孫 瑜 丁國芳 徐銀峰

(浙江海洋大學(xué) 浙江省海洋生物醫(yī)用制品工程技術(shù)研究中心 舟山 316022)

羊棲菜(Sargassum fusiforme)屬于圓子綱、墨角藻目、馬尾藻科、馬尾藻屬, 是一種廣泛分布在中國、韓國和日本沿海的海洋褐藻, 在我國北起遼東半島,南至雷州半島均有分布。褐藻不僅作為食物, 而且作為草藥已被人們廣泛消費(fèi)。研究表明, 褐藻中含有多種生物活性物質(zhì), 其中所含的甾醇具有抗菌和抗氧化活性(Ayyadet al, 2003)。Kavita等(2014)報(bào)道了從琉璃苣紅色海藻提取的 24Δ5甾醇, 具有對人類致病細(xì)菌的抗菌活性。Cheng等(2013)研究了來自海洋海綿(Haliclona crassiloba)的多羥基甾醇, 此多羥基甾醇對一些革蘭氏陽性菌株顯示抑菌活性, 最小抑制濃度(MIC)范圍為 4—32μg/mL。此外, Lee等(2003)報(bào)道了從海藻中分離出的一種膽固醇化合物, 其抗氧化酶肝細(xì)胞溶質(zhì)超氧化物歧化酶(SOD)過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽過氧化物酶GSH-px活性分別為33.9%、21.6%和39.2%。

傳染病在世界范圍內(nèi)引起的發(fā)病率和死亡率仍居高不下, 抗微生物劑被認(rèn)為是用于治療傳染病的領(lǐng)先藥物。然而, 由于抗菌素耐藥性的發(fā)展、抗藥性菌株的出現(xiàn)以及抗性臨床分離物的快速全球傳播,細(xì)菌感染的治療仍然是一個(gè)重要的且具有挑戰(zhàn)性的問題(Urakamiet al, 2014; Banerjeeet al, 2015)。針對耐藥菌的一種潛在替代療法是使用抗氧化藥物?？寡趸幬锟梢灾斡皖A(yù)防一些由自由基引起的疾病。自由基是在身體中產(chǎn)生的高度反應(yīng)性化學(xué)物質(zhì), 具有損害細(xì)胞、細(xì)胞器、DNA、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和其他生物分子的潛力, 導(dǎo)致癌癥、心血管和神經(jīng)變性疾病。因此, 從生物系統(tǒng)中去除自由基對于細(xì)胞的可持續(xù)性至關(guān)重要?？寡趸瘎┮卜Q為自由基清除劑, 可以清除一 些 自 由 基 (Ahmedet al, 2015; Anastácioet al,2015)。

馬尾藻甾醇(Saringosterol)和巖藻甾醇(Fucosterol)是從褐藻中分離純化的兩種甾醇化合物, 其結(jié)構(gòu)式見圖1。據(jù)報(bào)道這兩種化合物作為藥物具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗肥胖、抗錐蟲和抗結(jié)核作用(Junget al,2013; Kimet al, 2014; Zhenet al, 2015), 但馬尾藻甾醇和巖藻糖醇的抗菌活性尚未見報(bào)道。本文采用經(jīng)典的抗菌和抗氧化模型對馬尾藻甾醇和巖藻甾醇進(jìn)行抗菌活性和抗氧化活性研究。

圖1 馬尾藻甾醇和巖藻甾醇結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure of saringosterol and fucosterol

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

羊棲菜(Sargassum fusiforme)采于浙江省舟山市東港海邊。熔點(diǎn)采用毛細(xì)管測定。紅外光譜儀FT-IR1730 (Bruker公司), 核磁共振光譜儀 AV-300(Bruker公司)。高分辨率質(zhì)譜儀 MALDI-TOF/TOF(Bruker Daltonik 德國)。DPPH (2,2-二苯基-1-苦基肼基)、ABTS (2,2′-連氮基-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、變異鏈球菌(S. mutans)、大腸桿菌(Escherichia coli)、甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌、甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌、喹諾酮抗性金黃色葡萄球菌、喹諾酮抗性金黃色葡萄球菌購自Sigma公司。其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 甾醇的分離與純化

