國寶煥，趙宏森，楊樹，付天恒，曹有鑫，靳學(xué)慧，張亞玲

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)/黑龍江省植物抗性研究中心，大慶 163319）

黑龍江省稻瘟病菌對咪鮮胺的耐藥性研究

國寶煥，趙宏森，楊樹，付天恒，曹有鑫，靳學(xué)慧，張亞玲

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)/黑龍江省植物抗性研究中心，大慶 163319）

咪鮮胺是防治水稻稻瘟病常用藥劑，為明確其產(chǎn)生耐（抗）藥性的風(fēng)險，采用物理誘變和化學(xué)藥劑誘變產(chǎn)生耐（抗）藥性菌株8個，再選取其中突變株3個測其對咪鮮胺的抗性水平，結(jié)果表明，耐（抗）性突變體菌株對對咪鮮胺的敏感性與原始親本菌株相比都有明顯下降，耐（抗）性倍數(shù)分別為3.14、5.00和2.06。將選定的3個菌株在咪鮮胺1.0 μg·mL-1濃度PDA培養(yǎng)基下連續(xù)培養(yǎng)5次，其EC50增加，供試菌株對藥劑的敏感性下降。

稻瘟病菌；咪鮮胺；抗藥性

水稻稻瘟病是由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae B.Couch）引起的[1-2]，在世界各水稻種植區(qū)都有發(fā)生。目前，對稻瘟病防治較有效的方法利用抗病品種，輔以必要的化學(xué)防治。三環(huán)唑、稻瘟靈、咪鮮胺、春雷霉素等藥劑是防治稻瘟病的常用藥劑，上個世紀(jì)在日本的山形市農(nóng)業(yè)試驗場施用春雷霉素防治稻瘟病失敗，后來在田間檢測到了大量的抗性菌株[3-4]。在國內(nèi)，早在1990年彭云良等[5]就發(fā)現(xiàn)四川盆地稻瘟菌存在抗稻瘟凈和稻瘟靈的菌株。1998年彭麗年等[6]研究發(fā)現(xiàn)四川省稻瘟病菌菌株對異稻瘟凈產(chǎn)生了較為嚴(yán)重的抗藥性。咪鮮胺（Prochloraz）是一種廣譜性的麥角甾醇生物合成抑制劑，是防治稻瘟病的有效藥劑。張亞玲等[7]于2006年對黑龍江省部分稻區(qū)的稻瘟病的敏感性進(jìn)行了初步探討，發(fā)現(xiàn)參試菌株對咪鮮胺的敏感性有差異。因此，監(jiān)測稻瘟病菌對咪鮮胺的敏感性對稻瘟病的防治是必要的。為此，試驗采用物理誘變和化學(xué)誘變法測定了黑龍江省部分稻區(qū)稻瘟病菌對咪鮮胺敏感性耐（抗）藥性風(fēng)險分析，為生產(chǎn)上更好地應(yīng)用咪鮮胺防治稻瘟病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

參試的10個稻瘟病菌菌株是于2012年采自黑龍江省水稻主產(chǎn)區(qū)，經(jīng)過單孢子分離獲得。這些菌株分別為：2012-001（通河縣）、2012-002（肇源縣）、2012-003（五常縣）、2012-004（阿城市）、2012-005（名山農(nóng)場）、2012-006（林口縣）、2012-007（方正縣）、2012-008（友誼農(nóng)場）、2012-009（木蘭縣）、2012-010（泰來縣）。

1.2 供試藥劑與培養(yǎng)基

施?？耍≒rochloraz，25%米鮮胺乳油），由德國拜耳公司生產(chǎn)。

米糠培養(yǎng)基（500 mL蒸餾水中加入米糠10 g、酵母粉1 g、瓊脂粉5.5 g）和PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，加入1 000 mL蒸餾水中，煮沸30 min，取濾液。加入瓊脂粉20 g，葡萄糖20 g，將濾液定容至1 000 mL，濕熱滅菌）。

