萬(wàn)偉建，段 超，孫怡然，段學(xué)輝*

（南昌大學(xué) 食品學(xué)院 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

耦合吸附樹(shù)脂對(duì)細(xì)胞酶法合成谷胱甘肽的影響

萬(wàn)偉建，段 超，孫怡然，段學(xué)輝*

（南昌大學(xué) 食品學(xué)院 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

通過(guò)靜態(tài)吸附-解吸試驗(yàn)從3種吸附樹(shù)脂中篩選出最適合分離谷胱甘肽（GSH）的樹(shù)脂，將其與酵母滲透細(xì)胞耦合，通過(guò)補(bǔ)加前體物質(zhì)，酶法合成GSH。結(jié)果表明，在試驗(yàn)的3種樹(shù)脂中，D301吸附效果最佳。采用單因素和正交試驗(yàn)法，確定酶法合成GSH的優(yōu)化工藝為：反應(yīng)2.0 h后添加樹(shù)脂2.0 g/10 mL，反應(yīng)3.0 h時(shí)補(bǔ)加60%初始濃度的前體物質(zhì)，最終得到GSH產(chǎn)量1 154 mg/L，與未添加樹(shù)脂和前體合成法相比GSH產(chǎn)量提高77.5%。

谷胱甘肽；樹(shù)脂；酶法合成；吸附

谷胱甘肽（glutathione，GSH）作為一種同時(shí)含有γ-谷氨酰基和巰基的活性多肽化合物[1-2]，具有抗氧化、解毒和維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)等生理功能[3-5]，在醫(yī)療[6-7]、食品[8]及化妝品行業(yè)[9]需求在逐年增長(zhǎng)[10]。目前，工業(yè)生產(chǎn)GSH主要采用液體發(fā)酵和酶法合成。酶法合成GSH是利用細(xì)胞自身γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶以及谷胱甘肽合成酶，在反應(yīng)體系中添加前體氨基酸、能量及輔助因子合成GSH，具有專一性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和及前體轉(zhuǎn)化率高等優(yōu)點(diǎn)[11-12]，但GSH合成酶系受到終產(chǎn)物的反饋抑制[13]，使GSH合成效率及前體轉(zhuǎn)化率不高，進(jìn)而影響GSH終產(chǎn)量[14]。

大孔吸附樹(shù)脂是一類不含交換基團(tuán)且有大孔結(jié)構(gòu)的高分子吸附樹(shù)脂，具有良好的大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和較大的比表面積，可選擇吸附水溶液中各類有機(jī)物，起到分離純化作用。樹(shù)脂吸附量大，易解吸，再生簡(jiǎn)便且選擇性良好，工藝成熟[15]。LIU S R等[16]通過(guò)采用吸附樹(shù)脂D-152，吸附分離發(fā)酵液產(chǎn)物ε-聚賴氨酸，將產(chǎn)量由0.8 g/L提升至2.9 g/L。

酵母細(xì)胞生長(zhǎng)速度快，合成產(chǎn)物能力穩(wěn)定，是生物合成的優(yōu)勢(shì)菌。通過(guò)物理、化學(xué)和基因調(diào)控的方法，可改變細(xì)胞通透性，降低或解除反饋抑制，達(dá)到高產(chǎn)的目的。LI W等[17]利用凍融法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行滲透處理，改變了細(xì)胞通透性，使GSH產(chǎn)量達(dá)到3.4 g/L。倪曄等[18]采用十六烷基三甲基溴化銨對(duì)酵母細(xì)胞通透性處理20 min后，可將全細(xì)胞酶活提高2倍以上。PLOKHOV A Y等[19]在53℃高溫處理表達(dá)谷氨酸脫羧酶的基因工程菌1 h，提高工程菌通透性，使菌體催化活力提高3倍。

本試驗(yàn)采用酵母滲透細(xì)胞耦合吸附樹(shù)脂法，從反應(yīng)液中分離終產(chǎn)物GSH，減少反饋抑制，促進(jìn)酶反應(yīng)正向進(jìn)行，簡(jiǎn)化下游分離過(guò)程，通過(guò)前體物質(zhì)補(bǔ)加提高GSH產(chǎn)量，提高GSH酶法合成效率，以期為酶法合成GSH工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

絮凝酵母（Saccharomyces cerevisiae）：南昌大學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

