吳海燕 郭萌萌 邴曉菲 鄭關超 彭吉星 譚志軍① 翟毓秀

(1. 農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測與評價重點實驗室 中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071;2. 國家水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心 青島 266071; 3. 上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院 上海 201306)

麻痹性貝類毒素(paralytic shellfish toxins, PSTs)是分布最廣、危害最嚴重的海洋生物毒素之一, 多次造成消費者中毒甚至死亡事件。世界衛(wèi)生組織(WHO)規(guī)定貝類可食部分的PSTs限量為800μg STX eq/kg。目前, PSTs已成為海產(chǎn)貝類國際貿(mào)易壁壘主要的限制對象, 重點加以監(jiān)控。鑒于 PSTs毒素可由亞歷山大藻屬(Alexandrium)、膝溝藻屬(Gonyaulax)和裸甲藻屬(Gymnodinium)等雙鞭甲藻類產(chǎn)生, 其風險性又因產(chǎn)毒藻種類、藻株、地理位置以及蓄積貝類等因素而存在很大差異(Zouet al, 2014), 給監(jiān)控監(jiān)管工作帶來一定的困難。

現(xiàn)有檢測方法中, 小鼠生物法(Mouse Bioassay,MBA)和液相色譜檢測法是目前應用最多, 也是歐盟官方指定PSTs標準檢測方法。而兩種檢測方法均有其局限性。MBA特異性、重現(xiàn)性和靈敏度都很差(Turneret al, 2012), 且僅能提供毒素總量的檢出情況。液相方法前處理復雜需要經(jīng)過柱前或者柱后衍生化, 檢測過程中存在目標物共流出現(xiàn)象, 導致定性、定量不準確。不僅如此, 兩種方法檢測結(jié)果之間存在較大差異(Ben-Gigireyet al, 2012; Harjuet al, 2015;Burrellet al, 2016)。因此, 歐盟、CAC等國際組織經(jīng)過多輪磋商, 初步商定以液質(zhì)聯(lián)用技術作為標準方法, 以提升國際社會對 PSTs監(jiān)控的一致性, 確保消費者健康安全。目前, 國內(nèi)外已建立了多種 PSTs液質(zhì)聯(lián)用檢測技術(Zhuoet al, 2013; 周磊等, 2014; 于慧娟等, 2015), 其主要缺點是: 多殘留折算毒力當量因子后的檢出限總量與小鼠生物法比較不存在明顯優(yōu)勢; 為了降低基質(zhì)干擾, 在前處理過程中引入高倍數(shù)的稀釋過程(Boundyet al, 2015), 使檢測方法檢出限偏高; 國家標準GB/T 5009.213-2016僅檢測10種毒素, 而N-磺酰氨甲酰基類毒素在我國海域有廣泛分布, 且該毒素可轉(zhuǎn)化成其他高毒性物質(zhì)。因此, 亟需建立包含全部13種限量毒素的檢測方法。

針對上述問題, 本研究通過優(yōu)化前處理條件, 降低前處理過程稀釋倍數(shù), 提高方法靈敏度; 采用Qtrap質(zhì)譜的多反應監(jiān)測(MRM)-信息依賴采集(IDA)-增強子離子掃描(EPI)模式, 建立了13種PSTs的同時定量檢測與定性確證方法, 并用于渤海灣雙殼貝類樣品中PSTs的檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

AB-5500 QTRAP液相色譜-四極桿/離子阱復合質(zhì)譜(美國AB SCIEX公司), 配有電噴霧離子源(ESI);XW-80A旋渦混合器(上海醫(yī)大儀器廠); Himac CR 22GⅡ高速離心機(日立Hitachi公司); Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司); 固相萃取裝置(美國Supelco公司); 恒溫水浴鍋(上海藍凱儀器儀表有限公司)。甲醇、乙腈(HPLC級, 美國Merk公司); 甲酸、乙酸銨(HPLC級, 瑞士Fluka公司); 超純水(18.2 M?. cm);石墨化碳黑固相萃取柱(ENVI-CarbTM, 250mg/3mL,美國Supelco公司), 其他未作特殊說明的試劑均為分析純。

