張梅，馮良，潘娜

1.鄭州市婦幼保健院，河南 鄭州 450000；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000

HPLC法對(duì)決明子中3種有效成分含量的測(cè)定

張梅1，馮良2，潘娜1

1.鄭州市婦幼保健院，河南 鄭州 450000；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000

目的：高效液相色譜法測(cè)定決明子中紅鐮霉素龍膽二糖苷、決明子苷C及橙黃決明素-6-O-β-D-葡萄糖苷3種有效成分的含量。方法：采用Zorbax Eclipse XDB-C18色譜柱，柱溫30℃，以乙腈和四氫呋喃混合溶液（A）-1%冰醋酸（B）（A∶B=30∶70）為流動(dòng)相等度洗脫，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為278 nm。結(jié)果：3種有效成分得到了基線分離。紅鐮霉素龍膽二糖苷、決明子苷 C 及橙黃決明素-6-O-β-D-葡萄糖苷分別在 0.136 4～1.091 μg、0.117 9～0.943 μg、0.126 3～1.010 μg 與相應(yīng)的峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，回歸方程分別為Y=3.78×106X-143 929、Y=2.67×106X-78 435、Y=3.15×106X-108 435；平均加樣回收率分別為100.53%、98.95%、102.30%。對(duì)不同產(chǎn)地決明子藥材進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示3種有效成分的含量差異較大。結(jié)論：經(jīng)過方法學(xué)驗(yàn)證，本方法準(zhǔn)確、可靠、重復(fù)性好，可以為決明子藥材評(píng)價(jià)與質(zhì)量控制提供有效參考。

決明子；紅鐮霉素龍膽二糖苷；決明子苷C；橙黃決明素-6-O-β-D-葡萄糖苷；含量測(cè)定

決明子，又稱草決明、決明，為豆科植物決明或小決明的干燥成熟種子，味甘、苦、咸，性微寒，具有清肝明目、潤(rùn)腸通便的功效[1]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究顯示，決明子主要有效成分為蒽醌類和萘并吡喃酮類，藥理作用主要包括降血脂[2]、調(diào)血壓[3～4]、保肝[5]及抑菌[6]、抗氧化[7]等，在各種降脂減肥的制劑中廣泛應(yīng)用。目前，決明子藥材的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)一般采用提取步驟繁瑣的游離蒽醌類成分為指標(biāo)，忽略了同樣具有生物活性、含量較高的萘并吡喃酮類化合物[8]。為了對(duì)決明子進(jìn)行更好的質(zhì)量控制，本研究采用HPLC法建立了3種有效成分紅鐮霉素龍膽二糖苷、決明子苷C及橙黃決明素-6-O-β-D-葡萄糖苷的含量分析方法，并選取了三個(gè)主要產(chǎn)地的決明子藥材進(jìn)行測(cè)定，為進(jìn)一步完善決明子藥材的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)體系提供依據(jù)和參考。

1 材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀(G1312B型泵，G1329A型自動(dòng)進(jìn)樣器，G1316A型柱溫箱，G1314B型檢測(cè)器，Agilent Chemstation儀器控制及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，德國(guó)安捷倫公司)。Sartioms 2004MP型十萬分之一電子分析天平。

1.2 藥品與試劑

紅鐮霉素龍膽二糖苷、決明子苷C及橙黃決明素-6-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品為自制，經(jīng)HPLC檢測(cè)，面積歸一化法計(jì)算純度大于98%；決明子供試品藥材購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所。各產(chǎn)地藥材樣品購(gòu)自于其省市藥材市場(chǎng)或藥店。乙腈為HPLC級(jí)，甲醇為色譜級(jí)，兩者均購(gòu)自Fisher公司；四氫呋喃、冰醋酸為色譜純，其余試劑均為分析純，購(gòu)自北京百靈威科技有限公司；純凈水由Milli-Q超純水制備系統(tǒng)制備。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Zorbax Eclipse XDB-C18色譜柱(250×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈 -四氫呋喃(90∶10)混合溶液(A)-1%冰醋酸(B)，A相∶B相為30∶70；流速 1.0 mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm，進(jìn)樣量10 μL。在此色譜條件下，對(duì)照品和決明子供試品中紅鐮霉素龍膽二糖苷、決明子苷C及橙黃決明素-6-O-β-D-葡萄糖苷的色譜峰與其他非檢測(cè)成分峰達(dá)到基線分離，無干擾，對(duì)照品與供試品的色譜圖見圖1。