D001型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂、D301型陰離子交換樹(shù)脂、001x7型強(qiáng)酸陽(yáng)離子交換樹(shù)脂：江蘇蘇青水處理工程集團(tuán)有限公司；還原型谷胱甘肽（純度98%）、L-谷氨酸（L-glutamic acid，L-Glu）、L-半胱氨酸（L-cysteine，L-Cys）、L-甘氨酸（L-glycine，L-Cly）：阿拉丁試劑有限公司；四氧嘧啶（純度為98%）：上海麥克林生化試劑有限公司；葡萄糖（分析純）、六水合氯化鎂（分析純）、磷酸二氫鉀（分析純）：汕頭市西隴化工股份有限公司；其他試劑皆為國(guó)產(chǎn)分析純。

滲透溶液：準(zhǔn)確稱量2g十二烷基硫酸鈉（sodiumdodecyl sulfate，SDS），蒸餾水溶解配制成1 L溶液。

酶反應(yīng)液：以pH7.0磷酸緩沖液配制，L-Glu30mmol/L，L-Cys 15 mmol/L，L-Gly 60 mmol/L，葡萄糖 500 mmol/L，MgCl2·6H2O 10 mmol/L。

洗脫液：60%乙醇+10%氨水+30%去離子水配制[20]。

1.2 儀器與設(shè)備

AL104電子分析天平：瑞士MettlerToledo公司；DSX-280A手提式蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；DSHZ-300多用途水浴恒溫振蕩器：江蘇太倉(cāng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；GL-20G-Ⅱ型高速冷凍離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；756PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)[21]與滲透

將活化好的酵母菌接種到含50mL種子培養(yǎng)液的250mL錐形瓶中，30℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)1 d；種子液以體積比10%接種到含50 mL細(xì)胞發(fā)酵液的250 mL錐形瓶中，30℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)1 d；收集發(fā)酵液，于4℃冷凍離心機(jī)中8000r/min離心10min，除去上清液，收集細(xì)胞，無(wú)菌水洗滌3次。將收集的細(xì)胞在滲透溶液中滲透30min，離心收集備用。

1.3.2 吸附樹(shù)脂預(yù)處理

新樹(shù)脂含有大量雜質(zhì)，影響吸附能力，需先進(jìn)行預(yù)處理。先用清潔蒸餾水反復(fù)清洗，再用無(wú)水乙醇浸泡24h，蒸餾水清洗干凈。若是陰離子交換樹(shù)脂，先用2倍體積的1 mol/L的HCl溶液浸泡吸附樹(shù)脂3 h，蒸餾水反復(fù)沖洗直至流出水為中性。再用2倍體積的1mol/L的NaOH溶液浸泡吸附樹(shù)脂3 h，蒸餾水反復(fù)沖洗直至流出水為中性待用。若為陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，水洗后采用先堿后酸次序處理，其用量、時(shí)間同陰離子交換樹(shù)脂，洗凈備用。

1.3.3 吸附樹(shù)脂的篩選

預(yù)先準(zhǔn)備質(zhì)量濃度為200 mg/L的GSH粗提液。準(zhǔn)確稱量1 g上述預(yù)處理過(guò)的D001型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂、D301型陰離子交換樹(shù)脂、001x7型強(qiáng)酸陽(yáng)離子交換樹(shù)脂于100 mL錐形瓶中，再加入配制好的GSH粗提液10mL，37℃、160r/min振蕩吸附，測(cè)定上清液中GSH的質(zhì)量濃度，采用公式（1）-（2）計(jì)算吸附率（E）和吸附量（Qe）。將吸附樹(shù)脂與上清液分離，蒸餾水洗凈，用10 mL洗脫液在錐形瓶中解吸，測(cè)定上清液中GSH的質(zhì)量濃度，用公式（3）-（4）計(jì)算解吸率（D）和解吸量（Qd）。公式如下：

式中：E為吸附率，%；Qe為吸附量，mg/g；D為解吸率，%；Qd為解吸量，mg/g；C0為初始質(zhì)量濃度，mg/mL；C1為平衡后質(zhì)量濃度，mg/mL；C2為解吸液質(zhì)量濃度，mg/mL；V為吸附液體積，mL；V1為解吸液體積，mL。

1.3.4 吸附樹(shù)脂添加量與添加時(shí)間對(duì)GSH合成的影響

將一定質(zhì)量吸附樹(shù)脂按照不同時(shí)間添加到酶反應(yīng)液中，37℃、160 r/min搖瓶振蕩反應(yīng)6 h。反應(yīng)結(jié)束后，離心收集上清液，適當(dāng)稀釋后測(cè)GSH含量；吸附樹(shù)脂用蒸餾水沖洗后置于洗脫液中解吸，適當(dāng)稀釋后測(cè)GSH含量，兩者相加為酶反應(yīng)合成GSH總量。

