趙天福 杜文華 辛 佳 付巧娟 趙 兵 朱 勇

(1.西南大學(xué)紡織服裝學(xué)院， 重慶 400716；2.重慶市生物質(zhì)纖維材料與現(xiàn)代紡織工程技術(shù)研究中心， 重慶 400716；3.西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院， 重慶 400716)

基于PCR的轉(zhuǎn)基因家蠶快速識別方法

趙天福1，2杜文華3辛 佳3付巧娟3趙 兵1，2朱 勇3

(1.西南大學(xué)紡織服裝學(xué)院， 重慶 400716；2.重慶市生物質(zhì)纖維材料與現(xiàn)代紡織工程技術(shù)研究中心， 重慶 400716；3.西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院， 重慶 400716)

在轉(zhuǎn)基因家蠶的制作方法中，基于piggyBac轉(zhuǎn)座子的顯微注射法是當(dāng)前最常用和最有效的方法。通過piggyBac轉(zhuǎn)座子方法獲得的家蠶，由于其以隨機(jī)方式切出和轉(zhuǎn)座的特征，所獲得家蠶的轉(zhuǎn)入位置往往帶有隨機(jī)性，不可人為預(yù)測和控制。利用轉(zhuǎn)基因插入位置的隨機(jī)性，配合轉(zhuǎn)入的目的基因序列識別，建立了家蠶指紋識別方法。該方法快捷方便，可用于轉(zhuǎn)基因家蠶品種繁育過程中的品系識別和轉(zhuǎn)基因家蠶知識產(chǎn)權(quán)的舉證手段。

轉(zhuǎn)基因；家蠶； PCR；識別

在轉(zhuǎn)基因家蠶的制作方法中，基于piggyBac轉(zhuǎn)座子的顯微注射法是當(dāng)前最常用和最有效的方法[1]。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的成熟，利用該技術(shù)制作的各種轉(zhuǎn)基因蠶品種日益豐富，利用這些轉(zhuǎn)基因蠶生產(chǎn)具有特殊性能的創(chuàng)新蠶絲、或具有各種功能的有用蛋白質(zhì)成為蠶業(yè)科學(xué)研究的新熱點(diǎn)。通過piggyBac轉(zhuǎn)座子方法獲得的家蠶，由于piggyBac轉(zhuǎn)座子以隨機(jī)方式轉(zhuǎn)座的特征，所獲得家蠶的轉(zhuǎn)入位置往往不可人為預(yù)測和控制，也帶有隨機(jī)性[2]?；趐iggyBac轉(zhuǎn)座子改良絲蛋白基因生產(chǎn)特殊蠶絲或有用蛋白的轉(zhuǎn)基因家蠶，外觀和習(xí)性與未轉(zhuǎn)基因的蠶幾乎無異，在繁育過程中難以區(qū)分，一旦混雜，難以判別。盡管有熒光標(biāo)記等標(biāo)志基因可以識別，但標(biāo)記基因種類有限，無法在不同的轉(zhuǎn)基因蠶中都使用不同的標(biāo)志基因。

本研究利用piggyBac轉(zhuǎn)座子的隨機(jī)轉(zhuǎn)座特征，將轉(zhuǎn)入位置的核酸序列信息和轉(zhuǎn)入基因的序列信息作為該轉(zhuǎn)基因品系蠶的指紋特征，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和測序技術(shù)相結(jié)合，建立一種快速高效的轉(zhuǎn)基因蠶指紋識別方法。本方法可用于轉(zhuǎn)基因蠶繁育中的不明品系鑒定，也可用于轉(zhuǎn)基因家蠶育種材料的知識產(chǎn)權(quán)舉證。

1 材料和方法

1.1 材料

供試蠶品種為西南大學(xué)保存的轉(zhuǎn)蜘蛛絲蛋白基因家蠶品系SSMS1218。該材料遺傳背景清楚，已經(jīng)3年以上繼代，遺傳穩(wěn)定[3]。用桑葉飼養(yǎng)，上蔟羽化后取蠶蛾用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的抽提

蠶蛾基因組的抽提參照Sambrook[4]的方法進(jìn)行。蠶蛾用DNA抽提緩沖液磨碎后，離心取上清液。用堿性酚及氯仿抽提后，用乙醇沉淀回收DNA。再經(jīng)無DNA酶的RNA酶處理，以去除混入的少量RNA。

1.2.2 基因組的酶切及自身環(huán)化

用限制性內(nèi)切酶HaeIII處理基因組DNA。步驟按照試劑說明書進(jìn)行。每樣品處理約40μg DNA。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測處理效果，處理至整個泳道呈較均勻拖帶，沒有大分子量核酸為止。經(jīng)乙醇沉淀處理后用適量滅菌純水溶解DNA。用Takara Ligation kit于16℃連接過夜，使酶切后的DNA片段自身環(huán)化。經(jīng)乙醇沉淀，回收環(huán)化DNA。

1.2.3 PCR反應(yīng)

分別以上述1.2.1得到的純化DNA或1.2.2得到的環(huán)化DNA為模板，進(jìn)行轉(zhuǎn)入基因序列PCR或末端反向PCR。所用引物序列及反應(yīng)條件如表1。引物位置及目標(biāo)序列位置示意如圖1。