PSTs標準溶液: 石房蛤毒素 STX, 新石房蛤毒素NEO, 膝溝藻毒素GTX1、GTX2、GTX3、GTX4,N-磺酰氨甲酰基類毒素 GTX5、C1、C2, 脫甲?；惗舅?dcSTX、dcNEO、dcGTX2、dcGTX3標準品(加拿大國家海洋研究中心), 用 75%乙腈水(含 0.25%甲酸)稀釋配制成混合溶液, 其中各組分濃度分別為:GTX5、NEO、STX、dcNEO、dcSTX 為 500ng/mL;GTX3、GTX4、dcGTX3、C2為 200ng/mL; GTX1,GTX2為606ng/mL; C1為650ng/mL; dcGTX2為711ng/mL。

1.2 樣品預處理

1.2.1 試樣制備 用清水將貝殼外表洗凈。切斷閉殼肌, 用重蒸餾水淋洗內(nèi)部去除泥沙及其它異物, 仔細取出貝肉, 切勿割破貝體, 在篩子上平鋪瀝水5min, 然后將貝肉均質(zhì)、混勻。冷凍貝類: 在室溫下,使冷凍的樣品(帶殼或脫殼的)呈半冷凍狀態(tài), 按上述步驟開殼、淋洗取肉、均質(zhì)。樣品量約 200g。如樣品不能及時檢測, 應-18°C以下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 提取 稱取 5g試樣于 50mL離心管中, 加入5mL 1%乙酸水溶液, 渦旋混合90s。將離心管密封置于沸水中煮沸5min, 取出置于流水下冷卻至室溫。4500r/min離心10min, 待凈化。

1.2.3 凈化 移取上述提取液1mL于2mL離心管中, 加入5μL氨水, 渦旋混勻。依次用2mL乙腈, 2mL 20%乙腈水溶液(含 1%乙酸)、2mL 0.1%氨水溶液活化Supelco ENVI-Carb固相萃取柱, 加入500μL提取液, 再用700μL超純水淋洗, 正壓擠干, 最后用1mL 75%乙腈水(含0.25%甲酸)洗脫混勻, 過0.22μm濾膜于進樣小瓶中, 4°C下保存, 供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。

1.3 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析條件

液相色譜條件: TSK-Amide-80(3μm, 2mm×15cm);柱溫: 40°C; 流速: 0.35mL/min; 進樣量: 10μL; 流動相: A: 水(含 2mmol/L甲酸銨, 50mmol/L甲酸), B:95%乙腈水溶液(含2mmol/L甲酸銨, 50mmol/L甲酸);洗脫梯度: 0—3.0min, 80% B; 3.1—5.0min, 80%—40% B; 5.1—10.0min, 40% B; 10.1—11.0min, 40%—80% B; 11.1—13.0min, 80% B。

質(zhì)譜條件: 電噴霧離子源(ESI), 多反應監(jiān)測(MRM), 正負離子切換模式; 噴霧電壓: 5.5kV,-4.5kV; 離子源溫度 550°C; 碰撞氣壓力: Medium;氣簾氣壓力: 30psi; 霧化氣壓力 GS1: 50psi; 輔助加熱氣壓力GS2: 50psi。其他參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在電噴霧離子源下, 通過針泵進樣, 正/負離子模式下進行母離子和碎片子離子的掃描, 以確定最佳MRM離子對。結(jié)果表明: STX類毒素, 包括STX,dcSTX, NEO, GTX5以及dcNEO在正離子模式下靈敏度高, 獲得碎片信息豐富; 其他含硫麻痹性貝類毒素GTX以及C在負離子模式下分子離子峰[M-H]–有更好的離子響應, 較正離子模式靈敏度提高2—10倍,所有的同分異構體可通過二級質(zhì)譜進行區(qū)分。其中GTX1—4二級譜圖中碎片峰較少, 主要為[M-HH2O]–、[M-H-NHCO]–和[M-H-NHCO-H2O]–(李兆永等, 2014)。dcGTX和C類毒素, 二級譜圖碎片峰較多, 但相對豐度低, 其中包括中性丟失-SO3碎片。而GTX5在負離子模式下響應更佳, 但無穩(wěn)定碎片離子, 因此采用正離子模式下掃描, 以 MRM 離子對定性。

表1 13種PSTs的質(zhì)譜分析參數(shù)(Boundy et al, 2015)Tab.1 The mass spectrometry parameters of 13 paralytic shellfish toxins (PSTs)

同時, 為了完善 PSTs的定量檢測與高精確度定性分析, 采用 MRM 檢測結(jié)合 IDA-EPI的采集模式,在檢測過程中通過預設條件, 對疑似檢測結(jié)果觸發(fā)EPI增強子離子掃描, 分別采集碰撞能量為(20, 35,50, 35)±15eV的全掃描二級質(zhì)譜圖。如圖1所示, 同分異構體在相同的能量下, 離子豐度比有明顯差異。該質(zhì)譜圖可與預采集的標準物質(zhì)質(zhì)譜譜庫進行匹配(IF＞85%), 同時參考保留時間偏差(＜3%), 共同確證目標化合物, 提高分析結(jié)果可靠性。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

