曹 凡 ，馮 剛 ，譚鵬鵬 ，張 潔 ，楊 宏 ，彭方仁

(1. 南京林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，江蘇 南京 210037；2. 南京林業(yè)大學(xué) 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037)

不同品種薄殼山核桃種胚組織培養(yǎng)研究

曹 凡1，2，馮 剛1，2，譚鵬鵬1，2，張 潔1，楊 宏1，彭方仁1，2

(1. 南京林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，江蘇 南京 210037；2. 南京林業(yè)大學(xué) 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037)

為促進(jìn)薄殼山核桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展，縮短育苗周期和提供優(yōu)質(zhì)品種苗，本試驗以薄殼山核桃成熟的青皮果實的種胚為試驗材料，進(jìn)行了不同品種種胚誘導(dǎo)組織培養(yǎng)技術(shù)的研究，包括培養(yǎng)基的篩選、最佳植物生長調(diào)節(jié)劑的配比以及其它影響該外植體組織培養(yǎng)的因素。試驗主要結(jié)果如下：（1）薄殼山核桃種胚的組織培養(yǎng)過程中，選用當(dāng)年成熟帶青皮果實的種胚誘導(dǎo)胚根與胚芽的誘導(dǎo)率較高。使用0.1%的升汞溶液消毒種子10～15 min，再用0.1%升汞溶液將種胚消毒5 min，每瓶接種一個能夠有效地減少污染，污染率可降低5%左右。（2）薄殼山核桃種子胚的組織培養(yǎng)過程中，‘波尼’品種種胚誘導(dǎo)率：處理組A＞C＞D＞B；‘馬罕’品種種胚誘導(dǎo)率：處理組B＞C＞A＞D。（3）140 mL試管培養(yǎng)能夠促進(jìn)胚根生長優(yōu)越于常用玻璃瓶器皿，可縮短種胚誘導(dǎo)周期；且添加40 g/L的蔗糖全黑暗環(huán)境下培養(yǎng)，種胚生長狀況最佳。

美國山核桃；種胚誘導(dǎo)；培養(yǎng)基

薄殼山核桃Carya illinoinensis(Wangenh.)C. Koch，又名美國山核桃、長山核桃，胡桃科山核桃屬。其果實價值極高，出仁率高達(dá)50%以上，種仁含油量在70%以上[1-3]。此外，其種殼粉末是高級的拋光材料，木材材質(zhì)優(yōu)良堅韌，樹型優(yōu)美是庭院及城鄉(xiāng)良好的綠化樹種[2]。因此，薄殼山核桃不但是果材兼用樹種，而且具有良好的生態(tài)功能，是熱帶、亞熱帶地區(qū)生態(tài)、經(jīng)濟(jì)“雙贏”型樹種[4-5]。但是，薄殼山核桃生長發(fā)育期較長，結(jié)實較遲，傳統(tǒng)的實生苗繁殖選育方法不僅耗資耗時，而且收效緩慢，優(yōu)良品種缺乏，易感染病蟲害，管理困難，短期內(nèi)無法獲得經(jīng)濟(jì)價值。

組織培養(yǎng)技術(shù)是現(xiàn)代快速無性繁殖的重要手段，它是利用細(xì)胞再生將離體的組織以及器官在人工控制的條件下培養(yǎng)以求獲得完整植株的方法[2]。它可以極大程度的縮短育苗時間，降低培育成本，并不受環(huán)境影響提供苗木，是促進(jìn)核桃產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的先進(jìn)技術(shù)，對于提高薄殼山核桃成活率及產(chǎn)量具有重大意義，由此可見薄殼山核桃的組織培養(yǎng)技術(shù)是一種迫切需要研究的技術(shù)[6-9]。然而，木本植物體胚發(fā)生比較困難，尤其是胡桃科植物，外植體材料容易褐化，難以誘導(dǎo)分化，為組織培養(yǎng)及體胚發(fā)生工作帶來巨大困難。目前在核桃Juglans regia、黑核桃J. nigris、灰核桃J. cinerea、函滋核桃J. hindsii等胡桃科植物中均有體胚發(fā)生方面的報道[10-13]。在美國山核桃的體胚發(fā)生技術(shù)也有幾篇相關(guān)報道，都不同程度地誘導(dǎo)了體胚發(fā)生，但都因為誘導(dǎo)體胚發(fā)育困難，或者難以誘導(dǎo)生根而沒有獲得完整的植株[14-17]。Yates 在1990年報道了一篇文章，在1年之內(nèi)通過體胚僅獲得了極少量的植株[18]。后來，Burns通過懸浮培養(yǎng)獲得了體胚，繼而用固體培養(yǎng)基誘導(dǎo)發(fā)育為植株[19]?？紤]到體胚發(fā)生誘導(dǎo)困難是受到自身材料因素的限制，因此本試驗以薄殼山核桃當(dāng)年生青皮果實的種胚為材料，研究不同培養(yǎng)器皿、培養(yǎng)條件、基本培養(yǎng)基類型及植物生長調(diào)節(jié)劑的搭配對薄殼山核桃植株再生的影響，通過種胚誘導(dǎo)途徑建立薄殼山核桃穩(wěn)定的組織培養(yǎng)體系，為以后薄殼山核桃組織培養(yǎng)試驗提供試驗基礎(chǔ)，并對薄殼山核桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及預(yù)處理

