邢思毅，常敬偉，周玉龍，倪宏波

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319）

牛病毒性腹瀉病毒人工感染泌乳兔試驗(yàn)

邢思毅，常敬偉，周玉龍，倪宏波

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319）

為了解BVDV JH-1毒株對(duì)泌乳兔的致病性，分別采用滴鼻攻毒、口腔灌胃攻毒和靜脈注射攻毒的方法感染泌乳兔。通過測(cè)定感染后泌乳兔的體溫、觀察臨床、病理剖檢和病原學(xué)檢測(cè)等方法，可見泌乳兔接種病毒2 d內(nèi)出現(xiàn)腹瀉，但體溫正常。個(gè)別泌乳兔有排出腸黏膜現(xiàn)象，剖檢可見胃黏膜脫落、腸潰瘍?cè)畹炔∽儭Ｄc道黏膜經(jīng)PCR方法可檢測(cè)到BVDV。結(jié)果說明BVDV首次感染泌乳兔后，對(duì)泌乳兔產(chǎn)生致病性作用。

牛病毒性腹瀉病毒；人工感染；泌乳兔

牛病毒性腹瀉黏膜病毒（Bovine viral diarrheamucosal disease viruses，BVDV）、豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）和羊邊界病毒（Border disease virus，BDV）同屬于黃病毒科（Flavivirdae）瘟病毒屬（Pestivirus）[1]，這三種病毒在血清學(xué)上有具有一定交叉反應(yīng)[2]，牛病毒性腹瀉病毒能感染牛、鹿、山羊、綿羊和豬等多種偶蹄動(dòng)物。BVDV是牛群中最重要的病原之一，給各國(guó)奶牛業(yè)和肉牛業(yè)均造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。牛感染BVDV的癥狀為腹瀉、產(chǎn)奶量下降和發(fā)熱等。牛感染BVDV還能出現(xiàn)免疫抑制，造成病牛潛在感染其他病原微生物[3]。如果BVDV感染妊娠階段母牛，BVDV可穿透胎盤，可引起胎兒流產(chǎn)和弱胎，影響奶牛繁殖性能。感染BVDV免疫耐受的胎兒，可存活胎兒后向外界排毒[4]。家兔可以感染豬瘟病毒，而牛病毒性腹瀉病毒與豬瘟病毒同為一個(gè)病毒屬，它們?cè)诳乖院徒Y(jié)構(gòu)上聯(lián)系密，牛病毒性腹瀉病毒是否能夠人工感染泌乳兔，因而進(jìn)行了BVDV人工感染泌乳兔試驗(yàn)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株與細(xì)胞株

BVDV JH-1毒株和MDBK細(xì)胞均由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)Gen Bank中BVDV基因序列，參考文獻(xiàn)[5，6]，設(shè)計(jì)了擴(kuò)增片段為288 bp的特異引物引物，并優(yōu)化了反應(yīng)條件，由哈爾濱博仕生物公司合成。

BVDV-F：5′-ATGCCCTATAGTAGGACTAGCA-3′

BVDV-R：5′-TCAACTCCATGTGCCATGTAC-3′

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重0.5~1 kg左右泌乳兔，營(yíng)養(yǎng)狀況良好，臨床觀察健康。隔離飼養(yǎng)觀察15 d，每天測(cè)體溫2次，達(dá)到清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的要求，經(jīng)BVDV檢測(cè)抗原、抗體均為陰性。

1.1.4 主要試劑

RNA提取試劑盒購(gòu)自北京博凌科為生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；PCR相關(guān)試劑購(gòu)自Thermo公司。

1.1.5 毒株制備

將BVDV HJ-1毒株接種于長(zhǎng)滿單層MDBK中，收獲病毒細(xì)胞培養(yǎng)物，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.6 病毒毒價(jià)測(cè)定

采用Reed-Muench法計(jì)算測(cè)定病毒的TCID50，病毒效價(jià)為105.2TCID50*mL-1。

1.2 方法

1.2.1 攻毒方法

將21只泌乳兔隨機(jī)分為4組，前3組為實(shí)驗(yàn)組，每組6只，對(duì)照組3只。將BVDV JH-1毒株病毒液分別運(yùn)用滴鼻攻毒、口腔灌胃攻毒和靜脈注射的方法攻毒泌乳兔。滴鼻攻毒計(jì)量為2、4和8 mL；口腔灌胃攻毒計(jì)量為0.5、1和2 mL；靜脈注射攻毒計(jì)量為1、2和4 mL。每個(gè)攻毒計(jì)量作重復(fù)2只，2只·籠-1。對(duì)照組接種同等劑量的MDBK細(xì)胞液。接種后每天采集糞便，冷凍備用，于攻毒后7 d剖殺，無(wú)菌采取腸道黏膜、呼吸道黏膜、脾臟、肝臟和肺臟等置于-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 臨床觀察

接種后每天于下午4點(diǎn)測(cè)1次試驗(yàn)泌乳兔直腸溫體溫和觀察臨床癥狀，記錄數(shù)據(jù)。

1.2.3 BVDV病原學(xué)檢測(cè)

以cDNA為模板利用特異性引物BVDV-F/BVDV-R進(jìn)行PCR反應(yīng)。進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀和剖檢觀察

攻毒后2 d內(nèi)如個(gè)別兔食欲略有減少，飲欲增加，活動(dòng)減少，兩天后即恢復(fù)正常。靜脈注射感染2 mL組泌乳兔出現(xiàn)腹瀉，其他未出現(xiàn)腹瀉現(xiàn)象。如圖1所示，脈注射感染2 mL組泌乳兔有排出腸黏膜現(xiàn)象。剖檢觀察，泌乳兔出現(xiàn)胃黏膜脫落、腸潰瘍?cè)?，其他器官無(wú)明顯病變。

