選取菌液濃度、均質(zhì)壓力和均質(zhì)次數(shù)為評(píng)價(jià)因素，優(yōu)化高壓均質(zhì)法的工藝條件。首先考察單個(gè)因素的影響，找到3個(gè)因素的影響規(guī)律及優(yōu)化范圍。隨后根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步采用3因素3水平正交試驗(yàn)對(duì)均質(zhì)條件進(jìn)行優(yōu)化。正交試驗(yàn)的因素水平見表1。

表1 鎖擲酵母破壁工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for Sporidiobolus pararoseuscell wall breaking process optimization

1.3.3 測定方法

酵母破壁率：破壁前鎖擲酵母菌液取樣稀釋，在生物學(xué)顯微鏡下觀察血球計(jì)數(shù)板上所有酵母細(xì)胞個(gè)數(shù)C。不同方法破壁后，取樣稀釋后在顯微鏡下觀察血球計(jì)數(shù)板上未破壁的酵母細(xì)胞個(gè)數(shù)C’[17]。采用XB-K-25血球計(jì)數(shù)板，每個(gè)樣品重復(fù)計(jì)數(shù)3次，每次數(shù)值差距不應(yīng)相差過大，取平均值。破壁率計(jì)算公式：

式中：B為破壁率，%；C為破壁前的酵母細(xì)胞數(shù)（相同稀釋倍

數(shù)）；C’為破壁后未破壁的酵母細(xì)胞數(shù)（相同稀釋倍數(shù)）。

類胡蘿卜素提取率：取不同方法破壁后丙酮萃取得到的類胡蘿卜素浸提液，稀釋相同倍數(shù)后，測定吸光度值，總類胡蘿卜素含量計(jì)算公式如下：

式中：W為總類胡蘿卜素含量，μg/g干質(zhì)量；A為波長475 nm處的吸光度值；m為細(xì)胞干質(zhì)量，g；D為稀釋倍數(shù)；V為提取類胡蘿卜素丙酮總體積，mL；0.16為類胡蘿卜素的消光系數(shù)。

用珠磨法[18]將離心后的酵母細(xì)胞完全破壁，測得破壁前的總類胡蘿卜素含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酵母破壁方法比較

2.1.1 不同酵母破壁方法破壁率的比較

圖1 不同破壁方法對(duì)破壁率的影響Fig.1 Effects of different methods on wall breaking rate

由圖1可知，酸熱法的破壁效果最佳，破壁率約為99.9%，說明酵母細(xì)胞壁破碎完全。高壓均質(zhì)法和二甲基亞砜法次之，破壁率分別為72.4%和51.6%，但是二甲基亞砜破壁需5 h，消耗時(shí)間過長。酶促法破壁率較低，為19.5%，可能是僅使用了蛋白酶，沒有破壞細(xì)胞壁外層的葡聚糖和甘露聚糖網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致效果不佳。細(xì)胞自溶法的破壁率最低，僅為1.3%，表明酵母細(xì)胞壁幾乎沒有破碎。

2.1.2 不同酵母破壁方法類胡蘿卜素提取率的比較

圖2 不同破壁方法對(duì)類胡蘿卜素提取率的影響Fig．2 Effects of different methods on carotenoid extraction rate

不同破壁方法對(duì)類胡蘿卜素提取率的影響見圖2。由圖2可知，高壓均質(zhì)法破壁后類胡蘿卜素提取率最高，達(dá)到67.3%，說明細(xì)胞壁破碎較完全，類胡蘿卜素?fù)p失較少；二甲亞砜法效果次之，類胡蘿卜素提取率為50.1%，推測是由于破壁時(shí)間過長，類胡蘿卜素被氧化損失；酸熱法的類胡蘿卜素提取率僅為52.3%，推測高溫使類胡蘿卜素發(fā)生了氧化反應(yīng)，在加熱過程中造成大量的損失。此外，在試驗(yàn)條件下，細(xì)胞自溶法破壁后，沒有提取到類胡蘿卜素。

綜合上述試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酸熱法破壁雖高，但高溫容易使類胡蘿卜素發(fā)生氧化反應(yīng)，在破壁過程中造成過多的類胡蘿卜素?fù)p失，導(dǎo)致類胡蘿卜素提取率較低。二甲基亞砜法消耗時(shí)間較長，在此過程中類胡蘿卜素已被氧化，且二甲基亞砜沸點(diǎn)較高難回收，不能用于食品中，故此法只能用于試驗(yàn)室研究，無法應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。用酶促法破壁時(shí)，存在產(chǎn)物抑制的問題，導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)釋放率降低，同時(shí)酶法破壁相對(duì)成本較高，試驗(yàn)結(jié)果也不理想。鎖擲酵母細(xì)胞壁過厚，細(xì)胞自溶法不適用于鎖擲酵母的破壁。而高壓均質(zhì)法破壁效果好、類胡蘿卜素提取率高，且操作簡單、耗時(shí)短，類胡蘿卜素?fù)p失較少，不會(huì)造成有機(jī)溶劑的污染，是鎖擲酵母細(xì)胞破壁最理想的方法。