1.3 咪鮮胺抗性突變體的誘導(dǎo)及鑒定

物理誘變 將供試菌株于米糠培養(yǎng)基上產(chǎn)孢培養(yǎng)，用無菌水洗下孢子，制作成孢子懸浮液。取孢子懸浮液0.5 mL涂布在含咪鮮胺1.0 μg·mL-1的PDA平板培養(yǎng)基上，于無菌操作臺上，用波長為253 nm的紫外光，距離30 cm，照射30 s，后于26℃培養(yǎng)5 d，能夠長出菌落的為抗藥性突變體，重復(fù)3次，統(tǒng)計突變頻率。

咪鮮胺藥劑誘變 供試菌株在PDA平板上于25℃恒溫培養(yǎng)7 d后，制取菌碟接種于含咪鮮胺濃度為1.0 μg·mL-1的PDA平板培養(yǎng)基上，每平板接種4塊，10次重復(fù)。置于25℃、黑暗條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計角突變率，并從角突變區(qū)挑取菌絲塊至含咪鮮胺濃度為1.0 μg·mL-1的PDA平板上，能夠在含藥平板上正常生長的則為獲得的耐（抗）藥性突變體。

1.4 耐（抗）藥性突變體對咪鮮胺的抗性水平測定

選取物理誘變1株和化學(xué)誘變2株用做抗性水平測定。首先在無藥PDA平板培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)5 d，然后在含有咪鮮胺濃度為 0.0、0.04、0.07、0.1、0.3、0.7、1.0 μg·mL-1的 PDA 平面培養(yǎng)基上進(jìn)行藥劑敏感性檢測，突變體菌株于26℃下培養(yǎng)5 d，然后轉(zhuǎn)接到含咪鮮胺的PDA平板培養(yǎng)基上，3次重復(fù)，5 d后測量菌落直徑，計算耐（抗）藥性突變體的EC50值。用相對耐（抗）藥性質(zhì)數(shù)衡量耐（抗）性水平。

1.5 耐（抗）藥性突變株連續(xù)培養(yǎng)對咪鮮胺的抗藥穩(wěn)定性

隨機(jī)選取化學(xué)藥劑咪鮮胺誘導(dǎo)抗性菌株M-2012-004、M-2012-009 和 M-UV-2012-006-2，在含藥劑咪鮮胺1.0 μg·mL-1PDA培養(yǎng)基內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)5次，測定EC50值，具體研究方法如下：

菌絲生長抑制率 耐（抗）藥性突變菌株和原始親本菌株分別培養(yǎng)5 d后，取5 mm菌碟轉(zhuǎn)接到含相應(yīng)濃度藥劑PDA平板培養(yǎng)基上，于26℃下培養(yǎng)5 d后測量菌落直徑，3次重復(fù)，計算EC50值。

含藥培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)下穩(wěn)定性測定 將耐（抗）藥性菌株接種于1.0 μg·mL-1咪鮮胺PDA平板上，以不含藥劑的培養(yǎng)基作為對照，取直徑5 mm的菌碟到一系列濃度的含咪鮮胺的平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d，測定其EC50值；然后以該次1.0 μg·mL-1平板上的菌碟，重復(fù)以上藥劑試驗過程，連續(xù)培養(yǎng)5次。對照組將誘變耐（抗）藥性菌株在不含咪鮮胺的PDA平板連續(xù)培養(yǎng)5次，測定方法同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 咪鮮胺脅迫下參試菌株突變頻率

供試菌株在含咪鮮胺濃度為1.0 μg·mL-1的PDA平板培養(yǎng)基上1~15 d內(nèi)受到抑制，未有菌絲生長，沒有形成可見的菌落；當(dāng)在此培養(yǎng)基上保存至第18 d時該菌開始緩慢生長，然后漸漸出現(xiàn)角突變區(qū)域，在該培養(yǎng)基上能夠正常生長的角突變區(qū)域邊緣打菌碟轉(zhuǎn)接到含咪鮮胺1.0 μg·mL-1的PDA平板培養(yǎng)基，能夠繼續(xù)生長出菌落的菌株為耐（抗）藥性突變體菌株。從研究結(jié)果可以看出，雖然角突變在此次實驗中數(shù)量較多，共出現(xiàn)47個角突變，但是產(chǎn)生耐（抗）藥性突變的菌株只有8個，占17.02%（表2）。