1.3.5 前體物質(zhì)補(bǔ)加量與補(bǔ)加時(shí)間對(duì)GSH合成的影響

添加吸附樹(shù)脂后，將不同濃度前體物質(zhì)按照不同時(shí)間添加到酶反應(yīng)液中，37℃、160 r/min搖瓶振蕩反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，離心收集，上清液適當(dāng)稀釋后測(cè)GSH含量；吸附樹(shù)脂用蒸餾水清洗后置于洗脫液中解吸，適當(dāng)稀釋后測(cè)GSH含量，兩者相加為酶反應(yīng)合成GSH總量。

1.3.6 GSH合成條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

在上述單因素基礎(chǔ)上，確定最佳樹(shù)脂添加時(shí)間、樹(shù)脂添加量、前體補(bǔ)加量和前體補(bǔ)加時(shí)間，以這4個(gè)因素為自變量，GSH產(chǎn)量為最終指標(biāo)，設(shè)計(jì)4因素3水平L9（34）共9個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的正交試驗(yàn)。

1.3.7 GSH含量測(cè)定方法

GSH含量用四氧嘧啶法[22]測(cè)定，測(cè)定吸光度值，并依據(jù)GSH標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算GSH含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 GSH標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用GSH標(biāo)準(zhǔn)品配制質(zhì)量濃度為0、0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。 取每份標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，依次添加0.1 mol/L四氧嘧啶，0.5 mol/L磷酸鹽緩沖液，0.1 mol/L NaOH溶液各1 mL，振蕩混勻，反應(yīng)6 min后，加入1 mol/L NaOH溶液1 mL，充分搖勻，在波長(zhǎng)305 nm處測(cè)定吸光度值。并以GSH的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，線性回歸方程為y=10.345x+0.000 1，R2=0.9999。說(shuō)明在質(zhì)量濃度0～0.08mg/mL范圍內(nèi)兩者線性關(guān)系良好。超過(guò)這個(gè)范圍，吸光度值與GSH質(zhì)量濃度有偏差，實(shí)驗(yàn)中的酶反應(yīng)液GSH需經(jīng)過(guò)一定稀釋后方可測(cè)吸光度值。

圖1 谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig．1 Standard curve of glutathione

2.2 吸附樹(shù)脂的篩選

吸附樹(shù)脂本身的多孔性構(gòu)造決定了它具有強(qiáng)吸附性，作為一種新興分離材料，不同吸附樹(shù)脂對(duì)吸附介質(zhì)的吸附能力不同，吸附容量也有很大差別。通過(guò)查閱GSH性質(zhì)、結(jié)構(gòu)及吸附樹(shù)脂在GSH分離純化中的應(yīng)用，本試驗(yàn)選取D001型、D301型、001x7型離子交換吸附樹(shù)脂作為試驗(yàn)材料，粗提液成分復(fù)雜，模擬GSH酵母體內(nèi)合成環(huán)境，在37℃、160 r/min，自然pH條件下，考察其對(duì)GSH吸附與解吸能力，并對(duì)最優(yōu)樹(shù)脂作靜態(tài)吸附-解吸平衡曲線，其結(jié)果如圖2、圖3所示。

圖2 吸附樹(shù)脂的吸附量、解吸量和解吸率Fig．2 Adsorption，desorption and desorption rate of adsorption resin

由圖2可知，3種吸附樹(shù)脂的吸附能力與解吸能力不盡相同，在有底物存在的粗提液基礎(chǔ)上，底物與GSH的等電點(diǎn)不同，吸附能力也不同，從吸附量均達(dá)到1.7 mg/L可以看出，樹(shù)脂的添加會(huì)優(yōu)先考慮吸附GSH。其中弱堿性陰離子交換樹(shù)脂D301能吸附93.4%的GSH，吸附能力強(qiáng)，吸附容量大，效果最好，解吸率80.8%達(dá)到最大。綜合考慮，選擇吸附與解吸性能最好的弱堿性陰離子交換樹(shù)脂D301作為酶法合成GSH的耦合吸附樹(shù)脂。

由圖3可知，樹(shù)脂D301吸附速率快，容量高。解吸80min后，解吸率基本進(jìn)入平臺(tái)期，吸附100min，吸附率可達(dá)93.4%，增加吸附時(shí)間，吸附率不會(huì)再有明顯變化，故選擇靜態(tài)吸附時(shí)間是100 min。

