譚燕萍，周福宜，梁慧超，余夢黎，廖金明，鄭麗嫻，姚暉，秦莎莎，張繼平

1.佛山市禪城區(qū)朝陽醫(yī)院，廣東 佛山 528000 2.佛山市第一人民醫(yī)院腦科康復(fù)醫(yī)院，廣東 佛山 528000 3.廣東醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 湛江 524023 4.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣東 廣州 510515 5.南方醫(yī)科大學(xué)附屬佛山醫(yī)院，廣東 佛山 528000 6.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006

HSYA與芍藥苷聯(lián)用對腦缺血再灌注損傷大鼠PI3K、Akt mRNA表達(dá)的影響

譚燕萍1，周福宜1，梁慧超2，余夢黎3，廖金明4，鄭麗嫻4，姚暉5，秦莎莎6，張繼平5

1.佛山市禪城區(qū)朝陽醫(yī)院，廣東 佛山 528000 2.佛山市第一人民醫(yī)院腦科康復(fù)醫(yī)院，廣東 佛山 528000 3.廣東醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 湛江 524023 4.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣東 廣州 510515 5.南方醫(yī)科大學(xué)附屬佛山醫(yī)院，廣東 佛山 528000 6.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006

目的：探討羥基紅花黃色素A（HSYA）與芍藥苷聯(lián)合用藥對急性局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠PI3K/Akt信號通路中PI3K、Akt mRNA表達(dá)的影響。方法：SPF級雄性SD大鼠60只，隨機(jī)分為6組，每組10只，分別為模型組、假手術(shù)組、HSYA組、芍藥苷組、銀杏內(nèi)酯組、合用組。復(fù)制腦缺血再灌注模型。腦缺血1 h再灌注6 h后尾靜脈注射相應(yīng)的藥物7天，每天1次。HSYA組灌胃HSYA溶液5.0 mg/（kg·d）；芍藥苷組灌胃芍藥苷溶液5.0 mg/（kg·d）；合用組是HSYA與芍藥苷聯(lián)合用藥，灌胃HSYA溶液和芍藥苷溶液各5.0 mg/（kg·d）；銀杏內(nèi)酯組灌胃銀杏內(nèi)酯注射液5.0 mg/（kg·d）；模型組和假手術(shù)組灌胃等量生理鹽水。末次給藥2 h后采集相應(yīng)標(biāo)本保存，qRT-PCR法檢測大鼠海馬組織PI3K、Akt mRNA的表達(dá)。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠PI3K mRNA表達(dá)量顯著減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，HSYA組、芍藥苷組、合用組、銀杏內(nèi)酯組大鼠海馬組織中PI3K mRNA的表達(dá)顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與合用組比較，HSYA組、銀杏內(nèi)酯組大鼠PI3K mRNA的表達(dá)量較高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：HSYA與芍藥苷聯(lián)合用藥對腦缺血再灌注損傷模型大鼠的保護(hù)機(jī)制可能與顯著調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路中PI3K mRNA過表達(dá)，微調(diào)Akt mRNA過表達(dá)有關(guān)。

腦缺血再灌注損傷；羥基紅花黃色素A（HSYA）；芍藥苷；PI3K mRNA；Akt mRNA；動物實(shí)驗(yàn)；大鼠

腦卒中具有死亡率高、發(fā)病率高、致殘率高和復(fù)發(fā)率高及并發(fā)癥多的特點(diǎn)，約80%的腦卒中屬于缺血性腦卒中[1]。隨著中國人口老齡化的進(jìn)程，急性缺血性腦卒中不僅成為中國第一位死亡原因，且患病率呈上升趨勢及年輕化趨勢[2～3]。研究發(fā)現(xiàn)，羥基紅花黃色素A(HSYA)與芍藥苷單獨(dú)應(yīng)用及二者聯(lián)合用藥對腦缺血再灌注損傷都具有保護(hù)作用[4～6]。腦卒中的發(fā)生發(fā)展與血小板的活化及抗細(xì)胞凋亡PI3K/Akt信號通路密切相關(guān)[7～8]。本研究通過改良線栓法復(fù)制局灶性腦缺血再灌注模型，觀察海馬組織中PI3K、Akt mRNA表達(dá)情況，探討HSYA與芍藥苷聯(lián)合用藥對抗腦缺血再灌注損傷的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量180～220g，廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(粵)2013-0020。SPF級動物飼養(yǎng)環(huán)境(飼養(yǎng)室的溫度為23～25℃，相對濕度約55%～65%，晝夜溫差小于2℃，噪音≤60 dB，晝夜交替時間為12 h/12 h，且飼養(yǎng)室內(nèi)每天紫外燈照射殺菌2 h)。實(shí)驗(yàn)動物飲用水為高壓滅菌的純凈水、每天換水一次，墊料為高壓滅菌的白楊木屑，鼠籠和墊料每周更換2次，由廣東藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號為SYXK(粵)2012-0125。

