楊義杰 ，王穎 ，，張東杰 ，沈琰 ，張桂芳 ，趙雅楠

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶 163319；2.國(guó)家雜糧工程技術(shù)研究中心）

不同SSR標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)在蕓豆品種的遺傳多樣分析中的應(yīng)用

楊義杰1，王穎1，2，張東杰1，沈琰1，張桂芳2，趙雅楠1

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶 163319；2.國(guó)家雜糧工程技術(shù)研究中心）

以黑龍江省20份蕓豆品種為材料，分別應(yīng)用銀染法和熒光檢測(cè)法檢測(cè)8對(duì)SSR引物的擴(kuò)增產(chǎn)物。聚類(lèi)分析表明，兩種方法均能將供試品種鑒別開(kāi)，熒光檢測(cè)法的等位變異及PIC較聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)更多更高，熒光檢測(cè)法檢測(cè)出的遺傳多樣性指數(shù)略高于銀染法。結(jié)果表明熒光檢測(cè)法較銀染法靈敏度更高、檢測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確，更適于用于遺傳多樣性分析。

蕓豆；SSR；銀染法；熒光檢測(cè)法；遺傳多樣性

目前檢測(cè)SSR-PCR產(chǎn)物的方法主要包括3種：（1）瓊脂糖凝膠電泳（AGE），在電泳操作中，需用溴化乙錠（EB）做染料，EB具有強(qiáng)致癌性，對(duì)身體有害，且分辨率低，常用于產(chǎn)物的初步檢測(cè)。（2）聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE），分辨率較高（測(cè)序膠可檢測(cè)到1 bp的核苷酸差異），但操作過(guò)程復(fù)雜，檢測(cè)耗時(shí)耗力。（3）熒光標(biāo)記-毛細(xì)管電泳檢測(cè)法，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物以峰的形式表現(xiàn)，顯示擴(kuò)增片段的大小，具有高分辨率、高通量及分析過(guò)程自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)[1-3]。利用SSR熒光標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)在小麥、水稻、玉米等多種作物種質(zhì)資源的評(píng)價(jià)和遺傳多樣性分析等方面均有應(yīng)用[4-6]。在對(duì)蕓豆的研究中還未見(jiàn)報(bào)道。為促進(jìn)SSR熒光標(biāo)記技術(shù)在蕓豆中的應(yīng)用，研究對(duì)SSR標(biāo)記銀染法和熒光檢測(cè)法2種檢測(cè)方法進(jìn)行比較，分別應(yīng)用PAGE-銀染法和熒光檢測(cè)法對(duì)黑龍江省部分種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，為SSR檢測(cè)技術(shù)的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料來(lái)源于黑龍江省代表性且栽培面積大的20份蕓豆品種（表1）。引物為前期篩選8對(duì)核心引物，具體信息見(jiàn)表2。

表1 20份供試材料Table 1 20 cultivars of kidney bean for SSR analysis

表2 8對(duì)引物序列Table 2 8 pairs of primer sequences

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組提取

20個(gè)蕓豆品種基因組提取取新鮮菜豆葉片約0.2 g于研缽中，加入液氮迅速研磨成粉末。提取總DNA方法為采用改良的2%的CTAB法[7-9]，用瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)檢測(cè)總DNA后稀釋成100 ng·μL-1，儲(chǔ)存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 熒光引物與普通引物的PCR擴(kuò)增

基于非變性聚丙烯酰胺結(jié)合銀染技術(shù)的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系配置（表3）：

表3 SSR標(biāo)記20 μL體積擴(kuò)增反應(yīng)體系Table 3 The reaction of SSR markers in the 20 μL volume

PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性15 s，依據(jù)各引物退火溫度復(fù)性15 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；最終72℃延伸10 min。

基于毛細(xì)管電泳的熒光電泳檢測(cè)技術(shù)的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系配置見(jiàn)表4。