2.2 高壓均質(zhì)法工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

根據(jù)工業(yè)化要求和設(shè)備的限制，均質(zhì)壓力不宜過大，均質(zhì)次數(shù)不宜太多，物料濃度不宜過高，故均質(zhì)壓力取40～100 MPa，均質(zhì)次數(shù)取1～6次，菌液濃度取1%～10%進(jìn)行單因素試驗(yàn)，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，隨著均質(zhì)壓力的增大，酵母破壁類胡蘿卜素提取率先升高后降低，在均質(zhì)壓力為80 MPa時(shí)達(dá)到最大，因此選擇均質(zhì)壓力70 MPa、80 MPa、90 MPa進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)；隨著均質(zhì)次數(shù)的增加，類胡蘿卜素提取率先升高后降低，均質(zhì)次數(shù)為3次時(shí)，類胡蘿卜素提取率最高，破壁率持續(xù)升高，但超過3次后破壁率增長趨勢平緩，說明再增加均質(zhì)次數(shù)對(duì)破壁率的影響很小，而且還會(huì)造成類胡蘿卜素的損失，故選擇優(yōu)化范圍取2次、3次、4次；隨著酵母菌液濃度的增大，酵母細(xì)胞的破壁率先增加后減小，在6%濃度時(shí)破壁率最大，類胡蘿卜素提取率持續(xù)升高，但菌液濃度超過6%后，類胡蘿卜素提取率增長緩慢，故選擇優(yōu)化范圍為4%、6%、8%。

圖3 均質(zhì)壓力（A）、均質(zhì)次數(shù)（B）、菌液濃度（C）對(duì)破壁率和類胡蘿卜素提取率的影響Fig．3 Effect of homogenization pressure （A），times （B）and bacteria concentration （C）on wall breaking rate and carotenoid extraction

2.3 正交優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，考察均質(zhì)壓力、均質(zhì)次數(shù)、菌液濃度對(duì)酵母細(xì)胞破壁率及類胡蘿卜素提取率的影響，結(jié)果見表2，方差分析見表3和表4。

由表2～表4可知，影響酵母細(xì)胞破壁率的因素主次為均質(zhì)壓力＞均質(zhì)次數(shù)＞菌液濃度，最佳工藝參數(shù)組合為A3B3C3，即均質(zhì)壓力為90 MPa、均質(zhì)次數(shù)4次、菌液濃度為8%的工藝條件，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)得到酵母細(xì)胞破壁率為88.5%，類胡蘿卜素提取率為65.3%。在置信度為95%條件下，均質(zhì)壓力、均質(zhì)次數(shù)對(duì)酵母細(xì)胞破壁率的影響達(dá)到顯著效果，而菌液濃度無顯著性。影響酵母細(xì)胞破壁后類胡蘿卜素提取率的因素主次為均質(zhì)壓力＞菌液濃度＞均質(zhì)次數(shù)，最佳的工藝參數(shù)組合為A2B2C3，即均質(zhì)壓力為80 MPa、均質(zhì)次數(shù)為3次、菌液濃度為8%，在此條件下得到酵母細(xì)胞破壁率為78.3%，類胡蘿卜素提取率為82.5%。在置信度為95%條件下，3個(gè)因素對(duì)類胡蘿卜素提取率的影響均達(dá)到顯著效果。鑒于實(shí)際生產(chǎn)中主要注重于類胡蘿卜素的提取率，故選擇A2B2C3為最佳工藝參數(shù)，即均質(zhì)壓力為80MPa、均質(zhì)次數(shù)為3次、菌液濃度為8%。

表2 鎖擲酵母進(jìn)行破壁工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for Sporidiobolus pararoseuscell wall breaking process optimization

表3 以破壁率為評(píng)價(jià)指標(biāo)的正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments using wall breaking rate as evaluation index

表4 以類胡蘿卜素提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)的正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments using carotenoid extraction rate as evaluation index

