常 城 韓慧宗 王騰騰 馬海濤 劉 陽王 斐 張明亮 王力勇 姜海濱①

(1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306; 2. 山東省海洋資源與環(huán)境研究院山東省海洋生態(tài)修復(fù)重點實驗室煙臺 264006; 3. 中國科學(xué)院南海海洋研究所 廣州 510301; 4. 煙臺市水產(chǎn)研究所 煙臺 264003)

單環(huán)刺螠, 俗稱“海腸子”, 隸屬于螠蟲動物門(Echiurida)、螠綱(Echiurida)、無管螠目(Xenopneusta)、刺螠科(Urichidae), 主要分布于中國、俄羅斯、日本及朝鮮半島的沿海潮間帶下區(qū)及潮下帶淺水區(qū)域,是無管 螠目在我國沿海分布的唯一種類。單環(huán)刺螠味道鮮美、營養(yǎng)豐富、食藥用價值高(Joet al, 2008; Wanget al, 2010), 而且具改良底質(zhì)能力(Kanget al, 2010),是一種有較大養(yǎng)殖開發(fā)前景的海洋生物。近年來單環(huán)刺螠野生資源已無法滿足市場需求的增加, 商品價格不斷攀升, 其種質(zhì)也呈現(xiàn)出一定程度的退化。因此,單環(huán)刺螠人工繁育技術(shù)研究引起國內(nèi)外學(xué)者的普遍關(guān)注, 親本來源主要是在當(dāng)?shù)匮睾┩坎东@, 這種方式極易導(dǎo)致群體遺傳多樣性降低(Milleret al, 2015),因此積極開展單環(huán)刺螠遺傳多樣性相關(guān)研究和調(diào)查,避免種質(zhì)衰退, 成為當(dāng)前面臨的迫切任務(wù)。

微衛(wèi)星標(biāo)記, 又稱簡單重復(fù)序列(simple sequence repeats, SSR), 因其具有多態(tài)性高、共顯性遺傳、易于檢測且等位條帶易于識別等特點, 被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物的群體遺傳多樣性分析、系譜認(rèn)證、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建及數(shù)量性狀連鎖定位等工作(Fengetal, 2014; Mohantyet al, 2014)。迄今為止, 對于單環(huán)刺螠的研究大多集中于人工養(yǎng)殖與繁育、營養(yǎng)組分分析等方面(王雷等, 2011), 有關(guān)微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)及群體多樣性的研究仍未見報道。本研究利用高通量測序的方法從單環(huán)刺螠基因組中開發(fā)了22對多態(tài)性高的微衛(wèi)星標(biāo)記, 并對采自我國不同海域的5個地理群體進(jìn)行遺傳多樣性分析, 旨在摸索篩選單環(huán)刺螠微衛(wèi)星的方法, 開發(fā)更多的單環(huán)刺螠微衛(wèi)星標(biāo)記, 為單環(huán)刺螠種質(zhì)資源保護(hù)、良種培育及增殖放流提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

單環(huán)刺螠群體分別采自煙臺、秦皇島、濰坊、青島和大連等附近海域(見表1), 每個地點各取30頭?；铙w解剖取其體壁, 立即提取基因組DNA。

表1 5個單環(huán)刺螠地理群體采集地點Tab.1 The sites of sampling for 5 Urechis unicinctus populations

1.2 基因組DNA提取和建庫

采用酚/氯仿抽提方法提取基因組 DNA(孫孝德,2011), 1%瓊脂糖電泳檢測其完整性, NanoDrop2000紫外分光光度計測DNA純度和濃度, 選取一個DNA濃度適合、完整度好和純度高的秦皇島樣本送至北京諾禾致源生物公司進(jìn)行測序并構(gòu)建 RAD文庫; 剩余的DNA模板稀釋至30ng/μL, 4°C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 微衛(wèi)星引物設(shè)計和篩選