試驗材料采自健康壯碩的薄殼山核桃品種成年大樹，采樣地點為江蘇省南京市六合區(qū)雄州鎮(zhèn)綠宙薄殼山核桃果園基地。試驗選擇2個品種，分別為‘波尼’（‘Pawnee’）和‘馬罕’（‘Mahan’），選擇果型正常，大小均一，無病蟲害的成熟的青皮果實。于2015年9月采集做好標(biāo)記，用冰盒帶回實驗室存于冰箱內(nèi)備用。

將采集的青皮果子剝?nèi)デ嗥?，自來水沖洗浸泡2 d，在0.1%HgCl2溶液中浸泡10～15 min，蒸餾水洗4～6次[20]。于超凈工作臺上剝?nèi)ネ鈿?，剝?nèi)》N仁放入0.1%HgCl2溶液中浸泡2～5 min，再用蒸餾水沖洗6次，然后切取種胚接入培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2 種胚誘導(dǎo)中不同培養(yǎng)皿的選擇

組織培養(yǎng)中種胚誘導(dǎo)培養(yǎng)皿以240 mL玻璃瓶和140 mL試管進(jìn)行對比，培養(yǎng)皿的選擇是促進(jìn)胚根生長的的重要因素，它可以對根產(chǎn)生脅迫作用，使其向下伸展。適合的培養(yǎng)器皿能夠為種胚的組織培養(yǎng)提供更好的生長條件。

1.3 基本培養(yǎng)基的篩選

根據(jù)試驗設(shè)計的培養(yǎng)基配方及前人對核桃及山核桃種胚誘導(dǎo)組織培養(yǎng)中的經(jīng)驗，以MS和改良的DKW為基本培養(yǎng)基誘導(dǎo)胚芽和胚根的分化，各培養(yǎng)基均添加蔗糖40 g/L，瓊脂5.8 g/L，pH：5.8～6.0，所有配好的培養(yǎng)基經(jīng)高壓蒸汽滅菌。每處理接種10管，每管接種1個外植體，重復(fù)3次。接種后放入組培室進(jìn)行培養(yǎng)，20 d后觀察生長狀況。

1.4 培養(yǎng)條件

組培室內(nèi)：初代培養(yǎng)過程以16 h光照+8 h黑暗處理和全黑暗處理培養(yǎng)為對比，培養(yǎng)25 d左右，光照以日光燈作為光源，光強2 400～2 600 lx，培養(yǎng)溫度為（23±2）℃，空氣相對濕度保持在75%左右。

1.5 胚芽與胚根的誘導(dǎo)

全部過程在無菌環(huán)境下進(jìn)行：將剝?nèi)『笙具^的種仁使用滅菌過的鑷子固定，用刀片沿胚軸切取種胚，接入培養(yǎng)基內(nèi)，接種方式以豎直插入為主，沿胚軸用滅菌過的刀片切取一個小的切口有助于幼胚萌發(fā)，用鑷子夾取沒入培養(yǎng)基1/3即可，每瓶一個[21-22]。A.MS+6-BA4.0 mg/L + VC2.0 mg/L；B.改良的DKW+6-BA4.0 mg/ L +VC2.0 mg/L；C.改良的DKW+KT2 mg/L+6-BA1 mg/L+ IBA0.01 mg/L；D.改良的DKW+6-BA2.0 mg/L和NAA0.05 mg/L。觀察‘波尼’和‘馬罕’2個不同品種在4種培養(yǎng)基中的生長狀況，挑選最適合種胚誘導(dǎo)的組織培養(yǎng)方法。接種后20 d左右統(tǒng)計其胚芽和胚根的誘導(dǎo)萌發(fā)率及污染率。萌發(fā)率=誘導(dǎo)出的胚根或胚芽/接種的外植體數(shù)×100%；污染率=污染的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100%。

1.6 統(tǒng)計指標(biāo)

培養(yǎng)20 d左右對進(jìn)行試驗的外植體進(jìn)行記錄，觀察胚根和胚芽長度、生長周期、以及種子的發(fā)芽狀況，并運用LSD進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)皿對外植體胚根誘導(dǎo)的影響