表4 SSR標(biāo)記20 μL體積擴(kuò)增反應(yīng)體系Table 4 The reaction of SSR markers in the 20 μL volume

PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性15 s，依據(jù)各引物退火溫度復(fù)性15 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；最終72℃延伸10 min。

1.2.3 不同檢測(cè)方法檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物

（1）聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)

擴(kuò)增產(chǎn)物采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，電泳在Sequi-Gen GT核酸電泳系統(tǒng) （Bio-Rad，USA）中進(jìn)行。然后通過(guò)改良的銀染方法進(jìn)行染色：固定液（含50%乙醇和2%的醋酸）固定3 min；倒掉固定液，蒸餾水洗1次，時(shí)間30 s，加入染色液（0.2%的硝酸銀）染色5 min；倒掉染色液，蒸餾水洗2次，每次時(shí)間30 s，加入顯色液（3%NaOH和0.5%甲醛），至譜帶清晰為止，拍照統(tǒng)計(jì)位點(diǎn)[10]。

（2）毛細(xì)管電泳檢測(cè)

首先，利用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)所有擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)，每個(gè)樣品取5 μL產(chǎn)物，電泳90 V電壓約1 h。若結(jié)果良好則進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)。

將甲酰胺與分子量?jī)?nèi)標(biāo)按100∶1的體積比混勻后，取15 μL加入上樣板中，再加入1 μL稀釋10倍的PCR產(chǎn)物。然后使用3730XL測(cè)序儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳，利用Genemarker中的Fragment（Plant）片段分析軟件對(duì)測(cè)序儀得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，將各泳道內(nèi)分子量?jī)?nèi)標(biāo)的位置與各樣品峰值的位置做比較分析，得到片段大小[11-13]。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)數(shù)據(jù)記錄在相同遷移位置，有帶記作1，無(wú)帶記作0；將熒光檢測(cè)法得到峰圖同樣轉(zhuǎn)化成0、1字符串，有效峰記為1，無(wú)效記為0。將兩個(gè)檢測(cè)方法所得到的數(shù)據(jù)均利用NTSYS-pc 2.10e軟件計(jì)算供試材料的遺傳距離，采用類(lèi)平均法UPGMA聚類(lèi)分析；利用Popgene version 1.32軟件計(jì)算Nei基因多樣性指數(shù)H和Shannon信息指數(shù)I。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光檢測(cè)法與銀染法的比較

應(yīng)用8對(duì)具多態(tài)性且特異性好的引物對(duì)黑龍江省20個(gè)蕓豆品種進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳-銀染法進(jìn)行電泳檢測(cè)，8個(gè)SSR標(biāo)記共檢測(cè)出40個(gè)等位基因，每個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)出的等位基因數(shù)為4~7個(gè)，平均每個(gè)位點(diǎn)5個(gè)，多態(tài)性信息指數(shù)PIC范圍為0.568 8~0.801 4，平均0.685 0；通過(guò)毛細(xì)管電泳檢測(cè)共檢測(cè)到61個(gè)等位基因，每個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)出的等位基因數(shù)為6~11個(gè)，平均7.62個(gè)多態(tài)性信息指數(shù)PIC范圍為 0.678 9~0.820 5，平均 0.759 7（表 5）。

表5 2種方法檢測(cè)出的等位變異的對(duì)比Table 5 Comparison of allelic variations obtained by the two detection methods

毛細(xì)管電泳技術(shù)在每個(gè)位點(diǎn)平均檢測(cè)到的等位變異比PAGE-銀染法多2個(gè)，且PIC含量要高于PAGE檢測(cè)的PIC，表明熒光檢測(cè)法具有更高的靈敏性，更適于做遺傳遺傳多樣性分析。