在 RAD文庫中, 選取微衛(wèi)星核心序列大小在24bp以上的合適序列用Primer 5.0軟件設(shè)計引物。引物長度控制在 20—25bp之間, 產(chǎn)物長度控制在90—300bp之間, Tm值控制在40—60°C, 正反引物相差不超過 10°C, GC含量控制在 40%—60%, 正反引物相差不超過10%。引物送由上海生工生物工程有限公司合成。

首先選用6個個體DNA模板對合成引物進(jìn)行初步篩選, 選出能穩(wěn)定擴(kuò)增出目的條帶的微衛(wèi)星標(biāo)記,并通過溫度梯度PCR優(yōu)化引物退火溫度。其次用30個秦皇島群體模板對初選引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增, 篩選出具多態(tài)性的微衛(wèi)星引物。然后用篩選出的引物在剩余4個群體中PCR擴(kuò)增, 并對單環(huán)刺螠5個地理群體的遺傳多樣性進(jìn)行評價。PCR反應(yīng)體系如下:2μLDNA 模板(30ng/μL), 2.5μL10×buffer(Mg2+Plus),引 物 各 1μL(50μmol/L), 0.5μLdNTP(10mmol/L),0.3μLTaq DNA 聚合酶(5U/μL), 17.7μL 滅菌水, 共計25μL的 PCR反應(yīng)體系。反應(yīng)程序為: 94°C預(yù)變性5min, 94°C變性45s, 退火反應(yīng)45s, 72°C延伸1min,35個循環(huán), 最后72°C延伸10min。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

Gel-Por Analyzer軟件統(tǒng)計各微衛(wèi)星DNA條帶分子量大小; PopGene32軟件計算每個位點的等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He); Cervus軟件計算多態(tài)信息含量(PIC);GenePop軟件檢驗 Hardy-Weinberg平衡, 并經(jīng)Bonferroni校正; FSTAT 2.9.3軟件以Nei(1972)參數(shù)計算兩兩群體間遺傳分化指數(shù)(FST); 運(yùn)用TFPGA軟件根據(jù) Nei(1972)參數(shù)進(jìn)行群間遺傳距離(DS)的計算,并進(jìn)行 UPGMA聚類分析; 利用 IBDWS軟件中的Mantel 檢驗評估單環(huán)刺螠群體間遺傳距離和地理距離的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 DNA提取結(jié)果

提取的單環(huán)刺螠組織 DNA的整體濃度在400—700ng/μL, OD260/OD280值在 1.9—2.1 之間, 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測, 個別樣本有拖帶及膠孔蛋白殘留現(xiàn)象, 但不影響PCR擴(kuò)增。

2.2 微衛(wèi)星標(biāo)記篩選與評價

Primer 5.0軟件設(shè)計引物200對, 挑選50對引物進(jìn)行合成, 利用 30個秦皇島野生群體 DNA樣本對其進(jìn)行篩選和多態(tài)性分析, 共篩選出了22對能穩(wěn)定擴(kuò)增且具多態(tài)性的微衛(wèi)星標(biāo)記, 其余28對引物擴(kuò)增產(chǎn)物呈單態(tài)或無產(chǎn)物, 結(jié)果見表 2。根據(jù)Weber(1990)提出的微衛(wèi)星分類標(biāo)準(zhǔn), 22個微衛(wèi)星序列全部為完美型。其中二核苷酸微衛(wèi)星5個(22.73%),三核苷酸微衛(wèi)星 14個(63.64%), 四核苷酸微衛(wèi)星 2個9.09%), 五核苷酸微衛(wèi)星1個(4.55%)。每個微衛(wèi)星位點的平均等位基因數(shù)(Na)為 10.6364, 平均期望雜合度(He)為 0.8826, 平均多態(tài)信息含量(PIC)為0.8535。其中一個微衛(wèi)星引物 UuS27在群體中擴(kuò)增的電泳圖如圖1。