圖3 樹(shù)脂D301靜態(tài)吸附解吸平衡曲線Fig．3 Equilibrium curve of static adsorption desorption of resin D301

解吸后的吸附樹(shù)脂經(jīng)過(guò)再生處理，可繼續(xù)作為吸附樹(shù)脂使用，弱堿性陰離子交換樹(shù)脂D301經(jīng)過(guò)5次重復(fù)利用，由于樹(shù)脂吸水膨脹，干燥后恢復(fù)過(guò)程中內(nèi)部顆粒來(lái)回移動(dòng)并產(chǎn)生內(nèi)應(yīng)力，致使樹(shù)脂發(fā)生磨損和破壞，吸附能力略有下降。

2.3 吸附樹(shù)脂與滲透細(xì)胞耦合

2.3.1 滲透細(xì)胞酶法合成GSH的變化規(guī)律

經(jīng)過(guò)滲透處理，可改變細(xì)胞通透性，使細(xì)胞內(nèi)生成的GSH分泌到胞外，降低反饋抑制。滲透細(xì)胞酶法合成GSH的變化規(guī)律見(jiàn)圖4。由圖4可知，在酶合成反應(yīng)時(shí)間的0～3h，細(xì)胞中總GSH產(chǎn)量增長(zhǎng)迅速，之后增長(zhǎng)減緩，在4 h后基本達(dá)到平衡。合成前期，胞外GSH含量低，胞內(nèi)合成的GSH迅速傳遞到胞外，但細(xì)胞外GSH產(chǎn)量隨著時(shí)間的增長(zhǎng)分泌速率降低，隨著反應(yīng)進(jìn)行，總產(chǎn)量增加緩慢，分泌到胞外的產(chǎn)量也趨于平衡。說(shuō)明在反應(yīng)時(shí)間4 h時(shí)GSH的反饋抑制已形成，為提高GSH的合成量，需減輕GSH的反饋抑制。

圖4 滲透細(xì)胞酶法合成谷胱甘肽變化規(guī)律Fig．4 Change rule of glutathione synthesis by osmotic cells enzyme method

2.3.2 吸附樹(shù)脂添加時(shí)間對(duì)合成GSH的影響

GSH的酶法合成隨著時(shí)間的進(jìn)行而進(jìn)行，最終達(dá)到平衡，加入樹(shù)脂的時(shí)間不同，吸附的GSH也不同，影響酶法合成GSH的產(chǎn)量。在37℃，160 r/min搖瓶振蕩酶法合成GSH反應(yīng)過(guò)程中，添加樹(shù)脂質(zhì)量相同的條件下，測(cè)定樹(shù)脂分別在0、0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h時(shí)添加對(duì)GSH合成的影響，其結(jié)果如圖5所示。

圖5 樹(shù)脂添加時(shí)間對(duì)合成谷胱甘肽的影響Fig.5 Effect of resin addition time on GSH synthesis

由圖5可知，在酶反應(yīng)進(jìn)行的0～2.0 h內(nèi)，隨著反應(yīng)的進(jìn)行添加樹(shù)脂，GSH的產(chǎn)量逐漸增加。反應(yīng)第2.0小時(shí)時(shí)加入吸附樹(shù)脂，細(xì)胞GSH量（分離出吸附樹(shù)脂后，細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外GSH量）為498 mg/L，樹(shù)脂解吸GSH量為246 mg/L，GSH總量達(dá)到最大744 mg/L。從圖5中樹(shù)脂解吸量看出，隨著時(shí)間的增加，樹(shù)脂解吸量逐漸增大，后趨于平衡?？赡苁怯捎谇捌贕SH的合成主要在胞內(nèi)積累，添加樹(shù)脂后，樹(shù)脂吸水膨脹，部分底物被溶解在吸附的水中，降低底物濃度，影響GSH合成，隨反應(yīng)進(jìn)行，胞內(nèi)GSH滲透到胞外，通過(guò)吸附樹(shù)脂吸附，促進(jìn)反應(yīng)正向進(jìn)行。2.0 h后添加樹(shù)脂，由于添加時(shí)間晚，未能及時(shí)將GSH從反應(yīng)液中吸附分離，高濃度的GSH產(chǎn)生反饋調(diào)節(jié)作用，抑制GSH合成酶系活力，且底物與能量被其他生命活動(dòng)消耗，導(dǎo)致利用率低，使GSH產(chǎn)量有降低。綜合考慮，在酶法合成GSH反應(yīng)進(jìn)行2.0 h時(shí)添加樹(shù)脂，更有利于酶法合成GSH。