2.2 耐（抗）藥性突變體菌株抗性水平的測定

通過物理誘變和化學(xué)藥劑馴化的方法獲得突變體8株，選取化學(xué)誘變菌株2株和物理誘變菌株1株，采用含藥PDA平板培養(yǎng)基抑菌試驗法測定各突變菌株的EC50值，試驗結(jié)果表明（表3），稻瘟病菌菌株突變體對咪鮮胺的敏感性與原始親本菌株相比都有明顯下降，突變株EC50分別為0.22（原始菌株EC50為 0.07）、0.10（原始菌株 EC50為 0.02）、0.13（原始菌株EC50為0.05），抗性倍數(shù)分別為3.14、5.00和2.06，從研究結(jié)果可以看出物理誘變的耐（抗）藥性菌株要比化學(xué)誘變的突變體菌株耐（抗）藥性倍數(shù)低。

表1 咪鮮胺脅迫下參試菌株突變頻率Table 1 Mutation strains frequency of the strains under the stress of prochloraz

表2 突變菌株對咪鮮胺的敏感性Table 2 Sensitivity of prochloraz tolerance（resistant）mutants of isolates

表3 突變株在含藥培養(yǎng)基和無毒培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)下的EC50Table 3 EC50（μg·mL-1）of Mutant strains and no fungicide cultivation in different cultivation times

2.3 咪鮮胺連續(xù)培養(yǎng)下耐（抗）藥性突變株EC50值

藥劑誘變耐（抗）藥性菌株和紫外誘變耐（抗）藥性菌株在藥劑選擇壓力下連續(xù)培養(yǎng)5次，測定各誘變菌株各代EC50值，測定結(jié)果見表3。在藥劑的脅迫作用下，各誘變耐（抗）藥性菌株對咪鮮胺的敏感性存在一定變化，菌株M-2012-004的EC50值在0.207 μg·mL-1至 0.22 μg·mL-1間，第 5 次培養(yǎng)的菌株EC50值最高，說明在藥劑脅迫下菌株的抗藥性還有增加的趨勢；M-2012-009菌株在培養(yǎng)第3次時EC50值最高，達(dá)到 0.136 μg·mL-1，再繼續(xù)培養(yǎng)時出現(xiàn)先降再升高的現(xiàn)象，說明突變菌株的耐（抗）藥性略不穩(wěn)定。M-2012-009第3代的EC50值最高，EC50值在一定范圍內(nèi)波動，個別出現(xiàn)了先下降后升高的現(xiàn)象（圖 1）。

圖1 突變株在無藥培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)下的EC50Fig.1 EC50of Mutant strains in no fungicide cultivation in different cultivation times

藥劑誘變抗性菌株和紫外誘變耐（抗）性菌株在無藥條件下連續(xù)培養(yǎng)5次，M-2012-004菌株的各次培養(yǎng)的 EC50值先略有升高，最高值達(dá)到 0.224 μg·mL-1，最低以 0.181 μg·mL-1，第 5 次培養(yǎng)和第一次培養(yǎng) EC50值一致，從這個研究結(jié)果可以看出短時間的無藥培養(yǎng)不會使抗性菌株的敏感性產(chǎn)生大的變化。M-2012-009無藥培養(yǎng)EC50值先升高后下降，物理誘變的菌株MUV-2012-006-2在無藥培養(yǎng)條件下EC50值在升高，第5 次培養(yǎng)時 EC50達(dá)到 0.132 μg·mL-1，說明物理誘變菌株在培養(yǎng)多次后其對藥劑的敏感性下降（圖2）。

圖2 突變株在含藥培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)下的EC50Fig.2 EC50of Mutant strains in fungicide cultivation in different cultivation times

