楊 建，周業(yè)江

西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院胃腸外科，四川 瀘州 646000

AFP陽性胃癌多藥耐藥蛋白水平的研究

楊 建，周業(yè)江

西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院胃腸外科，四川 瀘州 646000

目的分析AFP陽性胃癌(alpha-fetoprotein positive gastric cancer, AFPGC)組織中胸苷酸合成酶(thymidylate synthase, TS)、胎盤型谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase Pi, GST-π)、P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)、DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅱ(topoisomerase Ⅱ, TopoⅡ)的表達，并與AFP陰性胃癌(即普通胃癌)進行對比，以了解AFPGC耐藥情況。方法采用免疫組織化學染色法(S-P法)檢測臨床病理已確診的27例AFPGC及46例同期普通胃癌組織中TS、GST-π、P-gp、TopoⅡ四種蛋白抗原的表達情況。結(jié)果TS、GST-π在AFPGC中的陽性表達率均高于其在普通胃癌中的陽性表達率(P<0.05)，P-gp、TopoⅡ在兩組胃癌中陽性表達率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)論AFPGC可能較普通胃癌更易出現(xiàn)多藥耐藥，多藥耐藥可能是AFPGC預后差的原因之一；AFP的表達可能為胃癌耐藥性增加的危險因素之一，AFP可能成為間接評估胃癌患者對化療藥物的敏感性一項指標，以指導臨床進行個體化治療。

AFP；TS；GST-π；P-gp；TopoⅡ；多藥耐藥；胃癌

胃癌是一種常見的惡性腫瘤，發(fā)病率與死亡率均較高，分別居所有惡性腫瘤的第2位及第3位[1]。AFP陽性胃癌(alpha-fetoprotein positive gastric cancer, AFPGC)作為胃癌中的一種特殊類型，1970年BOURREILLE等[2]對其進行了首次報道。隨后國內(nèi)外對其報道逐漸增多，其發(fā)病率占所有胃癌病例的1.5%～8.0%，具有高度侵襲性，易發(fā)生肝轉(zhuǎn)移、淋巴轉(zhuǎn)移，預后較差[3-8]。就診時大多已是進展期胃癌，術(shù)后輔助化療對改善總體預后極為重要。然而，化療的療效取決于腫瘤對化療藥物的敏感性，隨著對腫瘤多藥耐藥(multidrug resistance, MDR)研究的深入，發(fā)現(xiàn)多藥耐藥與TS、GST-π、P-gp、Topo Ⅱ等蛋白的異常表達有關(guān)[9-12]。AFPGC作為一特殊類型的胃癌，總體預后較一般胃癌差，其對化療藥物的敏感性是否也較普通胃癌差？國內(nèi)外針對AFPGC對化療藥物的敏感性的相關(guān)研究尚缺乏。本研究旨在應用免疫組織化學染色法(SP法)檢測臨床病理已確診27例AFPGC及46例普通胃癌組織中TS、GST-π、P-gp、Topo Ⅱ四種蛋白抗原的表達情況，以間接了解AFPGC及普通胃癌對常規(guī)化療藥物的敏感性是否存在差異，進一步加深對AFPGC的認識，以求為其進行個體化診治及預后評估提供更多的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1研究對象采用回顧性分析方法，查閱并收集西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院胃腸外科2013年12月至2017年4月行胃癌根治術(shù)或姑息性切除手術(shù)治療，且最終經(jīng)病理確診的胃癌患者的完整病歷資料。通過血清甲胎蛋白升高(sAFP>10 ng/ml)篩選出可能的AFPGC患者34例，在排除原發(fā)性肝癌、肝炎、肝硬化、妊娠等可能引起甲胎蛋白升高的情況下，最終確診AFPGC患者27例，調(diào)用其石蠟塊作為研究標本。同時，在排除原發(fā)性肝癌、肝炎、肝硬化、妊娠等情況下，隨機篩選同期行胃癌手術(shù)治療，且病理確診的普通(AFP陰性)胃癌患者46例，調(diào)用其石蠟塊作為研究對照組的標本。

1.2一般資料AFPGC患者中：(1)性別：男14例，女13例；(2)年齡：45～74 歲，≥60歲15例，<60歲12例；(3)腫瘤大?。褐睆健? cm 17例，<5 cm 10例；(4)組織分化：良好(高/中分化腺癌)11例， 差(低分化腺癌/黏液腺癌/印戒細胞癌)16例；(5)浸潤深度：T1/T2有7例，T3/T4有20例；(6)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移5例；(7)TNM分期：Ⅰ/Ⅱ期6例， Ⅲ/Ⅳ期21例(按UICC/AJCC 2010版TNM分期劃分)。