2.2 兩種檢測(cè)技術(shù)對(duì)黑龍江省蕓豆的遺傳多樣性分析

2.2.1 銀染法檢測(cè)分析蕓豆遺傳多樣性

根據(jù)PAGE-銀染對(duì)蕓豆的檢測(cè)數(shù)據(jù)來(lái)看，8對(duì)引物能夠?qū)?0個(gè)品種完全區(qū)分，品種間遺傳相似系數(shù)為0.38~0.95之間，聚類(lèi)圖顯示在遺傳相似系數(shù)0.47處將20份蕓豆品種分為2個(gè)類(lèi)群，如圖1所示，第Ⅰ類(lèi)即奶花蕓豆、紅花蕓豆與小黑蕓豆共3個(gè)品種，其余17個(gè)品種為第Ⅱ類(lèi)。在遺傳相似系數(shù)0.65處將20份蕓豆品種分為4個(gè)類(lèi)群，第Ⅰ類(lèi)包括奶花蕓豆、紅花蕓豆與小黑蕓豆；第Ⅱ類(lèi)包括白花腰豆；第Ⅲ類(lèi)包括兔子腿、黑花蕓豆、窩朗豆、60天還家、花臉豆2號(hào)、特大莢、花蕓豆、黃蕓豆；第Ⅳ類(lèi)包括雜花豆1號(hào)、矮飯豆、花腰豆、紫白花豆、大馬掌、花臉豆1號(hào)、雙色蕓豆、雜花蕓豆。

利用POPGENE軟件進(jìn)行多樣性分析，結(jié)果表明，反映蕓豆品種遺傳多樣性Shannon信息指數(shù)I為1.149 1~1.821 7，Nei基因多樣性指數(shù)H為0.617 3~0.825 0（表 6）。

圖1 20個(gè)蕓豆品種聚類(lèi)分析圖（PAGE）Fig.1 UPGMA dendrogram of 20 common bean cultivars（PAGE）

表6 2種方法檢測(cè)出的遺傳多樣指數(shù)的對(duì)比Table 6 Comparison of genetic diversity index by the two detection methods

2.2.2 熒光檢測(cè)法分析蕓豆遺傳多樣性

熒光檢測(cè)法數(shù)據(jù)顯示，8對(duì)引物能夠?qū)?0個(gè)品種完全區(qū)分開(kāi)，品種間遺傳相似系數(shù)為0.52~0.92。聚類(lèi)圖顯示在遺傳相似系數(shù)0.64處將20份蕓豆品種分為2個(gè)類(lèi)群，第Ⅰ類(lèi)群為小黑蕓豆，第Ⅱ類(lèi)為其余19個(gè)品種。在遺傳相似系數(shù)0.67出將將20份蕓豆品種分為3個(gè)亞類(lèi)群，第一亞類(lèi)群為小黑蕓豆，第二亞類(lèi)群兔子腿、白花腰豆、雜花蕓豆、大馬掌、黃蕓豆、紫白花豆及花臉豆，第三亞類(lèi)群為雜花豆1號(hào)、花腰豆、紅花蕓豆、花臉豆、矮飯豆、60天還家、窩朗豆、奶花蕓豆、特大莢、花蕓豆（YD8）、黑花蕓豆、雙色蕓豆。

同樣利用POPGENE軟件進(jìn)行多樣性分析，結(jié)果顯示，Shannon信息指數(shù) I為 1.467 0~1.993 9，Nei基因多樣性指數(shù)H為0.723 7~0.826 5（表6）。

圖2 20個(gè)蕓豆品種聚類(lèi)分析圖（毛細(xì)管電泳）Fig.2 UPGMA dendrogram of 20 common bean cultivars（CE）

2.2.3 2種檢測(cè)法分析蕓豆品種遺傳多樣性的差異

PAGE-銀染與熒光檢測(cè)法檢測(cè)分析的結(jié)果均顯示出，黑龍江省蕓豆品種遺傳多樣性較高。銀染法相似系數(shù)0.38~0.95，小黑蕓豆與雙色蕓豆之間相似系數(shù)最小為0.38，而熒光檢測(cè)法的相似系數(shù)是0.52~0.92，小黑蕓豆與雙色蕓豆之間相似系數(shù)最小0.52。兩者檢測(cè)方法均表明二者親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。而銀染法相似系數(shù)最大的是60天還家與花臉豆（YD17），熒光檢測(cè)法的相似系數(shù)最大的是紅花蕓豆與花腰豆，兩者檢測(cè)的結(jié)果不同。

