張 瑩，張 玲，劉 泓，施 翔，王樹鳳*

(1.福建農(nóng)林大學資源與環(huán)境學院，福建 福州 350002; 2.中國林業(yè)科學研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 杭州 311400)

柳樹6個無性系在銅尾礦砂中的生長及耐受性差異

張 瑩1,2，張 玲2，劉 泓1，施 翔2，王樹鳳2*

(1.福建農(nóng)林大學資源與環(huán)境學院，福建 福州 350002; 2.中國林業(yè)科學研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 杭州 311400)

目的研究Cd、Zn、Cu 3種重金屬復合污染條件下6個柳樹無性系的生長、光合作用以及葉綠素含量變化等生理生化響應，為評價不同柳樹品種在重金屬污染區(qū)植被恢復中的應用潛力提供依據(jù)。方法采用盆栽試驗方法，以旱柳和杞柳6個無性系扦插苗為試驗材料，按無性系與介質(zhì)兩因素裂區(qū)設計試驗，對6個無性系的生長、根系形態(tài)學參數(shù)以及光合參數(shù)和葉綠素、類胡蘿卜素含量等指標進行測定。結果表明：6個無性系在銅尾礦砂中均能生長，但株高、地徑以及光合作用、葉綠素含量等相關參數(shù)均受到不同程度的抑制，其中，杞柳‘一枝筆’在銅尾礦砂中的株高、生物量以及總?cè)~綠素含量在6個無性系中降幅最小，而凈光合速率降幅最小的是旱柳16無性系。在尾礦砂中生長的柳樹葉片均出現(xiàn)不同程度的黃化，色素含量出現(xiàn)不同程度的下降，杞柳‘一枝筆’無論是葉綠素a、葉綠素b還是總?cè)~綠素含量下降幅度最小，其總?cè)~綠素含量與對照相比僅下降4%。各項指標主成份分析結果表明：在重金屬復合污染條件下，生長性狀因子起的作用最大，其中，根體積、莖干質(zhì)量、葉干質(zhì)量、總生物量4個性狀是決定銅尾礦砂中柳樹生長狀況的關鍵因子。結論6個柳樹無性系在銅尾礦砂中的生長和生物量積累具有明顯的基因型差異。根據(jù)對生物量、耐性指數(shù)以及光合作用等生理生化相關指標的綜合分析，杞柳無性系中杞柳‘一枝筆’耐性優(yōu)于杞柳‘大紅頭’，而旱柳無性系中旱柳470耐性最好，旱柳16耐性最差。杞柳在銅尾礦砂中的耐性高于旱柳，光合色素的合成受影響較小，而且也具有較好的生物量積累能力。杞柳可望用于礦山廢棄地的植被恢復。

柳樹；銅尾礦砂；根系形態(tài)；光合作用；主成分分析

金屬礦山在開采、選礦過程中會產(chǎn)生大量的廢棄尾礦砂，金屬尾礦由于含有大量高濃度重金屬，給周邊環(huán)境和人類帶來污染和危害[1]。重金屬在人體較低攝入的情況下，即可對人體產(chǎn)生明顯的毒副作用，如鎘能蓄積在肝、腎組織中，引起腎臟吸收功能不全；同時重金屬極易通過食物鏈在生物體內(nèi)積累，并難以通過生物降解而消除，從而對人體健康產(chǎn)生極大危害[2]。尾礦不僅危害人體健康、污染周圍環(huán)境，而且破壞生態(tài)系統(tǒng)，如何在退化的尾礦生態(tài)系統(tǒng)中進行植被恢復與植物修復已成為目前環(huán)境生態(tài)學的研究熱點[3]。利用耐性或富集植物對廢棄尾礦進行植物修復是當前國際上常用的措施，在美國、英國和澳大利亞等國家，一些對重金屬有高耐受性植物的培育已經(jīng)商業(yè)化[4]。

應用柳樹(Salixspp.)對重金屬污染土壤進行修復的研究與實踐在國外已有較多報道[5-9]。近10年來，國內(nèi)在柳樹對重金屬的吸收和積累方面的研究也越來越多，但大多數(shù)研究是基于室內(nèi)水培試驗的結果[10-11]。目前有關旱柳(S.matsudanaKoidz.)、杞柳(S.integraThunb.)以及金絲柳(Salix×aureo-pendulaCL.)等不同柳樹品種、無性系在水培條件下對Cd、Zn、Pb等重金屬的吸收和積累規(guī)律的研究已有很多報道[12-15]，然而，應用柳樹進行金屬尾礦的修復研究還很少。施翔等[16]采用Cu/Zn復合污染的礦砂栽培旱柳等7個柳樹無性系，發(fā)現(xiàn)柳樹葉片對Zn具有較高的轉(zhuǎn)移能力；廖啟林等[17]研究了栽種柳樹修復鎘污染土壤的狀況，表明栽種蘇柳795、蘇柳172對原位修復我國南方農(nóng)田土壤的鎘污染具有廣闊的應用前景。