1.2 藥物及試劑

羥基紅花黃色素A(Hydroxysafflor Yellow A，HSYA)(純度89.5%，成都康邦生物科技有限公司，批號160301)；芍藥苷(純度98%，南京澤朗生物科技有限公司，批號20150723)；銀杏內(nèi)酯注射液(成都百裕科技制藥有限公司，批號08150404)；Trizolreagent(批號 15596026)，DNase I、RNase-free(批 號 EN0521)，Revertaid reverse transcriptase(批 號EP0442)， dNTP( 批號 R0191)， RibolockRNase inhibitor(批號 EO0381)，均來自 Thermo Fisher Scientific Inc.；KAPA SYBR FAST qPCR Kit Master Mix(Kapa Biosystems.，批號 KK4605)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

Real Time-PCR儀(Applied BiosystemsTM)，石蠟切片機(jī)(德國徠卡儀器公司)，BMJ-A型包埋機(jī)(常州市中威電子儀器有限公司)，高速低溫離心機(jī)(美國Thermo公司)。

1.4 分組及給藥

SPF級雄性SD大鼠60只，隨機(jī)分為6組，每組10只，分別為模型組、假手術(shù)組、HSYA組、芍藥苷組、銀杏內(nèi)酯組、合用組。HSYA組灌胃HSYA溶液5.0 mg/(kg·d)；芍藥苷組灌胃芍藥苷溶液5.0 mg/(kg·d)；合用組是HSYA與芍藥苷聯(lián)合用藥，灌胃HSYA溶液和芍藥苷溶液各5.0 mg/(kg·d)；銀杏內(nèi)酯組灌胃銀杏內(nèi)酯注射液5.0 mg/(kg·d)；模型組和假手術(shù)組灌胃等量生理鹽水。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，復(fù)制腦缺血再灌注模型。腦缺血1 h再灌注6 h后尾靜脈注射相應(yīng)的藥物7天，每天1次。

1.5 模型建立

3%戊巴比妥鈉(3 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，參照文獻(xiàn)[9]方法沿頸部正中線縱向切口，分離右側(cè)頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)、頸內(nèi)動脈(ICA)。使線栓通過CCA“V”型切口部進(jìn)入ICA，結(jié)扎ICA切口和栓線，1 h后拔出線栓，再灌注6 h，造成腦缺血再灌注損傷模型。假手術(shù)組除了不插線栓，其余同其他組。

1.6 神經(jīng)功能評分

參照文獻(xiàn)[10]5級評分方法進(jìn)行評分。0分：正常，無神經(jīng)功能缺損；1分：左側(cè)前爪不能完全伸展，輕度神經(jīng)功能缺損；2分：行走時，大鼠向左側(cè)(癱瘓側(cè))轉(zhuǎn)圈，中度神經(jīng)功能缺損；3分：行走時，大鼠身體向左側(cè)(癱瘓側(cè))傾倒，重度神經(jīng)功能缺損；4分：不能自發(fā)行走，有意識喪失。評分為1～3分者判定造模成功，剔除0分和4分。

1.7 qRT-PCR法測定海馬組織PI3K、Akt mRNA表達(dá)

剔除實(shí)驗(yàn)過程中各組造模不成功(神經(jīng)功能評分為0分或4分)以及造模成功后分組觀察未達(dá)預(yù)定時間死亡的模型大鼠，其余各組存活的大鼠頸椎脫臼處死，開顱取腦，分離右側(cè)海馬組織。Trizol法提取海馬組織總RNA并進(jìn)行純度分析。引物由primer5.0軟件設(shè)計，并由英俊公司合成，PI3K、Akt與內(nèi)參基因序列詳見表1。RNA反轉(zhuǎn)錄與擴(kuò)增嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)束后，確認(rèn)Real-Time PCR的擴(kuò)增曲線和熔解曲線，由電腦自動分析并計算出反應(yīng)體系中待測樣本cDNA達(dá)到設(shè)定閾值的循環(huán)數(shù)(cycle count，Ct)。實(shí)驗(yàn)中各個樣本均做3個復(fù)孔。以假手術(shù)組做對照，使用2－ΔΔCt值計算mRNA相對表達(dá)情況。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

表1 PI3K、Akt和actin的引物設(shè)計

2 結(jié)果

各組大鼠海馬組織中PI3K、Akt mRNA表達(dá)比較，見表2。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠PI3K mRNA表達(dá)量顯著減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。與模型組比較，HSYA組、芍藥苷組、合用組、銀杏內(nèi)酯組大鼠海馬組織中PI3K mRNA的表達(dá)顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與合用組比較，HSYA組、銀杏內(nèi)酯組大鼠PI3K mRNA的表達(dá)量較高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。各組大鼠海馬組織中Akt mRNA的表達(dá)量雖有差異，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表2 各組大鼠海馬組織中PI3K、Akt mRNA表達(dá)比較(±s)