普通胃癌患者中：(1)性別：男27例，女19例；(2)年齡：28～79歲，≥60歲22例，<60歲24例；(3)腫瘤大小：直徑≥5 cm 11例，<5 cm 35例；(4)組織分化：良好(高/中分化腺癌)15例， 差(低分化腺癌/黏液腺癌/印戒細胞癌)31例；(5)浸潤深度：T1/T2有24例，T3/T4有22例；(6)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例；(7)TNM分期：Ⅰ/Ⅱ期30例，Ⅲ/Ⅳ期16例(按UICC/AJCC 2010版TNM分期劃分)。

1.3方法所有標本均經(jīng)質(zhì)量濃度為100 g/L的甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，制成4 μm切片。鼠抗人TS單克隆抗體(即用型)，鼠抗人GST-π單克隆抗體(即用型)，鼠抗人TopoⅡ單克隆抗體(即用型)，SP檢測試劑盒，DAB試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。鼠抗人P-gp單克隆抗體(即用型)購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。以PBS代替一抗作為陰性對照，使用試劑公司提供的陽性片作為陽性對照。

1.4結(jié)果判定TS、GST-π以腫瘤細胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性；P-gp以腫瘤細胞胞漿/胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。隨機觀察10個高倍視野，根據(jù)染色強度與陽性細胞數(shù)進行判定：(1)陽性強度：無色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃為3分；(2)陽性細胞百分比：隨機計數(shù)500細胞，陽性細胞<5%為0分，5%～25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，>75%為4分；(3)按兩者相加之和分為：0～1分為“-”，2～3分為“1+”，4～5分為“2+”，6～7分為“3+”。TopoⅡ以腫瘤細胞細胞核呈棕褐色為陽性，根據(jù)陽性細胞所占百分比，分為：<10%為“-”，10%～25%為“1+”，25%～50%為“2+”，>50%為“3+”。綜合考慮如下：TS、GST-π、P-gp、Topo Ⅱ均將“-”、“+”視為陰性表達，將“2+”、“3+”視為陽性表達。結(jié)果如表1所示。

表1 AFPGC及普通胃癌中TS、GST-π、P-gp、TopoⅡ表達Tab 1 The expressions of TS, GST-π, P-gp and TopoⅡ in AFPGC and normal gastric cancer

1.5統(tǒng)計學處理采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，檢驗水準α=0.05，χ2檢驗或Fisher確切概率法分析各個指標及其與臨床特征之間的關(guān)系。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1TS、GST-π、P-gp及TopoⅡ在胃癌組織中的表達情況在胃癌組織中，TS、GST-π、P-gp陽性顆粒定位于胞質(zhì)(見圖1～3)，TopoⅡ陽性顆粒定位細胞核(見圖4)。TS在AFPGC組與普通胃癌組中表達陽性率分別為51.85%與21.74%，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=6.991，P=0.008)。GST-π在AFPGC組與普通胃癌組表達陽性率分別為70.37%與32.61%，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=9.750，P=0.002)。P-gp在AFPGC組與普通胃癌組表達陽性率分別為59.26%與54.35%，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.167，P=0.683)。TopoⅡ在AFPGC組與普通胃癌組表達陽性率分別為 25.93%與30.43%，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.169，P=0.681)(見表2)。

2.2TS、GST-π、P-gp及TopoⅡ在AFPGC組織中的表達與臨床病理因素的關(guān)系在AFPGC中，TS的表達與性別、年齡、腫瘤大小、組織分化、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分期均無關(guān)(P>0.05)。GST-π的表達與組織分化(良好、差)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(有、無)具有相關(guān)性(P<0.05)；而與性別、年齡、腫瘤大小、浸潤深度、病理分期無關(guān)(P>0.05)。P-gp的表達與組織分化(良好、差)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(有、無)具有相關(guān)性(P<0.05)；而與性別、年齡、腫瘤大小、浸潤深度、病理分期無關(guān)(P>0.05)。TopoⅡ的表達與組織分化(良好、差)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(有、無)具有相關(guān)性(P<0.05)；而與性別、年齡、腫瘤大小、浸潤深度、病理分期無關(guān)(P>0.05)(見表3)。

圖1 胃癌組織中TS的陽性表達(400×)； 圖2 胃癌組織中GST-π的陽性表達(400×)； 圖3 胃癌組織中P-gp的陽性表達(400×)； 圖4 胃癌組織中TopoⅡ的陽性表達(400×)Fig 1 Positive expression of TS in gastric cancer tissues (Original magnification, 400×); Fig 2 Positive expression of GST-π in gastric cancer tissues (Original magnification, 400×); Fig 3 Positive expression of P-gp in gastric cancer tissues (Original magnification, 400×); Fig 4 Positive expression of TopoⅡ in gastric cancer tissues (Original magnification, 400×)