圖1 對(duì)照品(A)和決明子供試品(B)的液相色譜圖

2.2 對(duì)照品溶液的配制

2.2.1 單一對(duì)照品儲(chǔ)備液的配制 分別精密稱取紅鐮霉素龍膽二糖苷、決明子苷C及橙黃決明素-6-O-β-D-葡萄糖苷各5 mg，各置于10 mL量瓶中，分別加90%甲醇溶解并定容至刻度，配制成紅鐮霉素龍膽二糖苷濃度0.545 5 g/L、決明子苷C 0.471 5 g/L、橙黃決明素-6-O-β-D-葡萄糖苷0.505 0 g/L的單一對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2.2 混合對(duì)照品溶液的配制 精密吸取2.2.1中3個(gè)對(duì)照品儲(chǔ)備液各0.5 mL于5 mL量瓶中，并加90%甲醇稀釋至刻度，搖勻配制成含紅鐮霉素龍膽二糖苷濃度0.054 55 g/L、決明子苷C 0.047 15 g/L、橙黃決明素-6-O-β-D-葡萄糖苷0.050 50 g/L的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

將決明子藥材樣品粉碎，過60目篩，精密稱取0.2 g，置于圓底燒瓶中，準(zhǔn)確加入25 mL 90%甲醇，稱量重量后加熱回流2 h，放至室溫，再稱重，用90%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，過濾并棄去初濾液，取續(xù)濾液適量過0.45 μm微孔濾膜后為供試品溶液。

2.4 線性關(guān)系考察

見表1。分別精密吸取2.2.2中混合對(duì)照品溶液2.5，5，10，15，20 μL進(jìn)樣，測(cè)定并記錄峰面積。以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X)、以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，紅鐮霉素龍膽二糖苷、決明子苷C及橙黃決明素-6-O-β-D-葡萄糖苷回歸方程分別為Y=3.78×106X-143 929、Y=2.67×106X-78 435、Y=3.15×106X-108 435，線性范圍分別為0.136 4～1.091 μg、0.117 9～0.943 μg、0.126 3～1.010 μg。

表1 回歸方程與線性范圍

2.5 精密度試驗(yàn)

見表2。精密吸取2.2.2中混合對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，在2.1色譜條件下連測(cè)3天，測(cè)定并記錄峰面積，分別以紅鐮霉素龍膽二糖苷、決明子苷C及橙黃決明素-6-O-β-D-葡萄糖苷色譜峰峰面積計(jì)算精密度，三種有效成分的日內(nèi)精密度、日間精密度均小于3%，表明儀器檢測(cè)的精密度良好。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果 %

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取同一樣品0.2 g，按2.3步驟制備供試品溶液，在2.1色譜條件下，分別在0、1、2、4、8、12、24 h取供試品溶液 10 μL進(jìn)樣測(cè)定，記錄3種被測(cè)成分各次檢測(cè)的峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果紅鐮霉素龍膽二糖苷、決明子苷C及橙黃決明素-6-O-β-D-葡萄糖苷在24 h內(nèi)峰面積的RSD分別為1.9%、1.4%、1.6%。表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取6份同一批次決明子樣品粉末(過60目篩)，每份0.2 g，按2.3中步驟制備供試品溶液，在2.1色譜條件下吸取10 μL進(jìn)樣測(cè)定，記錄各峰面積，并分別計(jì)算紅鐮霉素龍膽二糖苷、決明子苷C及橙黃決明素-6-O-β-D-葡萄糖苷含量的RSD分別為1.9%、2.6%、2.4%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

見表3。精密稱取6份已知含量的決明子樣品粉末(過60目篩)，每份0.05 g，分別加入2.2.1中單一對(duì)照品儲(chǔ)備溶液紅鐮霉素龍膽二糖苷0.55 mL、決明子苷C 0.45 mL及橙黃決明素-6-O-β-D-葡萄糖苷1.2 mL，按2.3中步驟制備供試品溶液，在2.1色譜條件下吸取10 μL進(jìn)樣測(cè)定，回收率=(測(cè)得量-樣品中含量)/加入量，紅鐮霉素龍膽二糖苷、決明子苷C及橙黃決明素-6-O-β-D-葡萄糖苷的平均加樣回收率分別為100.53%、98.95%、102.30%。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.9 決明子藥材樣品含量測(cè)定

見表4。分別精密稱取3個(gè)不同地區(qū)決明子藥材粉末(過60目篩)，按2.3中步驟制備供試品溶液，在2.1色譜條件下吸取10 μL進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜峰面積并計(jì)算含量。

表4 不同地區(qū)決明子藥材含量測(cè)定結(jié)果（n=3） %

3 討論

本研究比較了熱回流提取法、超聲提取法及冷浸提取法3種不同的提取方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)熱回流提取法對(duì)蒽醌苷類和萘并吡喃酮苷兩類物質(zhì)同時(shí)提取的效果相對(duì)較好；在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步比較了70%甲醇、90%甲醇及純甲醇3種溶劑的提取效率，同時(shí)也比較了1 h、2 h、3 h、4 h時(shí)的提取效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用90%甲醇提取效果較好，且2 h時(shí)有效成分已提取完全，因此選擇90%甲醇溶液熱回流提取2 h作為最終的提取方法。此外，本研究比較了乙腈-水溶液、乙腈-1%冰醋酸水溶液、乙腈和四氫呋喃混合溶液-1%冰醋酸水溶液等3個(gè)不同流動(dòng)相系統(tǒng)的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈四氫呋喃(90∶10)混合溶液-1%冰醋酸水溶液等度洗脫對(duì)所測(cè)有效成分達(dá)到基線分離，效果較好。