金屬尾礦不僅重金屬含量高，而且具有肥力低、缺乏土壤微生物等多種限制植物生長的因素，因此，了解植物材料在尾礦中的生長和耐性對評價其在金屬尾礦植被恢復中的潛力具有重要意義。全世界柳樹約有526種，產(chǎn)于我國的有257種[18]，因此，研究柳樹不同基因型在金屬尾礦的生長響應對開發(fā)和利用我國豐富的柳樹資源具有重要意義。本研究在前期試驗基礎上，以旱柳和杞柳無性系為材料，研究了不同柳樹無性系在Cd、Zn、Cu 3種重金屬復合污染條件下的生長、耐性以及光合作用、葉綠素含量等生理生化響應，為柳樹在金屬尾礦廢棄地的植被恢復提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

參試材料分別為旱柳739、470、30和16號，共4個無性系，杞柳‘一枝筆’(S.integra‘Yizhibi’)和‘大紅頭’(S.integra‘Dahongtou’)2個栽培品種，柳樹插條均采自浙江省杭州市富陽區(qū)新登柳樹種質(zhì)資源收集圃。

表1 供試土樣的物理化學性質(zhì)

1.2 試驗設計

6月中旬將生根苗移植到塑料盆中，10月中旬收獲苗木，試驗周期總共120 d。試驗期間7—9月，每月進行1次光合作用參數(shù)測定。植物收獲后測定其葉綠素含量、株高、地徑、生物量以及根系形態(tài)學參數(shù)。

1.3 測定方法

1.3.1 生物量測定 植株收獲以后，將植株分根、莖、葉3部分，105℃殺青，75℃烘干至恒質(zhì)量后稱其干質(zhì)量。

1.3.2 根系形態(tài)學參數(shù)測定 植物根系去離子水洗凈后，用雙光源掃描儀掃描。采用WinRHIZO PRO 2007根系分析系統(tǒng)軟件(Regent Instruments Inc.，Canada)分析根長、根表面積、根體積以及不同徑級根長和表面積等形態(tài)學參數(shù)。

1.3.3 光合作用測定 于7—9月，選擇晴朗的天氣，上午8:00—11:00時，選擇3株苗中部的3片功能葉片測定其光合作用。采用Li-6400便攜式光合作用系統(tǒng)(Li-COR，USA)，主要測定葉片凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)、蒸騰速率(Tr)等指標。

1.3.4 葉綠素含量測定 取處理和對照植株的成熟功能葉片測定葉綠素含量，共4次重復。葉綠素含量測定采用80%丙酮提取法[19]。

1.3.5 耐性指數(shù)(TI)及各參數(shù)抑制率(降幅)計算

耐性指數(shù)[20]=尾礦砂中生物量/對照組生物量×100%

抑制率(降幅)=(對照-處理)/對照×100%

1.4 統(tǒng)計分析

用Microsoft Excel 2003軟件進行簡單的數(shù)據(jù)處理，采用DPS7.05軟件進行方差分析，用Origin7.5軟件進行繪圖。采用LSD法對6個柳樹無性系在2種土壤介質(zhì)中的生理反應數(shù)據(jù)進行差異性比較。主成分分析用SPSS 22.0分析軟件完成。

2 結果與分析

2.1 銅尾礦砂對6個柳樹無性系生長和根系發(fā)育的影響

圖中字母代表同一處理下的差異顯著性水平，不同字母表示兩無性系之間差異顯著(P<0.05)。下同。 The letters in the figure represent the level of significance, and the different letters indicate significant differences between the two clones (P<0.05). The same below.圖1 2種處理下6個柳樹無性系的生長指標Fig.1 Growth index of six willow clones under two treatments

圖2 2種處理下6個柳樹無性系的生物量Fig.2 Biomass of six willow clones under two treatments

圖3 6個柳樹無性系在尾礦砂處理下的耐性指數(shù)
Fig.3 Tolerance index of six willow clones under mine tailings