表2 單環(huán)刺螠多態(tài)性微衛(wèi)星引物序列信息Tab.2 Information of polymorphic microsatellite markers isolated from U. unicinctus

圖1 微衛(wèi)星引物UuS27 在單環(huán)刺螠中擴(kuò)增的電泳圖譜Fig.1 Electrophoretic patterns of PCR products amplified by primer UuS27 in U. unicinctus

2.3 群體多樣性分析

從5個群體整體來看, 22對微衛(wèi)星位點的遺傳統(tǒng)計指標(biāo)見表3, 共檢測到719個, 等位基因數(shù)(Na)介于24—44, 有效等位基因數(shù)(Ne)介于 2.95—14.40, 觀測雜合度(Ho)和期望雜合度(He)范圍分別是 0.537—0.959和0.929—0.971, 每個位點的多態(tài)信息含量(PIC)介于0.921—0.967之間。

22個微衛(wèi)星位點在 5 個單環(huán)刺螠地理群體中的遺傳多樣性信息見表 4, 從表 4可以看出, 平均等位基因數(shù)差別很小, 由高到低依次為QHD群體(10.64)、DL群體(10.41)、YT群體(9.73)、QD群體(9.59)、WF群體(9.18); 平均多態(tài)信息含量的順序與平均等位基因數(shù)排序一致。DL群體的平均觀測雜合度(Ho=0.9118)、期望雜合度(He=0.8962)及多態(tài)信息含量(PIC=0.8692)均最大, WF群體的平均期望雜合度(He=0.8510)、多態(tài)信息含量(PIC=0.8200)及等位基因數(shù)均最小。以上結(jié)果表明, 5 個單環(huán)刺螠群體的遺傳多樣性較為豐富, 其中DL群體的遺傳多樣性在5個群體中最高, 而WF群體最低。

基于 Hardy-Weinberg平衡定律對 5個地理群體中的每個位點基因平衡狀態(tài)進(jìn)行檢測(表 4), 經(jīng)Bonferroni校正(P<0.0023)后, 在 QHD 群體中, 有 3個位點顯著 Hardy-Weinberg平衡, 分別為 UuS11、UuS19、UuS22; 在YT群體中, 有2個位點顯著偏離,分別為 UuS23、UuS26; 在 WF群體中, 有 4個位點顯著偏離平衡, 分別為 UuS17、UuS20、UuS22、UuS29;在QD群體中, 有2個位點顯著偏離, 分別為UuS23、UuS29; 在DL群體中, 除UuS7位點外, 其余位點等位基因頻率均符合。連鎖不平衡檢測表明, 各位點間無連鎖不平衡現(xiàn)象。

表3 單環(huán)刺螠22個微衛(wèi)星位點的遺傳統(tǒng)計指標(biāo)Tab.3 The genetic statistics of 22 SSR markers in U. unicinctus populations

表4 5個單環(huán)刺螠地理群體的微衛(wèi)星遺傳多樣性參數(shù)Tab.4 The polymorphic indicators in 17 SSR loci of 5 U. unicinctus populations

續(xù)表

續(xù)表

2.4 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

5個單環(huán)刺螠群體間的平均遺傳分化指數(shù)(FST)和遺傳距離(DS)如表5所示。不同群體間的遺傳分化指數(shù)FST值范圍為0.0880—0.1136, 各群體間FST值差異不顯著(P＞0.05); 從 Nei’s標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離來看, YT和DL群體遺傳距離最遠(yuǎn)(DS=0.3217), 說明兩群體間親緣關(guān)系最遠(yuǎn); YT和 QD群體遺傳距離最近(DS=0.2170), 說明兩群體間親緣關(guān)系較近; DL群體與其他群體均有較遠(yuǎn)的遺傳距離?；贜ei遺傳距離采用UPGMA方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2), YT與QD群體首先聚為一起, 再與QHD群體聚為一支, 然后跟WF群體聚為一支, DL群體為外圍群(outgroup), 再聚為一支。IBD 分析結(jié)果顯示單環(huán)刺螠群體之間遺傳距離和地理距離不存在顯著相關(guān)(見圖 3,R2=0.1600,P=0.876＞0.05), 表明基因流動不符合地理距離隔離模式。