3 結(jié)論

鎖擲酵母細(xì)胞壁比一般紅酵母更厚，更堅(jiān)實(shí)，目前常用于紅酵母破壁的方法難以將鎖擲酵母破壁，而且當(dāng)前對(duì)鎖擲酵母破壁方法的研究鮮有報(bào)道。為更好地利用鎖擲酵母的發(fā)酵產(chǎn)物，本試驗(yàn)以酵母細(xì)胞破壁率和類胡蘿卜素提取率為考察指標(biāo)，對(duì)鎖擲酵母破壁工藝進(jìn)行研究，比較幾種破壁方法后發(fā)現(xiàn)高壓均質(zhì)法破壁率高，類胡蘿卜素提取率高，破壁時(shí)間短，工藝簡單并且安全無污染，是最適合大規(guī)模地從鎖擲酵母中提取類胡蘿卜素的破壁方法。并且確定了最佳工藝條件：菌液濃度8%、均質(zhì)壓力80 MPa、均質(zhì)次數(shù)3次，在此條件下鎖擲酵母破壁率和類胡蘿卜素提取率分別達(dá)到了78.3%和82.5%，為鎖擲酵母發(fā)酵產(chǎn)物的后續(xù)研究提供了技術(shù)支撐，對(duì)鎖擲酵母工業(yè)化生產(chǎn)天然類胡蘿卜素具有指導(dǎo)意義。

[1]王歲樓，步 芬.紅酵母發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素[J].食品研究與開發(fā)，2010，31（12）：250-255.

[2]鈕亭亭，孫茜萍，吳 濤.酵母生產(chǎn)類胡蘿卜素的研究進(jìn)展[J].發(fā)酵科技通訊，2017，46（1）：50-53.

[3]張 闖，何連芳，張玉蒼.紅酵母類胡蘿卜素的分離與鑒定[J].飼料研究，2011（1）：37-39.

[4]施秋妤.鎖擲酵母圓酵母素的分離鑒定及生物活性研究[D].無錫：江南大學(xué)，2014.

[5]BHOSALE P,GADRE R V.Manipulation of temperature and illumination conditions for enhanced beta-carotene production by mutant 32 of Rhodotorula glutinis[J].Lett Appl Microbiol,2002,34（5）:349-353.

[6]BHOSALE P,GADRE R V.β-Carotene production in sugarcane molasses by aRhodotorula glutinismutant[J].J Ind Microbiol Biotechnol,2001,26（6）:327-332.

[7]BUZZINI P.Batch and fed-batch carotenoid production byRhodotorula glutinis-Debaryomyces castelliico-cultures in corn syrup[J].J Appl Microbiol,2001,90（5）:843-847.

[8]DAVOLI P,MIERAU V,WEBER R S.Carotenoids and fatty acids in red yeastsSporobolomyces roseusandRhodotorula glutinis[J].Appl Biochem Microbiol,2004,40（4）:392-397.

[9]孫錫鳳，蔣萬春.紅酵母在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].飼料研究，2014（15）：1-5.

[10]高 娜，馬 雪，李瑞萍.一種紅酵母的破壁方法，CN103642693A[P].2014-03-19.

[11]楊翠竹，李 艷，阮 南，等.酵母細(xì)胞破壁技術(shù)研究與應(yīng)用進(jìn)展[J].食品科技，2006，31（7）：138-142.

[12]李慧翔，倪 輝，黃高凌，等.破壁方法和溶劑對(duì)法夫酵母提取物抗氧化活性的影響[J].中國食品學(xué)報(bào)，2015，15（6）：76-82.

[13]談曙明，張 磊，繆鑫昕，等.多形漢遜酵母破壁抽提的研究[J].中國釀造，2012，31（1）：23-25.

[14]孫海翔，尹卓容，馬美范.高壓均質(zhì)破碎啤酒酵母細(xì)胞壁的研究[J].食品工業(yè)科技，2002，23（2）：66-67.

[15]郝建華，王躍軍，劉均忠，等.海洋活性酵母YS-185破壁技術(shù)的研究[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011（19）：89-90，91.

Breaking technology ofSporidiobolus pararoseuscell wall

LYU Tianqi1,DU Chao1,CAO Xiaoyan2,WANG Haiming2,QIAN He1*
（1.School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2.Guangzhou Grg Metrology&Test Co.,Ltd.,Guangzhou 510000,China）

Sporidiobolus pararoseuswas broken by five different technologies:acid heat method,dimethyl sulfoxide method,cell autolysis method,high pressure homogenization method and enzymatic method.The effect of different methods on cell-breaking and carotenoid extraction rate was analyzed and compared.Results showed that among the five breaking methods,the high pressure homogenization method had advantages of better breaking effect（wall breaking rate of 72.4%）,higher carotenoid extraction rate （67.3%）,short-time,simple process,safe and pollution-free and so on.The factors of homogenization pressure,homogenization times and microbial concentration of high pressure homogenization method were optimized,and results showed under the conditions of homogenization pressure 80 MPa,times 3 and bacterial concentration 8%,the cell wall breaking rate and the carotenoid extraction rate were 78.3%and 82.5%,respectively.The study provided theoretical basis and technical support for the development and utilization ofS.pararoseusand the extraction of carotenoids.

Sporidiobolus pararoseus;cell wall breaking;high homogenization;process optimization

TS201.1

0254-5071（2017）12-0088-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.12.018

2017-10-09

呂天琪（1994-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)與工程。

*通訊作者：錢 和（1962-），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩c質(zhì)量控制。