組別例數(shù)TS陽性/%χ2值P值GST-π陽性/%χ2值P值P-pg陽性/%χ2值P值TopoⅡ陽性/%χ2值P值A(chǔ)FPGC2714(51.85)6.9910.00819(70.37)9.7500.00216(59.26)0.1670.6837(25.93)0.1690.681普通胃癌4610(21.74)15(32.61)25(54.35)14(30.43)

表3 AFPGC中TS、GST-π、P-pg及TopoⅡ的表達與臨床病理因素的關(guān)系Tab 3 The relationship of clinicopathological factors with the expressions of TS, GST-π, P-pg and TopoⅡ in AFPGC

注：AFPGC例數(shù)<40，不滿足χ2檢驗要求，此表P值均使用Fisher確切概率法計算。

2.3TS、GST-π、P-gp及TopoⅡ在普通胃癌組織中的表達與臨床病理的關(guān)系在普通胃癌中，TS的表達與性別、年齡、腫瘤大小、組織分化、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分期均無關(guān)(P>0.05)。GST-π的表達與組織分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性(P<0.05)；而與性別、年齡、腫瘤大小、浸潤深度、病理分期無相關(guān)性(P>0.05)。P-gp的表達與組織分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分期有相關(guān)性(P<0.05)；而與性別、年齡、腫瘤大小、浸潤深度無相關(guān)性(P>0.05)。TopoⅡ的表達與組織分化具有相關(guān)性(P<0.05)；而與性別、年齡、腫瘤大小、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分期無關(guān)(P>0.05)(見表4)。

表4 普通胃癌中TS、GST-π、P-pg及TopoⅡ的表達與臨床病理因素的關(guān)系Tab 4 The relationship of clinicopathological factors with the expressions of TS, GST-π, P-pg and TopoⅡ in normal gastric cancer

注： “#”為χ2值靠近0，但不等于0。

2.4AFPGC與普通胃癌臨床病理資料的對比AFPGC與普通胃癌相比，在腫瘤大小、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病理分期上有顯著性差異(P<0.05)。而在性別、年齡及組織分化方面相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表5)。

3 討論

當前，對胃癌這一惡性腫瘤的治療，主要是以手術(shù)為主、放化療為輔的綜合治療。由于早期無特異癥狀，就診時多已是進展期胃癌。而AFPGC具有獨特的生物學行為，侵襲性強，易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移，且分期多較晚[3-8]，這是其預后差的主要原因之一。從本研究中也可看出，AFPGC與普通胃癌相比，具有腫瘤直徑大、浸潤深、分期晚及易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等特點，與國內(nèi)外的報道[4,8,13]基本一致。此時，化療在AFPGC的綜合治療中顯得格外重要，然而多藥耐藥已成為化療成功的嚴重障礙，眾多研究發(fā)現(xiàn)，TS、GST-π、P-gp及TopoⅡ與腫瘤耐藥緊密相關(guān)[10-18]。

目前已知的關(guān)于腫瘤耐藥的機制有以下幾種：(1)“藥泵”作用[9,14]將化療藥物泵出到細胞外，如P-gp具有水解ATP的功能，可通過藥物逆濃度梯度將藥物泵細胞外而產(chǎn)生耐藥，其高表達與羥基喜樹堿、阿霉素耐類有關(guān)[9]。(2)促進藥物代謝[9,15]，如GST-π為多功能代謝酶，可與親脂性藥物結(jié)合增加其水溶性，促進藥物代謝而產(chǎn)生耐藥，高表達與順氯氨鉑、氟尿嘧啶、絲裂霉素耐藥有關(guān)[9]。(3)其他機制： TopoⅡ為一種核內(nèi)酶，與DNA的轉(zhuǎn)錄、翻譯等過程有關(guān)，同時也是一些化療藥物作用靶點，一些化療藥物與其結(jié)合可形成DNA穩(wěn)定斷裂復合物， 從而干擾細胞DNA正常復制、翻譯過程，其低表達與羥基喜樹堿、阿霉素、絲裂霉素耐藥有關(guān)[9]。TS可催化尿嘧啶脫氧核苷酸甲基化，為DNA生物合成所必需，同時也是氟尿嘧啶類的作用靶酶，氟尿嘧啶類藥物可阻止TS與正常底物結(jié)合，從而抑制DNA的合成，進而抑制細胞生長形成抗腫瘤作用；有文獻[16]報道，TS可與自身的mRNA結(jié)合形成特定的復合物(TS-mRNA)，使mRNA翻譯受阻，在對氟尿嘧啶有耐藥性的患者，氟尿嘧啶與TS結(jié)合，導致TS-mRNA復合物減少，從而促進TS的高表達。總之，TS的高表達與氟尿嘧啶耐藥有關(guān)已被許多文獻證實[11-12,17]。曾有文獻[18-19]報道，個別AFPGC患者在接受以手術(shù)為主的綜合治療后，仍可獲得良好的預后。所以，探討AFPGC與普通胃癌中TS、GST-π、P-gp及TopoⅡ表達的異同，對進一步認識AFPGC，對AFPGC及普通胃癌的個體化治療具有指導意義。