通用的玻璃培養(yǎng)皿有兩種：分別用140 mL的試管（圖1, a）和240 mL的玻璃瓶培養(yǎng)（圖1, b）。每瓶一個外植體，在同等數(shù)量、同等培養(yǎng)條件以及相同品種和培養(yǎng)周期的情況下進(jìn)行對比，140 mL試管培養(yǎng)在胚根活動3 d左右會脅迫胚根向下伸長進(jìn)入培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行生長，能夠及時汲取營養(yǎng)，促進(jìn)胚根的生長發(fā)育；240 mL玻璃瓶會限制胚根，無法脅迫胚根向下生長，造成胚根不能進(jìn)入培養(yǎng)基中吸收營養(yǎng)，從而延長生長周期，延緩生長進(jìn)度。

圖1 兩種培養(yǎng)皿中胚根的生長狀況（9 d）Fig.1 The root growth conditions of different culture dish (9 d)

2.2 不同培養(yǎng)條件對外植種胚根與胚芽生長的影響

不同植物類別、不同的培養(yǎng)部位及不同的培養(yǎng)時間對培養(yǎng)的環(huán)境也有所不同。在植物組織培養(yǎng)中，光照也是影響植物生長的關(guān)鍵因素[23]。在薄殼山核桃種胚誘導(dǎo)過程中，分為兩種培養(yǎng)條件進(jìn)行對比，結(jié)果如下：

表1 不同光照條件下薄殼山核桃種胚的胚性誘導(dǎo)率(%)Table 1 Zygote embryo inductivity of pecan in different light condition

2個品種的薄殼山核桃試驗結(jié)果說明15 d內(nèi)全黑暗培養(yǎng)和正常光照培養(yǎng)種胚誘導(dǎo)的存在差異，全黑暗培養(yǎng)的種胚誘導(dǎo)效果顯著，更能促進(jìn)種胚的生長和發(fā)育，且培育周期短，胚根與胚芽的生長狀況良好，并且子葉能正常展開[24-27]。

2.3 不同培養(yǎng)基及植物生長調(diào)節(jié)劑搭配對種胚誘導(dǎo)的影響

采用薄殼山核桃‘波尼’和‘馬罕’兩個不同品種進(jìn)行種胚誘導(dǎo)的摸索試驗，每種品種試驗4種培養(yǎng)基進(jìn)行種胚誘導(dǎo)的比較，但是不同的品種和材料在不同的培養(yǎng)基上有不同的生長發(fā)育進(jìn)程。所以，不同品種之間、不同培養(yǎng)基之間以及不同品種同一培養(yǎng)基之間種胚誘導(dǎo)水平的變化趨勢是不一致的[28-29]。經(jīng)過數(shù)據(jù)對比及方差分析顯示‘波尼’品種：A處理與D處理對胚根的誘導(dǎo)呈顯著性差異，在對胚芽的生長上并無太大差別；而相對于種胚誘導(dǎo)率來說，A處理與B、C、D處理間都存在顯著性差異，B與D和C與D之間相差不大（表3；圖2，a、b、c、d）。‘馬罕’品種對于胚芽與胚根誘導(dǎo)則與‘波尼’相反：A與B、C處理對胚芽的誘導(dǎo)呈顯著性差異，在對胚根的生長上并無太大差別；而相對于種胚誘導(dǎo)率來說，B和D與C和D處理間都存在顯著性差異（表2；圖 3，e、f、g、h）。

2.4 薄殼山核桃種胚胚根與胚芽誘導(dǎo)過程

薄殼山核桃種胚胚根與胚芽從第1 d至第25 d誘導(dǎo)生長的過程見圖4。

3 結(jié)論與討論

組織培養(yǎng)技術(shù)不僅能遺傳其優(yōu)良的品性，而且能加快品種改良的進(jìn)程、提高改良的效果在很大程度上支持了薄殼山核桃優(yōu)良品種繁殖的進(jìn)程[4]。到目前為止，薄殼山核桃種胚誘導(dǎo)的組織培養(yǎng)試驗已得到初步研究成果。在進(jìn)行的整個試驗中，培養(yǎng)皿的選擇、光照及植物生長調(diào)節(jié)劑的配比和培養(yǎng)基的選擇對薄殼山核桃的種胚誘導(dǎo)具有決定性的作用[30-33]。

圖2 不同光照條件下薄殼山核桃種胚誘導(dǎo)狀況（‘波尼’）Fig.2 Zygote embryo of pecan in different light condition (‘Pawnee’)

表2 不同培養(yǎng)基處理下胚根與胚芽及種胚誘導(dǎo)率的多重比較（LSD）?Table 2 LSD test of induction of different medium

圖3 薄殼山核桃不同品種不同培養(yǎng)基培養(yǎng)15 d的生長狀況Fig.3 Roots and shoots of ‘Pawnee’ and ‘Mahan’ using different mediums at 15 days