進一步對不同無性系的根系形態(tài)學參數(shù)進行分析，結果(表2)發(fā)現(xiàn)：盡管根部生物量受到重金屬污染的影響較小，但與對照相比，各無性系的根長、根表面積、根體積、根尖數(shù)在銅尾礦砂中出現(xiàn)下降趨勢，說明供試柳樹無性系在重金屬污染條件下根系的生長發(fā)育受到抑制，且抑制程度在不同無性系之間的差異顯著(P<0.05)。從各無性系根系形態(tài)學參數(shù)的下降幅度看，旱柳16無性系的根長、根表面積、根體積和根尖數(shù)降幅最大，其中，根體積與對照相比下降了96%，而旱柳470無性系根系各項參數(shù)的下降幅度較小。根系總長度、根系表面積、體積等形態(tài)學參數(shù)是決定根系養(yǎng)分吸收范圍、吸收強度的重要指標[21]，因此，重金屬污染條件下柳樹無性系總根長、根體積以及根表面積等參數(shù)的下降導致根系對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收范圍縮小，吸收強度下降，推測這也是導致其生物量下降的原因之一。

2.2 銅尾礦砂對柳樹葉片光合參數(shù)的影響

植物光合作用是植物生長和生存最基礎的過程，也是受環(huán)境影響最敏感的過程[22-23]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照相比，銅尾礦砂介質(zhì)中生長的柳樹葉片凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)以及蒸騰速率(Tr)均呈下降趨勢(圖4)，而大部分無性系胞間CO2濃度(Ci)則升高(圖4)，且同種介質(zhì)下各無性系光合參數(shù)差異顯著(P<0.05)，說明高重金屬含量、低肥力的銅尾礦砂土壤不利于柳樹的生長，導致葉片氣孔導度下降，從而使葉片胞間CO2蓄積，無法進入細胞內(nèi)，進而抑制了柳樹的光合作用。供試6個無性系在銅尾礦砂中凈光合速率(Pn)分別下降了59%(旱柳739)、73%(旱柳470)、75%(旱柳30)、49%(旱柳16)、52%(杞柳‘大紅頭’)、57%(杞柳‘一枝筆’)(圖4)，其中，旱柳16和杞柳‘大紅頭’凈光合速率(Pn)下降較少；然而，旱柳16在銅尾礦砂中的生物量并不理想(圖2)，由此推測，盡管凈光合速率(Pn)在很大程度上決定了植物干物質(zhì)的積累[24]，但在重金屬污染環(huán)境中，生物量的積累可能還受到重金屬的毒害作用及不同植物基因型的差異等因素影響。

表2 2種處理下6個柳樹無性系根系形態(tài)參數(shù)

注：表中同一列同一處理不同字母表示各無性系根系形態(tài)參數(shù)差異顯著(P<0.05)。

Note: the same column in the same treatment of different letters that the clonal root morphological parameters of significant differences(P<0.05).

圖4 2種處理下6個柳樹無性系的光合參數(shù)Fig.4 Photosynthetic parameters of six willow clones under two treatment

2.3 銅尾礦砂對柳樹葉片光合色素的影響

2.4 銅尾礦砂中柳樹無性系生長性狀的主成分分析

銅尾礦砂介質(zhì)下柳樹無性系不同指標主成分分析(表3)表明：在所有的主成分構成中，信息主要集中在前3個主成分，其累積貢獻率為83.778%，其中第1主成分貢獻率為44.372%，第2主成分、第3主成分的貢獻率分別為21.974%和17.432%。根據(jù)特征根的生物學信息，第1主成分主要是生長性狀因子，在第1主成分的特征向量中，特征向量值較高且為正的性狀有根體積、莖干質(zhì)量、葉干質(zhì)量、總生物量4個因子，說明這4個因子是決定銅尾礦砂中柳樹生長狀況的關鍵因子，因此，在進行植被恢復過程中，應選擇根系龐大、地上部生長良好的無性系。第2主成分主要是光合色素含量狀況，其中，特征向量值較高且為正的性狀有葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素。第3主成分是光合作用性狀因子，其特征向量值較高且為正的性狀有胞間CO2濃度。以上3個主成分分析可以看出：第2主成分和第3主成分的貢獻率相似，而且都低于第1主成分的貢獻率，表明柳樹生長性狀因子在各因素中起的作用最大，而其它如光合色素含量和光合作用等因子對銅尾礦砂中生長的柳樹影響較小。

圖5 2種處理下6個柳樹無性系的光合色素含量Fig.5 Photosynthetic pigment contents of six willow clones under two treatments

