劉發(fā)生，王榮春，郭敬蘭，陳艷莉, ，夏青，孔浩天，馮潤良，韓利文*，張愛平，劉可春

(1. 山東省科學院生物研究所，山東省科學院藥物篩選技術(shù)重點實驗室，山東 濟南 250014；2. 山西醫(yī)科大學藥學院，山西 太原 030001；3. 濟南大學，山東 濟南 250014)

【藥理與毒理】

利用斑馬魚模型研究蘆筍有效成分對免疫功能的調(diào)節(jié)作用

劉發(fā)生1, 2，王榮春1，郭敬蘭1，陳艷莉1, 3，夏青1，孔浩天1，馮潤良3，韓利文1*，張愛平2*，劉可春1

(1. 山東省科學院生物研究所，山東省科學院藥物篩選技術(shù)重點實驗室，山東 濟南 250014；2. 山西醫(yī)科大學藥學院，山西 太原 030001；3. 濟南大學，山東 濟南 250014)

采用正常發(fā)育48 hpf的轉(zhuǎn)基因斑馬魚為實驗動物，以氯霉素處理引起免疫抑制，分別加入25.0～200.0 mg/L的蘆筍多糖、6.25～100.00 mg/L的蘆筍皂苷，處理24 h，觀察各組斑馬魚的發(fā)育情況，拍照并統(tǒng)計斑馬魚體內(nèi)中性粒細胞的數(shù)量。結(jié)果表明,氯霉素處理斑馬魚后，斑馬魚體內(nèi)中性粒細胞數(shù)量減少，蘆筍多糖在濃度為50.0～200.0 mg/L范圍內(nèi)對斑馬魚體內(nèi)中性粒細胞數(shù)量減少具有明顯改善作用，且具有明顯的劑量依賴效應(yīng)；蘆筍皂苷在實驗劑量范圍內(nèi)均顯示出顯著的改善作用。實驗結(jié)果顯示，蘆筍的有效成分蘆筍多糖、蘆筍皂苷對斑馬魚免疫功能具有明顯的調(diào)節(jié)作用。

蘆筍；蘆筍多糖；蘆筍皂苷；免疫調(diào)節(jié)；斑馬魚

蘆筍(Asparagusofficinalis.L)，學名石刁柏，為百合科天門冬屬多年生草本植物，是一種傳統(tǒng)的藥用植物，研究發(fā)現(xiàn)蘆筍提取物具有抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、抗疲勞、抗真菌、降血脂及免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性[1]。目前蘆筍廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、保健等諸多領(lǐng)域，其市場需求也在不斷增加。已有研究表明，蘆筍提取物具有抗癌、降血脂、增強免疫功能、抗衰老等藥理作用。蘆筍蛋白質(zhì)組成具有人體所必需的各種氨基酸，含量比例也較恰當，微量元素中有較多的硒、鉬、鎂、錳，以及其它多種如多糖、皂苷、天門冬酰胺、蕓香苷、葉酸等藥用成分[2]。蘆筍最早被人關(guān)注的是口服蘆筍原汁具有一定的抗癌作用[3]，進一步推測可能是其中的多糖類成分，從此多糖成為研究最多的一類活性成分。

國內(nèi)外學者對蘆筍活性成分的提取、分離及純化工藝研究[4]-[6]，蘆筍的生物活性作用及物質(zhì)基礎(chǔ)研究等[7]-[11]等方面進行了大量的研究與探討。研究表明蘆筍中的多糖、皂苷是主要活性成分。謝燕霞[12]以小鼠巨噬細胞系RAW 264.7為模型，研究了蘆筍多糖對巨噬細胞的影響，結(jié)果表明不同組分的蘆筍多糖均可激活巨噬細胞iNOS表達，刺激巨噬細胞釋放NO，促進巨噬細胞的增殖，同時巨噬細胞TNF-α、IL-6 mRNA表達水平較空白對照有增強趨勢，從細胞水平上證明了蘆筍多糖對巨噬細胞免疫調(diào)節(jié)具有促進作用。