圖4 薄殼山核桃種胚胚根與胚芽誘導(dǎo)過程Fig.4 Inducting process of pecan embryo radicle and embryo

該試驗針對目前市場上主推產(chǎn)品的兩個品種‘波尼’和‘馬罕’，研究結(jié)果表明，在前期整個誘導(dǎo)過程中的培養(yǎng)條件下能夠成功誘導(dǎo)出胚根與胚芽，誘導(dǎo)萌發(fā)率也相對較高且長勢良好，污染率幾乎為零，并初步得到薄殼山核桃‘波尼’品種種胚誘導(dǎo)的基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基（A），在蔗糖濃度為40 g/L全黑暗條件培養(yǎng)，種胚誘導(dǎo)率可達(dá)93.5%；對于‘馬罕’品種來說以改良的DKW培養(yǎng)基（B）相對較好，在相同條件下種胚誘導(dǎo)率可達(dá)91.67%。且大量實驗表明，蔗糖能支持絕大多數(shù)植物離體組織及器官的旺盛生長，因此被作為植物組織培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)碳源廣泛使用。它的濃度關(guān)系到滲透勢和能量的供應(yīng)，是核桃體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)和培養(yǎng)的關(guān)鍵之一，而對于薄殼山核桃種胚誘導(dǎo)種蔗糖的濃度的研究可進(jìn)一步深入探討[4]。并且，這幾種培養(yǎng)基處理對‘波尼’胚芽誘導(dǎo)和‘馬罕’胚根誘導(dǎo)的生長并無顯著性差異，數(shù)值變化趨于接近，對此，出現(xiàn)這種情況的緣由可進(jìn)一步摸索。其次，這只是針對薄殼山核桃青皮果實的種胚，而對于完全成熟的果實種胚誘導(dǎo)的培養(yǎng)基成分和條件還有待進(jìn)一步的深入探討。

此外，在對薄殼山核桃愈傷組織增殖的試驗中，植物生長調(diào)節(jié)劑的配比、培養(yǎng)基的選擇、生長的環(huán)境以及受實驗材料和條件限制的各種情況都是即將摸索和克服的對象，以期能建立完善的薄殼山核桃種胚誘導(dǎo)的組織培養(yǎng)體系[34-35]。并且，對于薄殼山核桃后期壯根及葉片的生長并進(jìn)行移栽試驗將會是下一步研究的重點。

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Research on the zygote embryo tissue culture of different pecan cultivars

CAO Fan1,2, FENG Gang1,2, TAN Pengpeng1,2, ZHANG Jie1, YANG Hong1, PENG Fangren1,2
(1. College of Forestry, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, Jiangsu, China;2. Co-Innovation Center for Sustainable Forestry in Southern China, Nanjing 210037, Jiangsu, China)

In order to promote the development of pecan industry, shorten the period of pecan seedling culture and provide the quality of pecan cultivar seeding, this research studied on pecan tissue culture. The materials were the zygote embryo of mature green husk nut from different pecan cultivars. And research was consisted of selection of the medium, plant growth regulator matching and some other factors which in fluenced explant tissue culture. The main results were as follows: (1) In tissue culture techniques of pecan, the higher induction rate of shoot and root using zygote embryo of pecan’s current mature green husk nut as experimental material. Pecan seeds were disinfected 10～15 min with 0.1% corrosive sublimate, and zygote embryo were disinfected 5 min with 0.1% corrosive sublimate,each container was inoculated one explant could reduce pollution 5%. (2) In pecan zygote embryo study, the ‘Pawnee’ induction rate of shoots and roots: A＞C＞D＞B (different treatment group); the‘Mahan’ induction rate shoots and roots: B＞C＞A＞D (different treatment group). (3) 140 mLvitro culture promoted root development rather than usual containerand shortened zygote embryo period.The best growth condition was that the zygote embryo culturedin the context of 40 g/L sucrose and all dark environment.

Carya illinoensis; zygote embryo induction; medium

S722.3+7；S664.1

A

1673-923X(2017)08-0018-06

10.14067/j.cnki.1673-923x.2017.08.004

2016-03-10

國家林業(yè)局948項目“美國山核桃遺傳資源及富根容器育苗技術(shù)引進(jìn)”（2015-4-16）；江蘇省林業(yè)三新工程項目[Lysx2016(44)]；江蘇省高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項目（PAPD）

曹 凡，博士研究生

彭方仁，教授，博士研究生導(dǎo)師；E-mail:frpeng@njfu.edu.cn

曹 凡，馮 剛，譚鵬鵬，等. 不同品種薄殼山核桃種胚組織培養(yǎng)研究[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報，2017, 37(8): 18-23.

[本文編校：文鳳鳴]