對銅尾礦砂介質(zhì)下的不同指標進行歸一化處理并計算得分，6個柳樹無性系，得分大小依次為：杞柳‘大紅頭’(4993)>杞柳‘一枝筆’(4169)>旱柳470(2706)>旱柳16(2441)>旱柳30(2325)>旱柳739(1266)。

3 討論

當土壤重金屬濃度達到影響植物生長的臨界值時，植物生長就會受到影響，最明顯的癥狀是苗高和葉色的變化，最終反映在植物地上部生物量的顯著降低[25]。Macfarlane等[26]研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的Zn(500 μg·g-1)、Pb(400 μg·g-1)培養(yǎng)時，植株的死亡率增加，生物量降低。劉治昆等[27]研究表明，‘蘇柳172’(S.jiangsuensisCL J-172)和垂柳(S.babylonicaLinn)受Cu2+脅迫時生物量隨濃度升高而減小。本研究也發(fā)現(xiàn)，供試6個柳樹無性系在銅尾礦砂中生長4個月后，苗高均受到不同程度的抑制，葉色出現(xiàn)深淺不一的黃色，根部、地上部生物量均出現(xiàn)明顯的下降，這與大多數(shù)研究結果一致[6，8]。Yang等[28]研究發(fā)現(xiàn)，相同濃度的Cu處理下，不同基因型柳樹生長表現(xiàn)不同，有些基因型的生長受到促進作用，而有些受到抑制作用，說明柳樹對重金屬污染響應的基因型差異是普遍存在的。本研究發(fā)現(xiàn)，無論是對照組還是處理組，在相同的培養(yǎng)條件下，供試6個柳樹無性系生物量均存在明顯的基因型差異，其中，旱柳470、旱柳739以及杞柳‘一枝筆’等無性系具有較高的生物量積累。在逆境環(huán)境中，植物的生長狀況最終體現(xiàn)在生物量方面[29]，主成分分析也表明，貢獻率最大的第1主成分中總生物量具有較高的因子載荷，因此，在進行重金屬污染尾礦植被恢復過程中，應選擇具有較高生物量的無性系材料。

表3 銅尾礦砂介質(zhì)下不同指標主成分分析

光合作用是所有綠色植物生長和生命活動的基礎，而逆境條件下光合系統(tǒng)的可塑性對提高植物的生存能力和生長潛力具有重要意義，因此，基于樹木光合速率的選育也是尋找理想的植物修復材料的重要過程[8-9]。本研究發(fā)現(xiàn)，不同柳樹無性系凈光合速率(Pn)存在明顯的基因型差異，其中，旱柳739、旱柳16以及杞柳‘一枝筆’等無性系在各處理均具有較高的凈光合速率(Pn)，各無性系在重金屬污染條件下的凈光合速率(Pn)均出現(xiàn)明顯的下降，說明重金屬污染抑制了柳樹的光合作用。Pajevic′等[8]在研究白柳(S.albaL.)無性系對復合重金屬污染的響應時，也發(fā)現(xiàn)重金屬污染嚴重抑制了白柳的光合作用;然而，也有研究發(fā)現(xiàn)[5]，重金屬污染條件下，蒿柳(S.viminalisL.)在重金屬污染環(huán)境中的凈光合速率并沒有降低，反而增加，從而使其生物量變化不大，這也說明重金屬污染對柳樹光合作用的影響是雙向的，而出現(xiàn)這種雙向調(diào)節(jié)的原因，一方面可能是由于重金屬污染程度不同，另一方面可能是由于不同基因型之間的內(nèi)在遺傳機制造成的[32]。

重金屬污染對植物光合作用的影響主要是由于重金屬影響了植物光合色素的生物合成、電子傳遞以及二氧化碳還原、氣孔開合等過程[9]。本研究也發(fā)現(xiàn)，銅尾礦砂介質(zhì)導致不同柳樹無性系氣孔導度(Gs)下降，而且下降程度存在明顯的基因型差異(P<0.05)，其中，對杞柳‘大紅頭’氣孔導度的影響最小，在銅尾礦砂中生長的植株氣孔導度與對照中生長的植株幾乎相同；同時，對蒸騰速率(Tr)的研究也發(fā)現(xiàn)了類似的規(guī)律。葉綠素含量降低是重金屬對植物毒害的普遍現(xiàn)象，劉春生等[33]研究發(fā)現(xiàn)，過量銅可極顯著地降低蘋果(MaluspumilaMill.)葉片葉綠素含量。本研究也發(fā)現(xiàn)，銅尾礦砂引起了不同基因型柳樹葉綠素的下降，其中，杞柳‘一枝筆’葉綠素含量下降程度最小，另外，旱柳739的葉綠素含量變化也不明顯。由此說明，重金屬污染不僅導致了柳樹葉片氣孔的部分關閉，限制了進入葉肉細胞的二氧化碳，而且影響了柳樹葉綠素的合成，使葉綠素含量下降，由此導致凈光合速率(Pn)不同程度的下降;然而，逆境下氣孔的關閉除了抑制光合作用以外，對減少植株的蒸騰作用也具有重要意義，而這一點，對于減少逆境下植物體內(nèi)的水分流失同樣重要。