將干燥的褐藻羊棲菜用 95%乙醇回流 1h, 重復(fù)三次。所得乙醇萃取物過濾, 并在真空下濃縮。將混合物用水溶解, 依次用正己烷和乙酸乙酯萃取得到粗提物。將正己烷層進(jìn)行硅膠柱分離, 用正己烷-乙酸乙酯(10:1, 8:1, 6:1, 4:1, 2:1, 1:1)和乙酸乙酯-甲醇(4:1,2:1, 1:1)進(jìn)行洗脫, 得到十個(gè)亞級分(sfr): sfr.1至sfr.10。將次級分7和8進(jìn)行等度半制備HPLC分離,采用正己烷-乙酸乙酯(5:1), 得到白色固體。經(jīng)現(xiàn)代分析光譜確定為巖藻甾醇。巖藻甾醇的熔點(diǎn)和光譜數(shù)據(jù)如下。Mp. 122-124°C; IR (KBr) cm–1: 3409, 2956, 1641,1473, 1383, 1052, 1029;1H-NMR (CDCl3,500 MHz):δ0.71(3H, s, H-18), 0.97(3H, d,J=6.42 Hz, H-21),1.09(3H, s, H-19), 1.60 (3H, d,J=6.62 Hz, H-29),2.18(1H, m, H-25), 3.59(1H, m, H-3), 5.24(1H,q,J=6.81 Hz, H-28), 5.39(1H, br d,J=5.12 Hz, H-6);10.15 (1H, s, -OH);13C-NMR (CDCl3, 100 MHz):δ145.98(C-24), 140.72(C-5), 120.98(C-6), 115.52(C-28),72.04(C-3), 57.87(C-14), 56.08(C-17), 49.79(C-9),43.10(C-13), 42.40(C-4), 40.13(C-12), 37.62(C-1),37.11(C-10), 36.51(C-20), 35.43(C-22), 34.67(C-25),32.10(C-8), 31.98(C-2), 31.65(C-7), 28.73(C-16),2575(C-23), 25.05(C-15), 22.43(C-27), 22.19(C-26),21.34(C-11), 20.10(C-19), 19.04(C-21), 13.28(C-29),11.98 (C-18); ESI-HRMS C29H48O+([M+H]+)的計(jì)算值:413.3705, 實(shí)測值: 413.3709。綜合分析上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致(Sheuet al, 1997)。

馬尾藻甾醇的熔點(diǎn)和光譜數(shù)據(jù)如下。Mp.158.6—161.3°C; IR (KBr) cm–1: 3393, 2941, 1640,1472, 1380, 1060, 1040;1H-NMR (CDCl3,500MHz):δ0.66—1.12 (15H, m, (-CH3)5), 1.02—1.73 (20H, m,(-CH2)10), 2.91-3.45 (6H, m, (-CH)6), 5.30 (1H, q,J=6.82Hz, H-28), 5.42 (1H, br d,J=5.16Hz, H-6), 10.21(1H, s, -OH);13C-NMR (CDCl3, 100MHz):δ145.09,140.69, 121.88, 115.86, 71.74, 58.32, 56.74, 50.16,44.03, 42.89, 41.80(C-4), 38.13, 37.83, 36.49, 35.98,31.95, 31.93, 30.75, 30.12, 27.70, 27.58, 27.04, 22.30,21.67, 21.20, 19.36, 15.34, 14.68, 13.34; ESI-HRMS C29H48O2+([M+H]+)的計(jì)算值: 428.3654, 實(shí)測值:428.3647。綜合分析上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致(W?chteret al, 2001)。

1.3 體外抗菌活性評價(jià)

實(shí)驗(yàn)選取金黃色葡萄球菌(S. aureus4220, 503和209), 變異鏈球菌(S. mutans3065和 3289)和大腸桿菌大腸桿菌(E. coli1924和1356)。耐藥性臨床分離株的菌株是多重耐藥金黃色葡萄球菌(MRSA CCARM 3167和MRSA CCARM 3506)和喹諾酮抗性金黃色葡萄球菌(QRSA CCARM 3505和 QRSA CCARM 3519)。從幾個(gè)診所住院的各種患者收集臨床分離物,遵循雙重連續(xù)稀釋技術(shù)(Songet al, 2012; Kauret al,2014), 以測試在初步測試(革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌)中總甾醇、馬尾藻甾醇、巖藻甾醇和藥物對敏感微生物的最小抑制濃度(MIC), 得到耐藥革蘭氏陽性細(xì)菌的臨床分離株。將溶于二甲基亞峰的總甾醇、馬尾藻甾醇和巖藻甾醇加入到培養(yǎng)基(用于變形鏈球菌的腦心浸液和用于其他細(xì)菌的MüllereHinton瓊脂)中, 得到50—200mg/kg和0.5—64mg/mL的終濃度。將完全抑制微生物生長的測試物質(zhì)的最低濃度記錄為MIC(以mg/mL表示), 在37°C孵育20h后讀取MIC值。得到細(xì)菌最終應(yīng)用量為105CFU/mL。諾氟沙星和氧氟沙星用作陽性藥物對照。所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三次。