表2 各組大鼠海馬組織中PI3K、Akt mRNA表達(dá)比較(±s)

與假手術(shù)組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.05；與合用組比較，③P＜0.05

組 別假手術(shù)組模型組H SY A組芍藥苷組合用組銀杏內(nèi)酯組n 7 8 8 5 7 7 PI3KmRN A 1.007±0.125 0.843±0.140①0.730±0.084②③0.588±0.055②0.560±0.096②0.767±0.124②③A kt mRN A 1.008±0.110 1.014±0.067 1.029±0.160 1.036±0.158 0.980±0.176 0.974±0.044

3 討論

急性腦缺血再灌注損傷是一個復(fù)雜的生理病理過程，涉及能量代謝障礙、局部酸中毒、炎癥因子釋放、自由基損傷、細(xì)胞凋亡等方面[11～12]，其中海馬區(qū)細(xì)胞的凋亡起著重要的作用。近年研究表明，PI3K/AKT信號通路是一條重要的細(xì)胞內(nèi)抗凋亡信號通路。PI3K是細(xì)胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶家族成員之一，同時也屬于原癌基因，它參與細(xì)胞的生長、代謝、增殖、分化及凋亡等多種生物過程[13]。細(xì)胞內(nèi)重要的信號介導(dǎo)物質(zhì)是PI3K的兩個亞基p85和p110，p85具有調(diào)節(jié)功能，p110具有催化功能，當(dāng)受到來自酪氨酸激酶或G蛋白耦聯(lián)受體的信號后，p110亞基與p85亞基結(jié)合而活化Akt[14]。細(xì)胞生長及抗凋亡的重要的分子是Akt，Akt是PI3K下游主要信號分子及PI3K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)時的重要靶激酶，它是一種絲氨酸(Ser473)/蘇氨酸(Thr308)蛋白激酶[15]，Ser473 是 Akt底物結(jié)合部位磷酸化位點(diǎn)，Thr308是Akt的酶活性中心磷酸化位點(diǎn)。Akt分為3個亞型：Akt1，Akt2及Akt3，它們參與細(xì)胞的生長及增殖，其作用分別是促進(jìn)細(xì)胞的增殖、參與胰島素調(diào)節(jié)代謝的過程及細(xì)胞的生長及分化[16]。活化的Akt通過磷酸化作用激活或抑制下游靶蛋白，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡、增殖、分化、遷移等過程[17]。PI3K/Akt信號通路參與神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的生存、分化，PI3K/Akt的激活對腦缺血再灌注損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用[18]。

本研究發(fā)現(xiàn)給藥7天后，模型組PI3K mRNA的表達(dá)量明顯較假手術(shù)組低，HSYA組、芍藥苷組、銀杏內(nèi)酯組、合用組PI3K mRNA的表達(dá)量明顯較模型組低，表明HSYA、芍藥苷、銀杏內(nèi)酯均能抑制PI3K mRNA過度表達(dá)；合用組PI3K mRNA的表達(dá)量與HSYA組相比有明顯的差別，但與芍藥苷組相比無差別，表明HYSA與芍藥苷聯(lián)合用藥對PI3K mRNA基因表達(dá)的抑制作用較HSYA單獨(dú)用藥效果好。各組大鼠海馬組織中Akt mRNA的表達(dá)量雖有差別，其中合用組較低，但無統(tǒng)計學(xué)意義。