PSTs是強極性生物堿, 在13種目標化合物中, 8種化合物存在同分異構體, 包括 GTX2與 GTX3,GTX1與GTX4, dcGTX2與dcGTX3以及C1與C2。通過優(yōu)化的色譜條件(Andrew, 2015; Boundyet al,2015), 將同分異構體化合物分別選擇正/負離子通道進行分析, 雖然可以解決部分離子響應差的問題, 但色譜條件較為苛刻, 穩(wěn)定性差且對儀器要求較高。為了達到同分異構體化合物基線分離的目的, 本研究選用兩種規(guī)格 HILIC色譜柱: Acquity UPLC BEH Amide(1.7μm, 2.1×150mm)與 TSK-Amide-80(3μm, 2.1×150mm)。其中小粒徑Waters色譜柱靈敏度優(yōu)于TSK色譜柱, 但在普通高效液相色譜上分離度較差, 適用性不強。比較而言, 采用 75%的乙腈水(含 0.25%甲酸)作為標準品稀釋溶液, 通過TSK色譜柱的分離,即滿足檢測靈敏度要求且可將同分異構體達到基線分離, 故選用該色譜柱。如圖 2中所示, 由于 PSTs結(jié)構與極性相近, 出峰時間較為集中, 但采用本方法優(yōu)化的色譜條件, 目標物在各自離子通道達到完全分離。根據(jù)同分異構體化合物標準品濃度差異結(jié)合其離子響應, 可明顯區(qū)分出峰先后順序, 通過保留時間進行定性。

圖2 13種PSTs標準溶液提取離子色譜圖(STX濃度為20.0ng/mL的混合標準溶液)Fig.2 The extracted ion chromatograms of 13 PSTs standard solution ((mixed standard solution containing STX 20.0ng/mL))

2.3 樣品前處理方法的優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的優(yōu)化 為了提高PSTs的提取效率, 方法對比了四種常用PSTs提取試劑的提取效果,分別為 1%乙酸水溶液、0.1mol/L鹽酸水溶液(EURLMB, 2014)、90%乙腈水溶液(Zhuoet al, 2013)以及80%乙腈水溶液(Sayfritzet al, 2008)(含0.1%甲酸)。每組實驗設6個平行, 在扇貝基質(zhì)中添加混合標準溶液 200μL, 通過測試各組分含量折算回收率, 以確定最佳提取溶劑。

結(jié)果表明, 乙腈水溶液提取效率最差不足70%。1%乙酸水溶液提取效率優(yōu)于 0.1mol/L鹽酸水溶液,其回收率81.8%—108%之間。這是因為PSTs在酸性條件下穩(wěn)定(pH＜4.50), 最佳pH為3.00。1%乙酸水溶液pH為2.90, 更有利于PSTs的提取。且N-磺酰氨甲?；惗舅?GTX5、C1、C2在鹽酸提取液的加熱過程中, 可發(fā)生轉(zhuǎn)化(Botana, 2008)形成STX、GTX2、GTX3, 從而影響檢測結(jié)果。本研究選用1%乙酸水溶液作為提取劑, 結(jié)合沸水浴加熱 5min的方式, 可模擬食物在胃中消化過程(Botana, 2008), 能較好地擬合毒素在人體中的作用方式, 是目前應用較為廣泛的PSTs前處理方法。

2.3.2 固相萃取小柱的對比 雙殼貝類樣品基質(zhì)復雜, 其中對檢測結(jié)果造成影響的主要包括鹽和金屬離子(Mg2+, Cu2+)等, 其基質(zhì)抑制率在 30.0%—50.0%之間(于慧娟等, 2015)。方法比較了 C18、HLB(Zhuoet al, 2013)以及石墨化炭黑固相萃取柱(Turneret al, 2015)對PSTs的凈化與回收率影響。如圖3所示, 三種固相萃取小柱中, C18對于部分毒素化合物如GTX5保留性差, 而石墨化炭黑柱能更好地去除貝肉基質(zhì)干擾, 顯著提高目標物回收率。這是因為ENVI-Carb包含高強度的大表面積球形粒子, 可回收70%以上的強極性化合物。通過優(yōu)化的洗脫液75%乙腈水(含0.25%甲酸), 保證目標化合物洗脫完全, 且顯著降低前處理過程中的稀釋倍數(shù), 提高檢測方法的靈敏度。