4 結論

6個柳樹無性系在銅尾礦砂中的生長和生物量積累具有明顯的基因型差異，根據(jù)對生物量、耐性指數(shù)以及光合作用等生理生化相關指標的綜合分析，杞柳‘一支筆’和‘大紅頭’在銅尾礦砂中的耐性高于旱柳無性系，光合色素的合成受影響較小，而且也具有較好的生物量積累能力，在銅尾礦的植被恢復過程中是值得推薦的品種；但由于本研究未考慮不同無性系對銅尾礦重金屬的積累能力，因此，杞柳無性系對銅尾礦砂中重金屬的提取能力有待于進一步的研究。

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VariationsinGrowthandToleranceofSixWillowClonesinCopperTailingsSoils

ZHANGYing1,2,ZHANGLing2,LIUHong1,SHIXiang2,WANGShu-feng2

(1.College of Resources and Environment, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, Fujian, China;2.Research Institute of Subtropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Hangzhou 311400, Zhejiang, China)

ObjectiveIn this study, the growth, photosynthesis and chlorophyll contents of 6 willow clones under Cd, Zn, Cu and other heavy metal pollution conditions were studied. The results provide a basis for evaluating the potential application of different willow species in vegetation restoration in heavy metal polluted area.MethodPotting experiment was adopted, and six willow clones were used as experimental materials. Split-plot experiment design was adopted according to clonal and media factors, and the growth, root morphological parameters, photosynthesis, chlorophyll and carotenoid contents of the 6 clones were determined.ResultThe results showed that all the 6 clones could grow in copper tailings, but the parameters such as plant height, ground diameter, photosynthesis and chlorophyll content were inhibited to different extents. The plant height, biomass and total chlorophyll content ofSalixintegra(‘Yizhibi’) were the lowest among the 6 clones, while the least of the net photosynthetic rate wasS.matsudana(16). The leaves of the willows grown in the tailings all showed different degree of yellowing, and the content of pigment decreased in different degrees. Chlorophyll a, chlorophyll b and total chlorophyll content ofS.integra(‘Yizhibi’) decreased the least, the total chlorophyll content decreased only by 4% compared with the control. Principal component analysis showed that the growth traits played the most important role in the condition of heavy metal compound pollution, among which root volume, stem dry weight, leaf dry weight and total biomass were the key factors determining the growth status of willow in the tailings.ConclusionThe growth and biomass accumulation of the 6 willow clones in copper tailings have obvious genotypic differences. Based on the comprehensive analysis of physiological and biochemical indexes such as biomass, tolerance index and photosynthesis, the tolerance ofS.integra‘Yizhibi’ slightly better than that of theS.integra‘Dahongtou’. The tolerance ofS.matsudana(470) was the best, whileS.matsudana(16) the worst. The tolerance ofS.integra‘Yizhibi’ and ‘Dahongtou’ in copper tailings soil was higher than that ofS.matsudana. The synthesis of photosynthetic pigments was less affected, and the biomass accumulation ability was also better. SoS.integraare more likely to be used the recovery vegetation of mine abandoned land.

willow; copper tailing soil; root morphology; photosynthetic; principal component analysis

10.13275/j.cnki.lykxyj.2017.06.008

2017-02-13

浙江省科技廳公益技術研究社會發(fā)展項目(2016C33043)；國家自然科學基金青年科學基金項目(31400526)；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項資金(CAFYBB2014QB035)；浙江省農(nóng)業(yè)(林木)新品種選育重大科技專項(2016C02056-11)

張 瑩(1990—)，女，山東壽光人，碩士研究生，主要從事農(nóng)業(yè)環(huán)境保護研究.

* 通訊作者：王樹鳳，副研究員，主要從事林木抗逆育種研究.E-mail:wangshufeng6609@163.com

S792.12

A

1001-1498(2017)06-0936-10

金立新)