皂苷及皂苷元也是一類具有廣泛藥理活性的天然產(chǎn)物，研究表明，一些皂苷能顯著抑制多種腫瘤細胞(如骨肉瘤、結(jié)腸癌、白血病、肝癌和乳腺癌)的增殖，并誘導它們發(fā)生凋亡。人參皂苷Rh1能顯著增加環(huán)磷酰胺所致免疫功能低下ICR小鼠的胸腺指數(shù)，增強吞噬功能[13]。從革皮氏海參中提取海參皂苷能顯著促進小鼠腹腔巨噬細胞對雞紅細胞的吞噬率和吞噬指數(shù)，促進小鼠的非特異性免疫功能[14]。還有中藥絞股藍[15]、合歡皮[16]、三七[17]中的皂苷成分也具有明顯的免疫調(diào)節(jié)作用。

本文以斑馬魚為實驗動物模型，對蘆筍活性成分蘆筍多糖、蘆筍皂苷的免疫調(diào)節(jié)功能進行研究，為蘆筍藥用功能的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及溶液配制

Tg(lyz: EGFP)中性粒細胞轉(zhuǎn)基因品系斑馬魚，由山東省科學院藥物篩選技術(shù)重點實驗室提供;

蘆筍多糖(中國藥品生物制品檢定所，批號：100292-200201純度為50%)，蘆筍皂苷(上海撫生生物有限公司，批號：100339-200407，純度為30%)。

鏈霉蛋白酶(Solarbio公司，批號:119E0417)，二甲基亞砜DMSO(生工生物工程有限公司，批號：BB02BA0001)，氯霉素(上海超研生物科技有限公司)，PTU(上海中喬新舟生物科技有限公司)，其余試劑為分析純。

IX 51倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，TH4-200顯微熒光器(日本Olympus公司)，DP2-BSW圖像采集系統(tǒng) (日本Olympus公司)，SAX 16體視熒光顯微鏡(日本Olympus公司)，博訊SPX-300B-G型光照培養(yǎng)箱(上?；巧锟萍加邢薰?，XW-80A微型漩渦混合儀(上海精科實業(yè)有限公司)，斑馬魚養(yǎng)殖飼養(yǎng)設(shè)備(北京愛生科技公司)，LE204E電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。

精密稱取蘆筍多糖35.1 mg、蘆筍皂苷37.5 mg，分別用二甲基亞砜(DMSO)配制成200 g/L的母液，備用；精密稱取氯霉素77.2 mg，用DMSO配制成100 g/L的母液，備用。

1.2 實驗方法

挑選受精后48 h (hour post fertilization, hpf) 健康斑馬魚胚胎，脫去卵膜，置于24孔培養(yǎng)板中，每孔10枚，加入氯霉素，同時分別加入蘆筍多糖、蘆筍皂苷，再加入培養(yǎng)液至2 mL，各實驗組均設(shè)置三組平行和氯霉素組，使孔中氯霉素終濃度為150.0 mg/L，蘆筍多糖終濃度為12.5、50.0、200.0 mg/L，蘆筍皂苷終濃度為6.25、25.00、100.00 mg/L，同時設(shè)立DMSO溶劑對照組。加蓋置于28 ℃光照培養(yǎng)箱中孵育至72 hpf，然后利用IX 51倒置顯微鏡觀察并采集每條魚的圖像，利用Image Pro-Plus軟件對斑馬魚泄殖腔至尾部區(qū)域的中性粒細胞計數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 蘆筍多糖對斑馬魚中性粒細胞數(shù)量的影響

本文中所用Tg(lyz：EGFP)斑馬魚為中性粒細胞特異標記綠色熒光的轉(zhuǎn)基因品系。氯霉素會引起免疫抑制，導致斑馬魚軀干部中性粒細胞數(shù)量減少。

蘆筍多糖對斑馬魚中性粒細胞數(shù)量的影響如圖1所示。

A 溶劑對照組；B 氯霉素組；C 12.5 mg/L蘆筍多糖組；D 50.0 mg/L蘆筍多糖組；E 200.0 mg/L蘆筍多糖組圖1 不同濃度蘆筍多糖溶液對72 hpf的斑馬魚免疫抑制模型中性粒細胞的影響(n=30)Fig.1 Effects of asparagus polysaccharide solution with different concentrations on neutrophils in 72 hpf zebrafish immune suppression model(n=30)

氯霉素對斑馬魚中性粒細胞的影響如圖1(B)所示，與圖1(A)對比，熒光點數(shù)明顯減少，代表著氯霉素組中性粒細胞數(shù)目與對照組相比明顯下降，說明免疫抑制模型成功建立。當加入蘆筍多糖后，隨著給藥濃度的增加，熒光點數(shù)也隨之增加，在實驗濃度范圍內(nèi)，濃度越大，中性粒細胞越多，呈現(xiàn)出劑量依賴效應(yīng)，說明蘆筍多糖對免疫損傷具有較強修復作用，見圖1(C-E)。