表5 AFPGC與普通胃癌臨床病理資料的比較Tab 5 Comparison of clinicopathological factors of AFPGC and normal gastric cancer patients

本研究發(fā)現(xiàn)，AFPCG與普通胃癌在TS與GST-π的表達上差異有統(tǒng)計學意義，AFPGC均高于普通胃癌。這一發(fā)現(xiàn)提示，AFP的表達可能通過某種機制增加TS與GST-π的表達，或AFP的表達伴隨著TS、GST-π的表達增加，進而可能導致AFPGC耐藥性增加。同時，TS在AFPGC與普通胃癌中均未發(fā)現(xiàn)與臨床病理因素有關(guān)；GST-π在AFPGC與普通胃癌中均與組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況存在顯著相關(guān)；這一發(fā)現(xiàn)進一步提示，AFP的表達可能成為TS、GST-π增加的危險因素之一。這表明，AFPGC相對于普通胃癌而言，可能更易出現(xiàn)多藥耐藥現(xiàn)象，可能更易對氟尿嘧啶類、鉑類及絲裂霉素產(chǎn)生耐藥，這可能是其總體預后較普通胃癌差的另一原因。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，AFP的表達與TS、GST-π的表達存在某種內(nèi)在聯(lián)系。血清AFP較易檢測，若AFP的表達為胃癌耐藥性增加的危險因素之一，臨床通過檢測胃癌患者血清AFP水平，可間接評估胃癌患者的耐藥情況，以指導臨床進行個體化治療。但AFP的表達與TS、GST-π的表達之間具體關(guān)系，尚需大樣本研究進一步證實，其內(nèi)在聯(lián)系的確切機制有待進一步研究。

[1] 陳萬青, 鄭榮壽, 張思維, 等. 2013年中國惡性腫瘤發(fā)病和死亡分析[J]. 中國腫瘤, 2017, 26(1): 1-7.

CHEN W Q, ZHENG R S, ZHANG S W, et al. Report of cancer incidence and mortality in China, 2013 [J]. China Cancer, 2017, 26(1): 1-7.

[2] BOURREILLE J, METAYER P, SAUGER F, et al. Existence of alpha feto protein during gastric-origin secondary cancer of the liver [J]. Presse Med, 1970, 78(28): 1277-1278.

[3] HE R, YANG Q, DONG X, et al. Clinicopathologic and prognostic characteristics of alpha-fetoprotein-producing gastric cancer [J]. Oncotarget, 2017, 8(14): 23817-23830.

[4] CHEN Y, QU H, JIAN M, et al. High level of serum AFP is an independent negative prognostic factor in gastric cancer [J]. Int J Biol Markers, 2015, 30(4): e387-e393.

[5] WEN S, LIU Z, HU X. Clinical features and prognostic analysis of alpha-fetoprotein positive gastric cancer [J]. Zhonghua Wei Chang Wai Ke Za Zhi, 2016, 19(1): 67-70.

[6] ZUO C T, JU Q. An analysis of clinical characteristics and prognosis for patients with serum alpha-fetoprotein-positive gastric cancer [J]. Minerva Med, 2015, 106(4): 185-191.

[7] LIU X, YANG M, GAO J, et al. Clinicopathologic features and prognosis of 51 patients with alpha-fetoprotein-producing gastric cancer [J]. Zhonghua Zhong Liu Za Zhi, 2015, 37(3): 231-234.

[8] WANG D, LI C, XU Y, et al. Clinicopathological characteristics and prognosis of alpha-fetoprotein positive gastric cancer in Chinese patie-nts [J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015, 8(6): 6345-6355.

[9] GENG M, WANG L, CHEN X, et al. The association between chemosensitivity and Pgp, GST-pi and Topo II expression in gastric cancer [J]. Diagn Pathol, 2013, 8(12): 198-203.