3 討論

研究采用含有咪鮮胺藥劑連續(xù)培養(yǎng)的方法和物理誘變法，誘導(dǎo)其產(chǎn)生扇形角突變，共產(chǎn)生角突變48個，然后將角突變菌株轉(zhuǎn)接含有咪鮮胺1.0 μg·mL-1的PDA平板培養(yǎng)基，在此培養(yǎng)基上能正常生長的菌株有8個。僅占供試菌株的17.02%。從這個研究結(jié)果可以看出在咪鮮胺連續(xù)培養(yǎng)情況下稻瘟病原菌會有（耐）抗藥性菌株產(chǎn)生，關(guān)于這方面的研究在2007年侯東燕等[15]研究遼寧省不同稻區(qū)稻瘟病菌對米鮮胺的敏感性，發(fā)現(xiàn)其敏感性較高，但不同地區(qū)稻瘟病菌菌株對米鮮胺的敏感性是有差異的。在此研究過程中發(fā)現(xiàn)，物理誘變的抗性菌株要比化學(xué)誘變的突變體菌株抗性倍數(shù)低，這說明在不施藥的條件下病菌產(chǎn)生耐（抗）藥性的可能性很低，連續(xù)長期連續(xù)使用咪鮮胺會誘導(dǎo)稻瘟病菌產(chǎn)生耐（抗）藥性。但是在連續(xù)培養(yǎng)過程中各參試菌株的EC50值總體趨勢是增加的，并不是直線上升，主要還是呈現(xiàn)波動上升，說明咪鮮胺耐（抗）突變株的耐（抗）性不穩(wěn)定，在連續(xù)培養(yǎng)條件下其抗性水平保持增高趨勢。這說明在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中如果長期使用咪鮮胺作為防治稻瘟病的藥劑會使田間的稻瘟病菌產(chǎn)生耐（抗）藥性，為延長藥劑使用年限，建議在生產(chǎn)中要多種藥劑配合使用。

［1］ OUS H．Pathogen variability and host resistance in rice blast disease［J］.Annu Rev Phytopathol，1980（18）：167-187.

［2］ Couch B C，Kohn L M A.Multilocus gene genealogy concordant with preference indicates segregation of a new species，Magnaporthe oryzea from M.grisea ［J］.Mycologia，2002，94（4）：683-693.

［3］ YAMAGUCHI T.Resistant strains of rice blast fungus（Pyricularia oryzae Cav.）against fungicides in Japan［J］.Japan Agri-cultural Research，1988，21（4）：257-263.

［4］ FUJI S I KOIZUMI S.Distridition of fungicide（iprobenfos，edifenphos and kasugamycin）resistant stains of rice blast fungus in paddy fields［J］.Research Bullettin of the Aichi ken Agricultual Research Center，1993，25：103-106.

［5］ 彭云良，劉經(jīng)芬，葉鐘音.稻瘟病菌對異稻瘟凈的抗藥性研究［J］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1990，13（14）：45-48.

［6］ 彭麗年，陳國華．四川省稻瘟病菌的抗藥性研究［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998.

［7］ 張亞玲，靳學(xué)慧.稻瘟病菌菌株對三環(huán)唑的敏感性分析［J］.現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)，2006，328（11）：6-8.

［8］ 侯東艷，趙躍鋒，劉志恒，等.遼寧省稻瘟病菌對咪鮮胺的敏感性檢測［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（16）：4883.

Drug Tolerance Research of Magnaporthe oryzae to Prochloraz in Heilongjiang Province

Guo Baohuan，Zhao Hongsen，Yang Shu，F(xiàn)u Tianheng，Cao Youxin，Jin Xuehui，Zhang Yaling
（Heilongjiang Bayi Agricultural University，Heilongjiang Plant Resistance Research Center，Daqing 163319）

Prochloraz was a common fungicide to prevent and cure the rice blast，the method of physical mutation and chemical mutation to induced 8 strains，then select 3 r tolerance （resistant）mutant strains tested resistance levels to Prochloraz was used to identify the risk of fungicide tolerance.The results showed that the sensitivity of rice blast fungus strains of tolerance mutants to Prochloraz declined obviously compared with the original strain，tolerance ratio was 3.14，5.00 and 2.06.The selected 3 resistant strains cultivated in 1.0 μg·mL-1Prochloraz PDA medium 5 times，the EC50increased，and the sensitivity of strains decreased.

magnaporthe oryzae；prochloraz；tolerance

S482.2+6

A

1002-2090（2017）06-0009-04

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.06.003

2016-07-05

黑龍江省自然基金項目（QC2011C046）；黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（xc2014009）；黑龍江省農(nóng)墾總局科技攻關(guān)項目（HNK125A-08-06；HNK125B-03-02；HNK135-02-02）黑龍江省教育廳項目（12521376）。

國寶煥（1993-），女，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物保護(hù)專業(yè)2013級本科生。

張亞玲（1977－），女，副教授，E-mail：byndzyl@163.com。