表5 單環(huán)刺螠5個群體間的遺傳分化指數(shù)(FST)和遺傳距離(DS)Tab.5 Pairwise genetic differentiation (FST) and genetic distance (DS) in pair of the 5 populations in U. unicinctus

圖2 單環(huán)刺螠5個群體的UPGMA聚類圖Fig.2 UPGMA dendrogram of 5 U. unicinctus populations

3 討論

微衛(wèi)星標(biāo)記在水產(chǎn)動物遺傳分析和育種實踐中被廣泛使用, 但有關(guān)單環(huán)刺螠微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā)及應(yīng)用尚未見報道。本研究采用RAD測序法獲得微衛(wèi)星標(biāo)記, 這種方法與傳統(tǒng)的磁珠富集法相比, 不僅節(jié)約實驗成本, 而且可以快速精確的定位出大量微衛(wèi)星序列。本研究中得到 1287個微衛(wèi)星序列, 并從中挑選了重復(fù)單元、重復(fù)次數(shù)都較多的微衛(wèi)星序列進(jìn)行引物設(shè)計。選用此類微衛(wèi)星核心序列, 能避免篩選出過多低多態(tài)性微衛(wèi)星位點(韓承慧等, 2016)。本研究中獲得的微衛(wèi)星位點均為完美型(Perfect), 而未得到非完美型(Imperfect)和復(fù)合型(Compound)微衛(wèi)星片段, 原因可能是 RAD測序法進(jìn)行酶切時破壞了后兩種微衛(wèi)星片段, 此現(xiàn)象在菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)的微衛(wèi)星開發(fā)中也有報道(閆路路等,2015)。而在長臀鮠(Cranoglanis bouderius)(孔杰等,2016)、蝦夷扇貝(Patinopecten yessoensis)(趙瑩瑩等,2006)的磁珠富集法微衛(wèi)星開發(fā)中則得到了更豐富的微衛(wèi)星類型。主要原因可能是獲取微衛(wèi)星位點的方法存在明顯差異。

圖3 單環(huán)刺螠群體間遺傳距離和地理距離的相關(guān)性(y=0.0805+8.647×10–4x, R2 = 0.160, P = 0.876)Fig.3 Relationship between geographical and genetic distancesin U. unicinctus populations by IBD analysis

多態(tài)信息含量(PIC)是衡量基因座位在群體多態(tài)性的指標(biāo), 當(dāng) PIC＞0.50時, 為高度多態(tài)(Ortíet al,1997), 本研究中22個多態(tài)位點(平均PIC為0.921—0.967)全部表現(xiàn)為高多態(tài)性。群體的等位基因數(shù)(N)及遺傳雜合度(H)是評估和度量群體遺傳多樣性程度的重要參數(shù)。依據(jù)微衛(wèi)星選擇標(biāo)準(zhǔn)(Barker, 1994), 當(dāng)?shù)任换驍?shù)(Na)＞4個時能較好的反映群體遺傳變異水平, 本研究中 5個群體中檢測的平均Na為 9.18—10.64, 平均Ne為6.63—8.85, 分析其等位基因保存較好的原因, 主要是單環(huán)刺螠生存環(huán)境適宜且受到的人為破壞較少。Leberg(2002)研究發(fā)現(xiàn)期望雜合度(He)比觀測雜合度(Ho)更能準(zhǔn)確衡量群體多樣性大小, 本研究中5個地理群體的平均Ho為0.7903—0.9118, 平均He為0.8510—0.8962, 與王蕾等(2010)調(diào)查的渤海牙鲆(Paralichthys olivaceus)群體多樣性(Ho=0.532—0.895;He=0.635—0.902)相比,He值相對更大, 表明黃渤海單環(huán)刺螠在自然海區(qū)仍保持較高的遺傳多樣性。在所篩選出的22個微衛(wèi)星標(biāo)記中, 有12個位點在不同群體中出現(xiàn)了偏離Hardy-Weinberg平衡的現(xiàn)象, 可能原因是單環(huán)刺螠活動能力不強(qiáng), 營定居式生活, 可能存在近親交配, 導(dǎo)致群體內(nèi)雜合子過剩或缺失; 也可能是實驗選用樣本數(shù)較少, 對位點平衡有一定的影響, 對長牡蠣(Crassostrea gigas) (Yanet al, 2015)、美洲簾蛤(Mercenaria mercenaria) (Yuet al, 2010)等固著型和埋棲型貝類利用微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行遺傳分析時也存在微偏離Hardy-Weinberg平衡的現(xiàn)象。