熒光檢測(cè)法檢測(cè)出的遺傳多樣性指數(shù)略高于銀染法，可能是由于熒光檢測(cè)法檢出一些等位變異，在銀染中未檢測(cè)出（例如引物BM160銀染法檢測(cè)出7個(gè)等位變異，熒光檢測(cè)出11個(gè)），而這些等位變異可能體現(xiàn)了品種間遺傳背景的不同，銀染法卻無(wú)法檢測(cè)出這些等位基因，即一些信息被掩蓋了。

3 結(jié)論與討論

研究對(duì)常規(guī)銀染法和熒光檢測(cè)法2種檢測(cè)SSR-PCR產(chǎn)物的方法進(jìn)行了比較，選取8對(duì)多態(tài)性及特異性較好的引物，分別用銀染法和熒光檢測(cè)法對(duì)20個(gè)黑龍江省20個(gè)品種進(jìn)行遺傳多樣性分析。兩種方法均能將供試品種鑒別開(kāi)，但由于熒光檢測(cè)法可檢測(cè)到的等位變異數(shù)量較銀染法更多、更精確，可將具有相似遺傳背景的品種有效區(qū)分。因此，熒光檢測(cè)法反映的品種間的遺傳多樣性較銀染法略高。

熒光檢測(cè)法得到的等位基因差異最小為2 bp，PAGE-銀染測(cè)法得到的等位基因差異最小為4 bp。毛細(xì)管電泳熒光檢測(cè)法檢測(cè)樣品時(shí)含有分子量?jī)?nèi)標(biāo)，DNA片段大小與其泳道內(nèi)分子量?jī)?nèi)標(biāo)相比就可精確獲得。而變性PAGE銀染法檢測(cè)的不同樣品DNA片段大小，所得片段大小只能用肉眼與分子量標(biāo)準(zhǔn)（Marker）相比較估測(cè)得出，且離Marker泳道較遠(yuǎn)的泳道的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性也會(huì)受到一些影響。銀染法數(shù)據(jù)收集依賴(lài)于人工讀帶，會(huì)有人為誤差。而熒光標(biāo)記技術(shù)自動(dòng)智能化，在數(shù)據(jù)收集、處理上采用軟件分析，工作效率大大提高，數(shù)據(jù)更加準(zhǔn)確。

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Application of Different SSR Markers Detection Technology on Genetic Diversity Analysis of Common Bean Varieties

Yang Yijie1，Wang Ying1,2，Zhang Dongjie1，Shen Yan1，Zhang Guifang2，Zhao Yanan1
（1.College of Food，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；2.National Coarse Cereals Engineering Research Center）

20 kidney bean cultivars from Heilongjiang Province as materials，silver staining and fluorescence detection were applied to detect 8 pairs of SSR primers amplified products.Cluster analysis showed that both two methods could identify the tested varieties，compared with polyacrylamide gel electrophoresis detection，equipotential variation and PIC of fluorescence detection method could detect much more and higher，the genetic diversity index by fluorescence detection method was higher than that of silver staining method.The results showed that the fluorescence detection method was more sensitive and accurate than the silver staining method，and it was more suitable for the analysis of genetic diversity.

Common bean（Phaseolus vulgaris）；SSR；silver-staining；fluorescence detection；genetic diversity

S529

A

1002-2090（2017）06-0001-05

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.06.001

2016-06-22

黑龍江省應(yīng)用技術(shù)與開(kāi)發(fā)重大項(xiàng)目（GA14B104）；“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD34B02）。

楊義杰（1989－），女，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院2013級(jí)碩士研究生。

張東杰，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：zdj_66@126.com。