圖1 泌乳兔的臨床癥狀和剖檢觀察Fig.1 Results of the Clinical and autopsy observations in rabbits after infection with BVDV

2.2 體溫變化

攻毒后泌乳兔體溫的變化（圖2），攻毒后2 d內(nèi)泌乳兔體溫均有不同程度的升高，最高體溫達(dá)到39.5℃，但均在泌乳兔正常體溫范圍之內(nèi)。2 d后試驗(yàn)組泌乳兔體溫均恢復(fù)正常，直至處死，體溫一直處于正常狀態(tài)。整個(gè)試驗(yàn)過程中，對(duì)照組泌乳兔體溫正常。

圖2 泌乳兔體溫的變化Fig.2 Results of the temperature in lactating rabbits after infection with BVDV

2.3 病原學(xué)檢測(cè)

將采集呼吸道黏膜、腸道黏膜、肺臟、肝臟和脾臟等組織處理進(jìn)行PCR檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果表明，僅腸道黏膜為陽(yáng)性，擴(kuò)增出大小為288 bp條帶（圖3），擴(kuò)增片段與預(yù)期目的片段大小相符。

圖3 各主要組織器官PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.3 The PCR results of BVDV in 5 infected samples

3 討論

牛病毒性腹瀉病毒以本源動(dòng)物作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象來深入探討疾病發(fā)生機(jī)制，在時(shí)間和空間上存在局限性，且許多實(shí)驗(yàn)在經(jīng)費(fèi)和方法上也受到限制。因此，借助于感染動(dòng)物模型的間接研究，可以有意識(shí)地改變那些在自然條件下不可能或不易排除的因素，以便更準(zhǔn)確地觀察模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果并與本源動(dòng)物疾病進(jìn)行比較研究[7]。牛病毒性腹瀉病毒與豬瘟病毒同屬于瘟病毒屬，血清學(xué)檢測(cè)和核苷酸序列上分析表明兩者在抗原和蛋白組成上有相似性，并較高的同源性，它們具有較高的親緣關(guān)系[8]。豬瘟病毒攻毒感染家兔可使其產(chǎn)生定型熱[9]，而試驗(yàn)結(jié)果表明，牛病毒性腹瀉病毒攻毒泌乳兔后雖然在攻毒后2 d體溫有所升高，但泌乳兔攻毒后沒有出現(xiàn)定型熱反應(yīng)。2006年，鄧宇等[10]用耳緣靜脈的方法將BVDV Oregon C24標(biāo)準(zhǔn)毒株感染3 kg左右家兔，研究了BVDV對(duì)家兔致病性表現(xiàn)，結(jié)果顯示家兔攻毒后6 h體溫有所升高，但6 h后即恢復(fù)正常，家兔對(duì)BVDV毒力具有減弱作用，通過剖檢和臨床觀察，BVDV對(duì)家兔無(wú)致病性表現(xiàn)。2014年，卜凡亮等[11]運(yùn)用牛病毒性腹瀉病毒河南分離株對(duì)家兔的采用腹腔注射方法進(jìn)行感染，通過體溫測(cè)定、臨床觀察1周后剖殺，采用PCR技術(shù)對(duì)血清、脾臟、肝臟、淋巴結(jié)和腸黏膜進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，家兔對(duì)牛病毒性腹瀉病毒河南分離株的感染不呈現(xiàn)明顯癥狀，牛病毒性腹瀉病毒分離株對(duì)家兔無(wú)明顯致病變影響。試驗(yàn)中泌乳兔靜脈注射接毒2 mL組，體溫均在正常內(nèi)，2 d內(nèi)個(gè)別出現(xiàn)腹瀉現(xiàn)象。別泌乳兔有排出腸黏膜現(xiàn)象，剖檢出現(xiàn)胃黏膜脫落、腸潰瘍?cè)畈∽?，說明BVDV首次感染泌乳兔后，對(duì)泌乳兔產(chǎn)生致病性表現(xiàn)。

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Study on Artificial Infection of Bovine Viral Diarrhea Virus on the Lactaing Rabbits

Xing Siyi，Chang Jingwei，Zhou Yulong，Ni Hongbo
（College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

In order to understand the pathogenicity of JH-1 BVDV strain to the lactating rabbits，the lactating rabbits were infected with the methods of nasal drops，oral administration and intravenous injection.The results which were inspcted by measuring body temperature，clinical observation，pathological examination and etiological examination showed that there were diarrhea in 2 days after inoculating virus，but the body temperature was normal.Some lactating rabbits were discharged intestinal mucosa phenomenon，visible gastric mucosal shedding，intestinal ulcer lesions and other lesions.The BVDV was detected from the intestinal mucosa by PCR.The results showed that the lactating rabbits could be infected by BVDV，and it caused a pathogenic effect on the lactating rabbits.

BVDV；lactating rabbit；artificial infection

S858.21

A

1002-2090（2017）06-0013-03

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.06.004

2015-05-24

黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)研究生創(chuàng)新科研項(xiàng)目（YJSCX2014-Y30）；黑龍江省農(nóng)墾總局攻關(guān)項(xiàng)目（HNK125B-11-10A）。

邢思毅（1988-），男，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院2012級(jí)碩士研究生。

倪宏波，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：nihongbo@sina.com。