本研究利用基因遺傳分化指數(shù)FST來評價群體遺傳分化程度。按照 Balloux等(2002)的評判標(biāo)準(zhǔn),FST在 0.00—0.05時代表群體間分化程度弱; 0.05—0.15代表分化程度中等; 0.15—0.25代表分化程度較大;0.25—1.00代表分化程度極大。本研究5個地理群體間的遺傳分化指數(shù)水平為 0.0880—0.1136, 說明群體分化水平并不高, 遺傳變異主要來自群體內(nèi)的個體之間, 與楊智鵬等(2015)報道的我國沿海脈紅螺(Rapana venosa) 9個群體間遺傳分化特性(FST為0.0122—0.0936)得到類似的結(jié)果。本研究結(jié)果表明,YT和DL群體遺傳距離最大(0.3217), YT和QD遺傳距離最小(0.2170), IBD檢驗結(jié)果顯示單環(huán)刺螠群體不符合距離隔離模式, 即群體間的遺傳分化未隨地理距離的增加而增加, 說明群體間可能存在較強(qiáng)的基因流, 原因可能是黃、渤海海區(qū)海流增加了地理群體間基因流的機(jī)會性, 此結(jié)果與倪樂海(2011)對我國北方中國蛤蜊 9個地理群體的遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)分析一致。對其他海洋生物如多鱗鱚(Sillago sihama)(郭昱嵩等, 2013)、近江牡蠣(Crassostrea ariakensis)(Xiaoet al, 2010)等也有過IBD模式的報道。同時 Melchinger等(1990)認(rèn)為在遺傳距離小于0.54時, 親本間的遺傳距離越大, 雜交子代的基因雜合度越高, 雜種優(yōu)勢越強(qiáng)。本研究遺傳距離范圍在0.2170—0.3217, 均滿足以上條件。在未來進(jìn)行單環(huán)刺螠人工選育時選取遺傳距離較遠(yuǎn)且性狀優(yōu)良的群體間進(jìn)行雜交,可能選育出優(yōu)良單環(huán)刺螠新品種。

4 結(jié)論

本研究開發(fā)的22對高多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記可以用于單環(huán)刺螠微衛(wèi)星多態(tài)性、群體多樣性、遺傳學(xué)分析和種群進(jìn)化等研究, 從分子標(biāo)記水平表明秦皇島、煙臺、濰坊、青島和大連5個野生地理群體的雜合度較高, 遺傳多樣性豐富, 種群遺傳結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定。單環(huán)刺螠種群在黃、渤海海區(qū)多樣性水平雖然較高, 但應(yīng)及時采取措施加強(qiáng)單環(huán)刺螠種質(zhì)資源保護(hù)與管理,以緩解或避免由于過度濫捕造成自然單環(huán)刺螠種群遺傳多樣性的丟失。同時本研究也為下一步良種人工選育工作提供指導(dǎo)。

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