課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，HSYA與芍藥苷聯(lián)合用藥通過上調(diào)PI3K/AKT信號通路中p-Akt的蛋白表達(dá)而發(fā)揮抗急性腦缺血再灌注損傷的作用[6，19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示無論是單用HSYA或芍藥苷，還是兩者聯(lián)合使用均能使大鼠海馬組織中PI3K mRNA表達(dá)顯著降低，其中合用組表達(dá)最低。各組大鼠海馬組織中Akt mRNA的表達(dá)情況中，合用組和銀杏內(nèi)酯組下調(diào)表達(dá)，HSYA或芍藥苷單用則上調(diào)表達(dá)，但各組之間差異不明顯，說明不管單用HSYA或芍藥苷，還是兩者聯(lián)合使用，對Akt mRNA的表達(dá)影響不大。結(jié)果表明HSYA與芍藥苷聯(lián)用通過下調(diào)PI3K mRNA表達(dá)，起到對腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)保護(hù)作用。但這與我們前期研究顯示HSYA與芍藥苷聯(lián)用通過增加PI3K、Akt蛋白的表達(dá)來起作用的結(jié)果不一致，究其原因，分析是：①機(jī)體的反饋抑制，當(dāng)PI3K/Akt信號通路中上游基因PI3K因過度表達(dá)其對下游基因的調(diào)控作用被抑制，其對下游基因的調(diào)控作用減弱，因此Akt基因的表達(dá)趨于正常；②藥物對機(jī)體的作用；③機(jī)體的反饋抑制及藥物的相互作用二者同時兼有；④蛋白調(diào)控表達(dá)可能需要多個基因的作用，這些原因致使PI3K/Akt信號通路被激活后，在腦缺血的前期PI3K、Akt基因表達(dá)為上調(diào)，而在腦缺血的后期基因表達(dá)為下調(diào)，其相關(guān)蛋白的表達(dá)是一直表現(xiàn)為上調(diào)，但這需要動態(tài)觀察PI3K/Akt信號通路中PI3K、Akt基因的表達(dá)情況來證實(shí)。因此課題組后期的實(shí)驗(yàn)研究將會設(shè)計多時間點(diǎn)取材，以此來動態(tài)觀察PI3K、Akt信號通路中PI3K、Akt基因的表達(dá)情況，驗(yàn)證本次研究的結(jié)果。

綜上所述，HSYA與芍藥苷聯(lián)合用藥對腦缺血再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制從基因水平上可能與調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路中PI3K mRNA基因的過表達(dá)和微調(diào)Akt mRNA過表達(dá)有關(guān)，從而發(fā)揮抗急性腦缺血再灌注損傷的作用，未來將進(jìn)一步研究HSYA與芍藥苷聯(lián)合用藥對PI3K/Akt信號通路作用的最佳時間點(diǎn)及其他靶點(diǎn)基因的影響。

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HSYA Combined with Paeoniflorin Has Effect on Expressions of PI3K and Akt mRNA in Rats with Cerebral Ischemia Reperfusion Injuries

TAN Yanping，ZHOU Fuyi，LIANG Huichao，YU Mengli，LIAO Jinming，ZHENG Lixian，YAO Hui，QIN Shasha，ZHANG Jiping

Objective： To observe the effect of hydroxy safflower yellow A(HSYA)combined with paeoniflorin on expressions of PI3K and Akt mRNA in PI3K/Akt signal pathway of rats with acute focal cerebral ischemia reperfusion injuries.Methods：Divided 60 SPF male SD rats into 6 groups，namely the model group，sham operation group，HSYA group，paeoniflorin group，Ginkgolide group，and the combination group，10 rats in each group.Replicated the model of cerebral ischemia reperfusion.After one hour of cerebral ischemia and 6 hours of perfusion the rats were medicated related intravenous injection from posterior caudal vein for 7 days，once a day，continuously HSYA group was given 5.0 mg/(kg·d)of HSYA solution by gavage.Paeoniflorin group was given 5.0 mg/(kg·d)of paeoniflorin solution by gavage.The combination group

5.0 mg/(kg·d)of HSYA combined with 5.0 mg/(kg·d)of paeoniflorin by gavage.Ginkgolide group was given5.0 mg/(kg·d)of Ginkgolide injection by gavage.The model group and sham operation group were given the same amount of normal saline.Collected corresponding samples after 2 hours of the last time of administration，and then reserved them.Detected expressions of PI3K and Akt mRNA in hippocampus of rats by qRT-PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction)method.Results：PI3K mRNA expression levels in rats in the model group were obviously reduced in comparison with those in the sham operation group，the difference being significant(P＜0.01).PI3KmRNA expression levels in hippocampus of rats in HSYA group， paeoniflorin group， Ginkgolide group， and the combination group were evidently declined by comparing with those in the model group，differences being significant(P＜0.05).PI3K mRNA expression levels of rats were higher in HSYA group and Ginkgolide group in comparison with those of the combination group，differences being significant(P＜0.05).Conclusion：The protection mechanism of the combined medications of HSYA and paeoniflorin for rat model of cerebral ischemia reperfusion injuries may be relevant to the evident adjustment of PI3K mRNA over-expression in PI3K/Akt signal pathway and the micro adjustment of Akt mRNA over-expression.

Cerebral ischemia reperfusion injuries；Hydroxy safflower yellow A(HSYA)；Paeoniflorin；PI3K mRNA；Akt mRNA；Animal experiment；Rats

R743

A

0256-7415（2018）01-0011-05

10.13457/j.cnki.jncm.2018.01.003

2017-05-18

佛山市科技攻關(guān)項(xiàng)目（2015AB001491，2016AB002981）

譚燕萍（1980-），女，副主任中藥師，主要從事中藥藥理與臨床中藥學(xué)研究。

張繼平，E-mail：fszjping@163.com。

馮天保，鄭鋒玲）