2.3.3 吸附樹(shù)脂添加量對(duì)合成GSH的影響

在37℃、160r/min搖瓶振蕩酶法合成GSH反應(yīng)過(guò)程中，在反應(yīng)進(jìn)行一定時(shí)間后，測(cè)定樹(shù)脂添加量為0、0.5 g/10 mL、1.0g/10mL、1.5g/10mL、2.0g/10mL、2.5g/10mL、3.0 g/10 mL時(shí)對(duì)GSH合成影響，其結(jié)果如圖6所示。

圖6 樹(shù)脂添加量對(duì)合成谷胱甘肽的影響Fig.6 Effect of resin addition on glutathione synthesis

由圖6可知，未添加樹(shù)脂時(shí)，GSH的產(chǎn)量?jī)H為650 mg/L，本試驗(yàn)中，樹(shù)脂添加量2.0g/10mL，細(xì)胞GSH量為448mg/L，樹(shù)脂解吸GSH量為294 mg/L，GSH最終產(chǎn)量可達(dá)742 mg/L，為樹(shù)脂吸附最佳水平。從圖中樹(shù)脂解吸量看出，當(dāng)樹(shù)脂添加量為0～2.0 g/10 mL時(shí)，酶反應(yīng)液中的GSH未被完全吸附，合成的GSH對(duì)胞內(nèi)酶系通過(guò)反饋調(diào)節(jié)影響GSH的產(chǎn)率。繼續(xù)增加樹(shù)脂添加量，合成的GSH產(chǎn)量有限，樹(shù)脂利用率低，解吸過(guò)程造成浪費(fèi)。綜合考慮，當(dāng)GSH的合成產(chǎn)量高于650mg/L時(shí)，在酶法合成GSH反應(yīng)中添加樹(shù)脂量2.0g/10mL，可高效經(jīng)濟(jì)的提高GSH產(chǎn)量。

2.4 前體物質(zhì)的補(bǔ)加對(duì)合成GSH的影響

2.4.1 前體物質(zhì)的補(bǔ)加量對(duì)合成GSH的影響

吸附樹(shù)脂添加到酶反應(yīng)液中，及時(shí)吸附分離反應(yīng)液中合成的GSH，降低或解除反應(yīng)體系的反饋抑制，同時(shí)，適當(dāng)加入前體物質(zhì)，使胞內(nèi)反應(yīng)體系繼續(xù)進(jìn)行，GSH產(chǎn)量得到進(jìn)一步提高。根據(jù)上述試驗(yàn)的基礎(chǔ)，在添加樹(shù)脂后一定時(shí)間補(bǔ)加初始量20%、40%、60%、80%的前體物質(zhì)，考察其對(duì)GSH產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖7所示。

圖7 前體物質(zhì)補(bǔ)加量對(duì)合成谷胱甘肽的影響Fig.7 Effect of precursor addition on glutathione synthesis

由圖7可知，當(dāng)前體物質(zhì)補(bǔ)加量較低時(shí)，GSH產(chǎn)量隨著前體物質(zhì)補(bǔ)加量的增加而增加，在補(bǔ)加量為前體初始量的60%時(shí)產(chǎn)量基本達(dá)到最高1136mg/L。繼續(xù)加大前體物質(zhì)的補(bǔ)加量，產(chǎn)量增加不明顯。說(shuō)明較低的前體補(bǔ)加量影響GSH合成效率，但隨著前體物質(zhì)持續(xù)添加，GSH大量合成，吸附力達(dá)到飽和，產(chǎn)生反饋抑制，影響GSH連續(xù)合成。綜上訴述，選擇前體物質(zhì)補(bǔ)加量為初始量的60%，可加快GSH合成效率，提高GSH產(chǎn)量。

2.4.2 前體物質(zhì)的補(bǔ)加時(shí)機(jī)對(duì)合成GSH的影響

在上述試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，在反應(yīng)2 h、3 h和4 h后對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行前體補(bǔ)加，測(cè)量其對(duì)GSH合成的影響，結(jié)果如圖8所示。