不同濃度蘆筍多糖對免疫損傷后斑馬魚中性粒細胞數(shù)量如表1所示。

表1 在72 hpf 時不同濃度蘆筍多糖溶液對斑馬魚中性粒細胞數(shù)目的影響

##表示與溶劑對照組相比p<0.01；*表示與氯霉素造模組相比p<0.05，**表示p<0.01。

統(tǒng)計結(jié)果顯示溶劑對照組斑馬魚軀干部中性粒細胞數(shù)目為85±4.51個，氯霉素處理后中性粒細胞數(shù)降至59±4.55個，與對照組相比，數(shù)目有較大幅度下降，具有顯著的統(tǒng)計學差異。加入蘆筍多糖后，斑馬魚中性粒細胞的數(shù)目也隨之增加，當蘆筍多糖給藥濃度為200 mg/L時，中性粒細胞的數(shù)目達到85±4.88個，顯示蘆筍多糖對免疫功能具有一定的調(diào)節(jié)作用，且呈現(xiàn)出良好的劑量依賴效應(yīng)。

2.2 蘆筍皂苷對斑馬魚中性粒細胞數(shù)量的影響

蘆筍皂苷對斑馬魚中性粒細胞數(shù)量的影響如圖2所示。

A溶劑對照組；B氯霉素組；C 6.25 mg/L蘆筍皂苷組；D 25.00 mg/L蘆筍皂苷組；E 100.00 mg/L蘆筍皂苷組圖2 不同濃度蘆筍皂苷溶液對72 hpf的斑馬魚免疫抑制模型中性粒細胞的影響(n=30)Fig.2 Effects of asparagus saponins solution with different concentrations on neutrophils in 72 hpf zebrafish immune suppression model (n=30)

氯霉素對斑馬魚中性粒細胞的影響如圖2(B)所示，與圖2(A)對比，熒光點數(shù)明顯減少，代表著氯霉素組中性粒細胞數(shù)目與對照組相比明顯下降，說明免疫抑制模型成功建立；而從圖2(C-E)可見，隨著蘆筍皂苷的加入，熒光點的數(shù)量增加，說明蘆筍皂苷對免疫損傷具有一定的修復作用。

不同濃度蘆筍皂苷對免疫損傷后斑馬魚中性粒細胞數(shù)量如表2所示。

表2 在72 hpf 時不同濃度蘆筍皂苷溶液對斑馬魚中性粒細胞數(shù)目的影響

##表示與溶劑對照組相比p<0.01;*表示與氯霉素造模組相比p<0.05，**表示p<0.01。

統(tǒng)計結(jié)果顯示溶劑對照組中中性粒細胞數(shù)目為85±4.51個，氯霉素處理后中性粒細胞數(shù)降至60±4.54個，與對照組相比，數(shù)目有較大幅度下降，具有顯著的統(tǒng)計學差異。蘆筍皂苷在6.25～100.00 mg/L的實驗劑量范圍內(nèi)，發(fā)現(xiàn)具有較好的免疫功能調(diào)節(jié)作用。

3 討論

斑馬魚具有胚胎透明，發(fā)育快速等特點，可直接通過熒光倒置顯微鏡觀察熒光蛋白(EGFP)標記后的斑馬魚器官發(fā)育或細胞發(fā)生，目前已構(gòu)建了多種熒光蛋白標記的中性粒細胞和巨噬細胞轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系，可用于觀察斑馬魚固有免疫的發(fā)育及免疫應(yīng)答的啟動和發(fā)生，實時考察藥物對斑馬魚免疫功能的調(diào)節(jié)作用[18]。

中性粒細胞作為固有免疫系統(tǒng)的主要效應(yīng)細胞，在固有免疫中發(fā)揮吞噬殺傷作用，同時可產(chǎn)生多種細胞因子，對適應(yīng)性免疫起重要的輔助和調(diào)節(jié)作用。因此，中性粒細胞數(shù)量的多少可直接反映免疫應(yīng)答效應(yīng)的強弱，體現(xiàn)藥物對斑馬魚固有免疫功能的調(diào)節(jié)作用。