表1 PCR反應(yīng)引物及反應(yīng)條件

圖1 PCR反應(yīng)引物及擴(kuò)增目的片段位置示意圖

1.2.4 克隆和測序

PCR產(chǎn)物條帶單一清晰的可用原引物直接測序。部分測序困難的樣品，克隆到T載體后，用載體通用引物測序。測序利用Takara公司的測序服務(wù)。piggyBac兩臂側(cè)翼序列測出后需要經(jīng)過適當(dāng)處理加以拼接，具體方法是：利用blast軟件找出已知的piggyBac末端序列和特異識別的TTAA序列，與TTAA相鄰的即為側(cè)翼序列。由于側(cè)翼序列中的HaeIII位點(diǎn)遠(yuǎn)近不一，通常只標(biāo)識其中最近的10-20個堿基做為標(biāo)志，更長序列可能通過家蠶基因組數(shù)據(jù)庫間接獲得。中央部分的插入基因測序結(jié)果直接去除引物序列即為目標(biāo)序列。

1：轉(zhuǎn)基因家蠶；2：對照(非轉(zhuǎn)基因家蠶)；M：分子量標(biāo)記 圖2 基因組DNA的電泳

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA的抽提質(zhì)量

本文采用通用的方法抽提了轉(zhuǎn)基因家蠶和非轉(zhuǎn)基因家蠶的基因組DNA，電泳圖上并無差異(圖2)，可見一般的核酸抽提方法可以用于轉(zhuǎn)基因家蠶蛾基因組的抽提。

2.2 測序結(jié)果

2.2.1piggyBac左臂和右臂側(cè)翼序列

經(jīng)重復(fù)3次以上測序確定piggyBac左臂側(cè)翼的家蠶基因組序列，最近的15個堿基從5′到3′的順序?yàn)椋?5′-AGCTAGCTCTCTTGGTTAA-3′。其中TTAA為已在其他文獻(xiàn)中報(bào)告過的piggyBac轉(zhuǎn)座子特異識別序列，TTAA的下游方向進(jìn)入插入的轉(zhuǎn)座子序列。用同樣的方法確定piggyBac右臂側(cè)翼的家蠶基因組序列的最近15個堿基，從5′到3′的順序?yàn)椋?′-TTAATATACGATCGGAGTA-3′。 TTAA的上游方向?yàn)椴迦氲霓D(zhuǎn)座子序列。

綜合測得序列的信息，通過與家蠶基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，定位插入位點(diǎn)位于家蠶第11號染色體。

2.2.2 中央部分插入的轉(zhuǎn)入目標(biāo)基因序列

以純化未酶切的轉(zhuǎn)基因蠶蛾基因組為模板擴(kuò)增的片段，測序后去除載體及引物序列，即為目標(biāo)核心序列，全長747bp，其中的5′部分為GCCGGACAAGGATTA，3′部分為ATCGGCCAAGTTAAT，均為從5′到3′的順序。所有序列測序波形清楚無誤。

3 討論

利用家蠶作為生物反應(yīng)器開展有用物質(zhì)合成和生產(chǎn)的研究是當(dāng)前蠶業(yè)科學(xué)研究的熱門領(lǐng)域之一。上世紀(jì)末到本世紀(jì)初，piggyBac轉(zhuǎn)座子為載體的顯微注射轉(zhuǎn)基因蠶制作技術(shù)日漸成熟。到今天利用該技術(shù)制作轉(zhuǎn)基因家蠶，以生產(chǎn)具有特殊性能的新型蠶絲，或者生產(chǎn)有用蛋白物質(zhì)的研究方興未艾。由于piggyBac轉(zhuǎn)座子近乎隨機(jī)插入的特點(diǎn)，插入位置隨機(jī)，不可人為預(yù)測和控制，目前為止的研究報(bào)告中尚未發(fā)現(xiàn)有將外源基因插入到家蠶基因組中同一位置的報(bào)告。

隨機(jī)插入的特性也帶來了插入位置的難以再現(xiàn)性。本研究將這個“難以再現(xiàn)”的位置特征作為轉(zhuǎn)基因家蠶的指紋特征加以利用，建立了一種利用PCR技術(shù)快速識別特定轉(zhuǎn)基因家蠶品系的方法。本方法從磨蛾抽提DNA開始，到測序結(jié)果完成最快在1 d之內(nèi)可以完成，時間快捷?？梢岳靡旬a(chǎn)卵雌蠶蛾或已交雄蛾為材料，可與制種過程同步進(jìn)行，具有較好的實(shí)用性。實(shí)驗(yàn)中采用了反向PCR的識別插入片段側(cè)翼序列，可用于探究未知的插入位置。在對插入位置已經(jīng)清楚的轉(zhuǎn)基因家蠶末端序列進(jìn)行識別時，可以參考家蠶基因組數(shù)據(jù)庫或先期的測試數(shù)據(jù)，進(jìn)行普通的PCR，可進(jìn)一步縮短實(shí)驗(yàn)時間。進(jìn)一步的研究還可以考慮引物及酶的預(yù)混，PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，模板的微量化等，進(jìn)一步提高識別工作效率。

[1] TAMURA T， THIBERT C，ROYER C， et al. Germline transfo rmation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector[J]. Nat Biotechnol. 2000, 18(1):81-4.

[2] 徐漢福,幸俊逸,王職峰,等. 外源piggyBac轉(zhuǎn)座元件在轉(zhuǎn)基因家蠶中的整合位點(diǎn)分析[J]. 蠶學(xué)通訊,2010,30(01):1-7.

[3] 杜文華. 棒絡(luò)新婦蜘蛛拖牽絲蛋白基因編碼序列的克隆及重組表達(dá)[D].西南大學(xué),2012.

[4] SAMBROOK J， FRISCH E F， MANIATIS T. (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY.

重慶市蠶桑產(chǎn)業(yè)發(fā)展補(bǔ)助資金項(xiàng)目“轉(zhuǎn)蜘蛛絲蛋白基因家蠶的快速指紋識別研究項(xiàng)目”。

趙天福(1968-)，副教授，從事纖維材料與工程、蠶絲生物學(xué)研究。

朱勇，教授。E-mail：zhuy@swu.edu.cn