由圖8可知，較早時(shí)間添加前體物質(zhì)，樹(shù)脂沒(méi)有完全吸附GSH，影響或改變了正常的代謝活動(dòng)，使GSH再次合成受到影響。在3h時(shí)進(jìn)行補(bǔ)加，GSH產(chǎn)量達(dá)到最大1148mg/L。再延遲補(bǔ)加時(shí)間，樹(shù)脂吸附飽和，反應(yīng)繼續(xù)合成GSH，反饋抑制形成，前體物質(zhì)得不到有效利用?？紤]到操作工藝和生產(chǎn)成本，以及前體物質(zhì)的添加影響后期GSH含量的測(cè)定，選擇在添加樹(shù)脂3 h后補(bǔ)加前體物質(zhì)，能最大程度提高GSH產(chǎn)量。

圖8 前體物質(zhì)補(bǔ)加時(shí)間對(duì)合成谷胱甘肽的影響Fig.8 Effect of precursor addition time on glutathione synthesis

2.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

在上述試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以不同樹(shù)脂添加時(shí)間、樹(shù)脂添加量、前體補(bǔ)加量和前體補(bǔ)加時(shí)間為自變量，GSH產(chǎn)量為最終指標(biāo)，設(shè)計(jì)4因素3水平L9（34）共9個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的正交試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 合成谷胱甘肽條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for glutathione synthesis conditions optimization

表2 合成谷胱甘肽條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for glutathione synthesis conditions optimization

由表2的試驗(yàn)結(jié)果看出，各因素對(duì)合成GSH產(chǎn)量的影響不同，其中樹(shù)脂添加量＞樹(shù)脂添加時(shí)間＞前體添加量＞前體添加時(shí)間，合成GSH的最優(yōu)組合為A1B2C2D2，即樹(shù)脂添加時(shí)間為2.0 h，樹(shù)脂添加量為2.0 g/10 mL，前體物質(zhì)添加量為初始量的60%，前體物質(zhì)補(bǔ)加時(shí)間為3 h。為檢驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果，在上述最佳工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，經(jīng)過(guò)5次平行試驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得GSH平均產(chǎn)量為1 154 mg/L，與正交試驗(yàn)結(jié)果相吻合。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)進(jìn)行滲透細(xì)胞耦合吸附樹(shù)脂合成GSH的研究，將酶反應(yīng)過(guò)程與產(chǎn)物分離同步進(jìn)行，解除或降低GSH對(duì)合成酶系的反饋抑制作用，提高GSH產(chǎn)量，簡(jiǎn)化下游分離純化過(guò)程。研究立足于GSH的性質(zhì)，在3種不同的吸附樹(shù)脂中篩選出弱堿性陰離子交換樹(shù)脂D301作為最優(yōu)耦合吸附樹(shù)脂，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)對(duì)合成工藝進(jìn)行優(yōu)化，在酶法合成GSH實(shí)驗(yàn)中，反應(yīng)2.0h添加2.0g/10mL弱堿性陰離子交換樹(shù)脂D301，反應(yīng)3 h后補(bǔ)加60%初始量的前體物質(zhì)，GSH終產(chǎn)量可達(dá)1 154 mg/L，比原來(lái)提高77.5%。但目前滲透細(xì)胞耦合吸附樹(shù)脂合成GSH還處于實(shí)驗(yàn)室階段，吸附樹(shù)脂與細(xì)胞分離困難，且干擾前體物質(zhì)的吸收。如何解決吸附樹(shù)脂的這些問(wèn)題，是耦合樹(shù)脂合成GSH的關(guān)鍵，也是進(jìn)一步研究的方向。

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Effects of coupled adsorption resin on enzymatic synthesis of glutathione by cell

WAN Weijian,DUAN Chao,SUN Yiran,DUAN Xuehui*
（State Key Laboratory of Food Science and Technology,School of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China）

The resin suitable for the separation of glutathione was screened from three kinds of adsorption resins by static adsorption-desorption experiments,the resin was coupled with yeast permeation cells,and enzymatic synthesize of glutathione was conducted by precursor addition.Results showed that the adsorption effect of resin D301 was the optimal among the three resins.The processing conditions were optimized by single factor and orthogonal experiments,in the enzymatic synthesis of glutathione experiments,adding resin 2.0 g/10 ml after reaction 2.0 h,and adding 60%initial concentration of precursor after reaction 3.0 h,finally the glutathione yield was 1 154 mg/L,which increased 77.5%compared with the method without resin and precursor addition.

glutathione;resin;enzymatic synthesis;adsorption

TQ920.1

0254-5071（2017）12-0051-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.12.011

2017-10-12

南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自由探索課題（SKLF-TS-201113）

萬(wàn)偉建（1991-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。

*通訊作者：段學(xué)輝（1958-），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。