2.4 方法學驗證

取適量PSTs混合標準溶液配制一系列濃度梯度的標準溶液依次測定(表 2)。以各組分的面積比值為縱坐標, 質(zhì)量濃度為橫坐標進行線性回歸分析。采用空白扇貝基質(zhì)添加相應混合標準溶液的方式, 以信噪比(S/N≥3)確定各組分檢出限(LOD), 以信噪比(S/N≥10)確定各組分定量限(LOQ)。結(jié)果表明, 13種PSTs的線性良好, 其相關系數(shù)(R2)均大于0.99。13種PSTs在檢出限下按毒性因子轉(zhuǎn)換后相當于 62.0μg STX eq/kg, 滿足目前PSTs限量要求。

圖3 不同固相萃取小柱對回收率的影響(n=6)Fig.3 Influence of solid phase extraction column on the ratio of recovery (n=6)

表2 13種PSTs的線性范圍、回歸方程、相關系數(shù)和定量限Tab.2 The linear range, regression equation, correlation coefficient, and quantitation limits of 13 PSTs

選取櫛孔扇貝、貽貝、波紋巴非蛤和太平洋牡蠣四種貝類基質(zhì), 分別通過添加STX濃度為10.0、20.0、50.0μg/kg混合標準溶液進行測定, 設定每個濃度測試6個平行樣本。結(jié)果見表3, PSTs在四種貝類基質(zhì)中的平均回收率與相對標準偏差分別為: 櫛孔扇貝(79.6±10.4)%—(98.6±6.40)%, 貽 貝 (81.4±4.67)%—(97.6±4.39)%, 波 紋 巴 非 蛤 (82.6±6.33)%—(99.4±6.38)%, 太平洋牡蠣(80.4±13.8)%—(98.8±6.54)%。方法的準確度與精密度良好, 能滿足雙殼貝類樣品檢測過程中13中PSTs的準確測量要求。

2.5 實際樣品的測定

表3 四種基質(zhì)加標樣品平均回收率以及相對標準偏差Tab.3 Average recovery and relative standard deviation of PSTs in four shellfish spiked samples

表4 市售雙殼貝類樣品中的PSTs含量Tab.4 Concentrations of the PSTs in bivalve mollusks purchased in local market (μg/kg)

分別采集2016年5月渤海灣海域貝類樣品10份,包括貽貝、太平洋牡蠣、櫛孔扇貝、毛蚶和波紋巴非蛤各 2份, 發(fā)現(xiàn)部分樣品 PSTs總量較高, 最高達到627μg STX eq/kg(表 4), 接近 PSTs 限量標準 800 μg STX eq/kg。對檢出樣品進行譜庫檢索, 匹配度＞85.0%。主要的毒素種類為 STX、GTX1、GTX2、GTX3、GTX4以及C1、C2。其中以貽貝中毒素蓄積含量最高, 扇貝次之, 且蚶樣品所有毒素均未檢出。

在實際樣品檢測過程中, 應用方法中的定性功能發(fā)現(xiàn)其中STX疑似陽性樣品。如圖4所示, 目標峰的液相保留時間偏差＜3%, 雖MRM離子對離子比率差異明顯, 但在實際檢測過程中容易發(fā)生誤判, 定性為STX檢出。應用本研究中檢測方法, 將樣品中STX的EPI譜圖與譜庫中STX相同高能量下的EPI譜圖比對, 其匹配度IF值為52.6%＜85.0%判定值, 故可判定樣品中未檢出STX。綜上所述, 本方法適用于復雜樣品基質(zhì)條件下的 PSTs定性檢測, 可提高檢測結(jié)果的可信度。

圖4 標準樣品中STX與實際樣品中疑似STX的提取離子流圖與二級碎片譜圖Fig.4 XIC and EPI chromatography of STX in standard sample and actual sample

3 結(jié)論

本研究建立了適用于雙殼貝類中13種PSTs的液相色譜-四級桿/離子阱復合質(zhì)譜檢測方法。本方法靈敏度高, 穩(wěn)定性好。在實際樣品檢測中, 檢出高含量陽性樣品, 并對疑似陽性樣品進行了準確的定性判定。本方法為進一步開展全國貝類中PSTs的監(jiān)測, 保障消費者的食用安全以及實現(xiàn)貝類出口貿(mào)易復關,提供了有效的技術手段。

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