本研究建立了HPLC法同時(shí)檢測(cè)決明子藥材中紅鐮霉素龍膽二糖苷、決明子苷C及橙黃決明素-6-O-β-D-葡萄糖苷3種成分含量的方法，方法學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法簡(jiǎn)單準(zhǔn)確，重復(fù)性良好，樣品加樣回收率較好，沒有酸水解步驟，可用做決明子藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與控制的方法之一。

本研究應(yīng)用該方法對(duì)3個(gè)不同產(chǎn)地決明子藥材中紅鐮霉素龍膽二糖苷、決明子苷C及橙黃決明素-6-O-β-D-葡萄糖苷含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地決明子藥材中三種成分含量有較大差異，考慮到此三種成分含量均較高，且具有一定生物活性，可以選取其作為體現(xiàn)決明子藥材特征與品質(zhì)的指標(biāo)，為決明子藥材標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范化提供參考。

[1]盧金清，黎強(qiáng)，李肖爽，等．決明子研究進(jìn)展[J]．湖北中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，16(4)：124-126．

[2]張喜，董慧．決明子及其主要成分治療高血脂癥的研究進(jìn)展[J]．現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2014，23(35)：3972-3974．

[3]于海榮，王一帆，陳建雙．決明子蒽醌苷對(duì)兩腎一夾高血壓大鼠左室心肌肥厚及舒張功能的影響[J]．中國(guó)老年學(xué)雜志，2017，37(1)：34-35．

[4]何冰心．川芎決明方合硝苯地平治療高血壓病30例[J]．陜西中醫(yī)，2007，28(10)：1296-1297．

[5]李博萍，陳依雨，潘競(jìng)鏘，等．決明子提取物對(duì)高脂-高果糖誘導(dǎo)非酒精性脂肪肝大鼠的調(diào)脂保肝作用[J]．海峽藥學(xué)，2015，27(9)：21-24．

[6]王立英，王艷珍，吳麗艷，等．響應(yīng)面法優(yōu)化超臨界CO_2萃取決明子揮發(fā)油工藝及其抑菌活性研究[J]．藥物分析雜志，2016，36(4)：594-601．

[7]趙紅巖．決明子生品中游離蒽醌的提取工藝優(yōu)化和抗氧化活性分析[J]．農(nóng)產(chǎn)品加工，2015(7)：30-32．

[8]張小梅，楊榮平，勵(lì)娜，等．決明子中蒽醌類成分的含量測(cè)定[J]．時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2007，18(1)：97-98．

Determination of Content of Three Effective Components in Cassia Seed with HPLC

ZHANG Mei，F(xiàn)ENG Liang，PAN Na

Objective：To establish methods of high performance liquid chromatograph(HPLC)so as to determine content of rubrofusarin gentiobioside，assiaside C and Aurantio-obtusifolin-6-O-β-D-glucopyranoside of cassia seed.Methods：Performed Zorbax Eclipse XDB-C18 column at the temperature of 30℃，and used acetonitrile and tetrahydrofuran(A)-1%acetic acid(B)(A∶B=30∶70)as mobile phase by isocratic elution，with the flow rate being 1.0 mL/min and detection wavelength at 278 nm.Results：Three effective components achieved a baseline resolution.Rubrofusarin gentiobioside，assiaside C and Aurantio-obtusifolin-6-O-β-D-glucopyranoside respectively demonstrated a good linear relationship with the peak area in the range of 0.136 4～1.091 μg，0.117 9～0.943 μg，and 0.126 3～1.010 μg.The respective typical equation was Y=3.78×106X-143 92，Y=2.67×106X-784 35，Y=3.15×106X-108 435 respectively，and their average recovery was 100.53%，98.95%and 102.30% respectively.For the determination of cassia seed from different habitats，the result indicated there was great difference among the content of these three effective components.Conclusion：By methodologyverification，the determination method is accurate，reliable，and of good reproducibility.It can be an effective reference to the evaluation and quality control of cassia seed.

2017-05-19

張梅（1983-），女，主管中藥師，研究方向：中藥學(xué)及醫(yī)院藥學(xué)。

Cassia seed；Rubrofusarin gentiobioside；Assiaside C；Aurantio-obtusifolin-6-O-β-D-glucopyranoside；Content determination

R284.1

A

0256-7415（2018）01-0015-04

10.13457/j.cnki.jncm.2018.01.004

馮天保，鄭鋒玲）