本實驗結(jié)果顯示，在氯霉素誘導的斑馬魚免疫抑制的條件下，斑馬魚體內(nèi)中性粒細胞數(shù)目顯著降低，在給予蘆筍多糖處理后使斑馬魚體內(nèi)中性粒細胞數(shù)目增加，且具有明顯的量效關(guān)系，顯示對免疫系統(tǒng)的改善作用，季宇彬[19]-[20]等研究表明蘆筍多糖對S180小鼠紅細胞CD35的數(shù)量和活性也具有顯著性增強作用，同時蘆筍多糖具有增強淋巴細胞免疫反應(yīng)的作用，從而說明蘆筍多糖具有顯著的免疫調(diào)節(jié)作用。

在蘆筍早期研究中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了其乙醇提取物具有免疫調(diào)節(jié)功能[21]，但是，并未揭示免疫調(diào)節(jié)作用是否與多糖之外的成分有關(guān)。本實驗發(fā)現(xiàn)蘆筍中皂苷成分也呈現(xiàn)出了一定的對免疫系統(tǒng)的改善作用，在氯霉素誘導斑馬魚免疫抑制使斑馬魚體內(nèi)中性粒細胞數(shù)目顯著降低的條件下，給予蘆筍皂苷處理，觀察到斑馬魚體內(nèi)中性粒細胞數(shù)目增加，呈現(xiàn)出了一定的免疫提升作用，為蘆筍的提高免疫、抗腫瘤作用等功能提供了新的證據(jù)。

本研究以斑馬魚為動物模型，探討了蘆筍多糖、蘆筍皂苷對斑馬魚的免疫調(diào)節(jié)作用，為研究蘆筍的免疫調(diào)節(jié)功能提供了依據(jù)，也為后續(xù)蘆筍多糖、蘆筍皂苷作為人體免疫佐劑的開發(fā)，以及臨床應(yīng)用的推廣等提供了理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。

[1]詹姿女，徐向紅，朱衛(wèi)豐，等. 蘆筍的化學成分及生物活性研究[J]. 江西中醫(yī)藥, 2011, 42(2): 46-49.

[2]張岳平，瞿華香，謝啟鑫，等. 蘆筍及近緣種重要活性因子與主要功能研究進展[J]. 食品工業(yè)科技, 2013, 34(4): 363-367.

[3]王波，王道若，蔣中華，等. 蘆筍的免疫活性作用初探[J]. 免疫學雜志, 1990, 6(1):30-69.

[4]段雅慶. 蘆筍中黃酮和多糖的復合提取及其抗氧化活性研究[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學, 2010.

[5]李姣，王珂，王瑞坡，等. 蘆筍多糖提取純化工藝及其體外抗氧化研究[J]. 食品科學, 2011, 32(8): 65-69.

[6]揭晶，孫桂芝，劉冬琳，等. 響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取蘆筍總皂苷[J]. 食品工業(yè)科技, 2015, 36(6): 309-312.

[7]李娟，王鳳山. 蘆筍多糖的研究進展[J]. 中國生化藥物雜志, 2009, 30(3): 215-217.

[8]宋擎，柴秋彥，張立偉. 蘆筍總皂苷抗腫瘤作用研究[J]. 食品科學, 2010, 31(13): 273-275.

[9]ZHAO Q, XIE B, YAN J, et al. In vitro antioxidant and antitumor activities of polysaccharides extracted from Asparagus officinalis[J]. Carbohyd Polym, 2012, 87(1): 392-396.

[10]王芳，馬淑鳳，李漢臣，等. 蘆筍醇提取物的免疫調(diào)節(jié)作用[J]. 食品與生物技術(shù)學報, 2013, 32(3):324-329.

[11]LEE H A, KOH E K, SUNG J E, et al. Ethyl acetate extract fromAsparaguscochinchinensisexerts anti-inflammatory effects in LPS-stimulated RAW264. 7 macrophage cells by regulating COX-2/iNOS, inflammatory cytokine expression, MAP kinase pathways, the cell cycle and anti-oxidant activity[J]. Mol Med Rep, 2017, 15(4): 1613-1623.

[12]謝燕霞. 蘆筍多糖對巨噬細胞的免疫調(diào)節(jié)研究[D].濟南：山東師范大學, 2008.

[13]張才軍，郭民，柳波，等. 人參皂苷Rh1對免疫功能降低小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用研究[J]. 昆明醫(yī)學院學報, 2009, 30(11): 51-54.