[10] YU P, DU Y, CHENG X, et al. Expression of multidrug resistance-associated proteins and their relation to postoperative individualized chemotherapy in gastric cancer [J]. World J Surg Oncol, 2014, 12(10): 307-313.

[11] GAO Y, CUI J, XI H, et al. Association of thymidylate synthase expression and clinical outcomes of gastric cancer patients treated with fluoropyrimidine-based chemotherapy: a meta-analysis [J]. Onco Targets Ther, 2016, 9(1): 1339-1350.

[12] LIU X F, ZHANG H, SUN J Q, et al. Correlation between expression of thymidylate synthase and clinical outcome of advanced gastric cancer treated with capecitabine alone chemotherapy [J]. Tumour Biol, 2014, 35(12): 12409-12414.

[13] 甘濤, 夏濤, 李威, 等. 產(chǎn)甲胎蛋白胃癌的臨床病理及預后分析[J]. 華中科技大學學報(醫(yī)學版), 2012, 41(4): 481-484.

GAN T, XIA T, LI W, et al. Clinicopathology and prognosis of Alpha-fetoprotein-producing gastric cancer [J]. Acta Med Univ Sci Technol Huazhong, 2012, 41(4): 481-484.

[14] PEREZ-TOMAS R. Multidrug resistance: retrospect and prospects in anti-cancer drug treatment [J]. Curr Med Chem, 2006, 13(16): 1859-1876.

[15] ZHANG Y, ZHOU T, DUAN J, et al. Inhibition of P-glycoprotein and glutathione S-transferase-pi mediated resistance by fluoxetine in MCF-7/ADM cells [J]. Biomed Pharmacother, 2013, 67(8): 757-762.

[16] SULZYC-BIELICKA V, BIELICKI D, BINCZAK-KULETA A, et al. Thymidylate synthase gene polymorphism and survival of colorectal cancer patients receiving adjuvant 5-fluorouracil [J]. Genet Test Mol Biomarkers, 2013, 17(11): 799-806.

[17] YEH C N, JUNG S M, CHEN T W, et al. Expression of thymidylate synthase determines the response of gastric cancer patients undergoing gastrectomy to 5-fluorouracil-based adjuvant chemotherapy [J]. Langenbecks Arch Surg, 2010, 395(3): 217-225.

[18] GONG W, SHOU D, GONG P. Extremely high expression of serum alpha-fetoprotein level of gastric adenocarcinoma: a rare case with an unexpected well-prognosis [J]. Springer Plus, 2016, 5(1): 2056-2061.

[19] FANG Y U, WANG L, YANG N, et al. Successful multimodal therapy for an alpha-fetoprotein-producing gastric cancer patient with simultaneous liver metastases [J]. Oncol Lett, 2015, 10(5): 3021-3025.

Aresearchontheproteinofthemultidrugresistanceofthealpha-fetoproteinpositivegastriccancer

YANG Jian, ZHOU Yejiang

Department of Gastrointestinal Surgery, the Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, China

ObjectiveTo analyze the expressions of thymidylate synthase (TS), glutathione S-transferase Pi (GST-π), P-glycoprotein (P-gp) and topoisomeraseⅡ (TopoⅡ) in alpha-fetoprotein positive gastric cancer (AFPGC), in order to study the drug resistance of AFPGC.MethodsImmunohistochemistry staining method (the S-P law) was used to examine the expressions of TS, GST-π, P-gp, TopoⅡ in 27 pathologically diagnosed as AFPGC and 46 pathologically diagnosed as alpha-fetoprotein negative gastric cancers (normal gastric cancer).ResultsCompared with normal gastric cancer, expressions of TS and GST-π were higher in AFPGC (P<0.05), but expressions of P-gp and TopoⅡ had no statistical difference between two groups (P>0.05).ConclusionCompared with alpha-fetoprotein negative gastric cancer, AFPGC is more likely to be multidrug resistance (MDR), MDR may be one reason of extremely poor prognosis of AFPGC. The expression of alpha-fetoprotein may be a risk factor for the increase of resistance of gastric cancer. Alpha-fetoprotein may be an indirect indication of the sensitivity of chemotherapy for gastric cancer, to guide the individualized treatment of gastric cancers.

AFP; TS; GST-π; P-gp; TopoⅡ; Multidrug resistance; Gastric cancer

楊建，碩士研究生，研究方向：消化道腫瘤的研究。E-mail: zyyj666666@163.com

周業(yè)江，主任醫(yī)師，教授，博士，碩士生導師，研究方向：消化道腫瘤的診治。E-mail: zyj7525@163.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.12.011

R735.2

A

1006-5709(2017)12-1365-05

2017-07-07

馬 軍)