[14]王靜鳳，傅佳，王玉明，等. 革皮氏海參皂苷對小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用[J]. 中國海洋大學學報(自然科學版), 2010, 40(2): 28-32.

[15]王坤. 絞股藍皂苷對大鼠抗氧化及免疫功能的影響[D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學, 2009.

[16]俞琦，蔡琨，田維毅. 合歡皮總皂苷對H22荷瘤小鼠細胞免疫功能的影響[J]. 中國實驗方劑學雜志, 2016, 22(15): 143-148.

[17]江源，劉翠，陳清彬，等. 三七皂苷Rg_1對小鼠免疫功能的影響[J]. 中國現(xiàn)代中藥, 2006, 8(3): 9-11.

[18]王榮春，韓利文，何秋霞，等. 斑馬魚胚胎固有免疫研究進展及應(yīng)用[J]. 中南藥學, 2016, 14(10): 1079-1083.

[19]季宇彬，閔永萃，汲晨鋒. 蘆筍多糖對S180小鼠紅細胞補體受體-1(CR1,CD35)數(shù)量及活性的影響[J]. 中國藥學雜志, 2009, 44(14): 1066-1069.

[20]汲晨鋒，閔永萃，季宇彬. 蘆筍多糖對S180小鼠紅細胞調(diào)控淋巴細胞免疫反應(yīng)能力的影響[J]. 上海中醫(yī)藥大學學報, 2010, 24(2): 68-71.

[21]田穎剛，張盼，黃宇玫，等. 蘆筍下腳料乙醇提取物免疫功能及活性成分研究[J]. 食品科學, 2013, 34(1): 277-280.

Theimmune-regulatoryeffectsofactiveingredientsofasparagususingzebrafishmodel

LIUFa-sheng1, 2,WANGRong-chun1,GUOJing-lan1,CHENYan-li1, 3,XIAQing1,KONGHao-tian1,FENGRun-liang3,HANLi-wen1*,ZHANGAi-ping2*,LIUKe-chun1

(1.BiologyInstitute,ShandongAcademyofSciences,KeyLaboratoryforDrugScreeningTechnologyofShandongAcademyofSciences,ShandongJinan250014China; 2.ShanxiMedicalUniversity,SchoolofPharmaceuticalScience,ShanxiTaiyuan030001,China; 3.UniversityofJinan,ShandongJinan250014,China)

∶In this experiment, 48 hpf (hour post fertilization) healthy transgenic zebrafish Tg(lyz: EGFP) was used as animal model. Firstly, immune suppression of zebrafish embryos was induced by chloramphenicol treatment. Then those zebrafish embryos were treated with 25.0～200.0 mg/L asparagus polysaccharide and 6.25～100.00 mg/L asparagus saponins for 24 h, respectively. Finally, the development of zebrafish in each group was observed under the microscope,and the number of neutrophils in zebrafish was recorded and counted to evaluate their immune-regulatory effects. The results showed that the numbers of neutrophils in 72hpf zebrafish trunk area decreased in chloramphenicol-induced group.Asparagus polysaccharide group(50.0～200.0 mg/L) showed a significant immunological enhancement effect with dose-dependent manner. Asparagus saponins could also significantly improve chloramphenicol-induced immunosuppressive effects within the experimental dose range. In this study, This study showed that the active ingredients of asparagus, such as polysaccharide and asparagus saponin, had obvious regulation effects on the immune function of zebrafish, which provided the scientific basis for further development of asparagus.

∶Asparagus; Asparagus polysaccharide; Asparagus saponins;immune-regulation;zebrafish

10.3976/j.issn.1002-4026.2017.06.005

2017-09-11

山東省重點研發(fā)計劃(2016GSF121009，2016GGC01089)；山東省自然科學基金(ZR2016YL009)；國家海洋公益性行業(yè)科研專項(201505030)

劉發(fā)生 (1993—)，男，碩士研究生，研究方向為藥物分析。E-mail: liufasheng34@163.com

*通信作者，韓利文 (1980—)，男，博士，研究方向為藥物篩選及代謝組學研究。E-mail: hanliwen08@126.com；張愛平 (1965—)，女，博士，研究方向為藥物與生物大分子相互作用研究。E-mail: zhangap1@163.com

R965.1

A

1002-4026(2017)06-0029-06