1.4 DPPH自由基清除活性判定

參考Aktumsek等(2013)報(bào)道的方法測定總甾醇、馬尾藻甾醇和巖藻甾醇的DPPH自由基清除活性。稱取24mg DPPH溶解在100mL甲醇中, 制備得到自由基儲備溶液, 置于冰箱備用。另用甲醇稀釋DPPH儲備溶液, 溶液要求在517nm處獲得約0.96±0.02的吸光度。在試管中, 將DPPH (3mL)工作溶液與總固醇、馬尾藻甾醇和巖藻甾醇(0.5—2.5mg/mL)或標(biāo)準(zhǔn)溶液混合到100μL。在517nm下測試吸光度30min。通過下式計(jì)算抗氧化劑或自由基清除效應(yīng)的百分比: 抗氧化活性(%)=[(Ac-As)/Ac]×100其中, Ac和As分別是對照和樣品的吸光度。對照組含有100μL甲醇代替植物樣品。

1.5 ABTS…+脫色測定

參考Re等(1999)報(bào)道的ABTS…+脫色測定馬尾藻甾醇和巖藻甾醇的抗氧化作用。取 9.5mL ABTS(7mmol/L)與 245μL 硫酸鉀(100mmol/L)反應(yīng), 并用蒸餾水定容至10mL, 制備ABTS…+自由基溶液。溶液遮光室溫下保持 18h, 然后用 0.1mol/L磷酸鉀緩沖液(pH 7.4), 735nm處的吸光度為0.65±0.02。用甲醇中制備總甾醇馬尾藻甾醇和巖藻甾醇, 稀釋度為0.4—2.0mg/mL。將樣品(10μL)置于試管中, 并與3.0mL ABTS自由基溶液充分混合。在735nm處記錄其吸光度。采用下式計(jì)算樣品的抗氧化活性百分比:抗氧化活性(%)=[(Ac-As)/Ac]×100其中Ac和As分別是對照和樣品的吸光度。通過加入10μL甲醇代替樣品制備對照組。

1.6 超氧自由基測定

參考 Jin等(2014)的方法測定總甾醇、馬尾藻甾醇和巖藻甾醇的超氧自由基清除能力。將樣品溶解在不同濃度的蒸餾水中。然后, 將0.1mL試樣溶液, 1mL含有 NADH (557μmol/L)的 16mmol/L Tris-HCl (pH 8.0), 1mL 含有 PMS (45μmol/L)的 16mmol/L Tris-HCl(pH 8.0), 1mL 含有 NBT (108μmol/L)的 16mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)混合。將反應(yīng)混合物在室溫下溫育5min, 并通過分光光度計(jì)針對空白樣品在 560nm 測吸光度。反應(yīng)混合物的吸光度降低表明超氧化物陰離子清除活性增加。采用以下方程式計(jì)算清除超氧化物陰離子自由基的能力: 超氧化物清除速率(%)=[1–A1/A0]×100%。其中A0是沒有樣品的混合溶液的吸光度;Ai是與反應(yīng)溶液混合的測試樣品的吸光度。

1.7 羥自由基清除測定

羥基自由基測定根據(jù) Ghiselli等(1988)的方法測量。將總甾醇、馬尾藻甾醇和巖藻甾醇用 DMSO配成0.5—6.0mg/mL。將0.1mL樣品溶液與0.6mL緩沖液[0.2mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)]反應(yīng), 0.12mmol/L EDTA和2.60mmol/L脫氧核糖, 0.05mL 2.0mmol/L抗壞血酸, 0.2mL 0.4mmol/L硫酸亞鐵銨和 0.05mL的20mmol/L H2O2加入到反應(yīng)溶液中。將反應(yīng)溶液在37°C下孵育15min, 然后加入1mL硫代巴比妥酸(1%)和1mL三氯乙酸(2.0%)。然后, 混合物在100°C下反應(yīng)15min, 并用冰冷卻。在530nm處測吸光度來檢測羥基自由基的存在。對照組含有所有沒有樣品的反應(yīng)試劑, 并測量為A0。Ai是樣品的結(jié)果, 并且Aj包含所有樣品, 用不同毫升磷酸鹽緩沖液(20mmol/L pH 7.4,含有0.1mmol氯化鐵, 0.1mmol EDTA, 2.8mmol脫氧核糖)代替磷酸鹽緩沖液(20mmol/L pH 7.4) 0.1mL 1mmol Vit C和0.5mL 20mmol/L過氧化氫。通過下式計(jì)算羥基自由基清除率: 羥基清除率(%)=[1–(Ai–Aj)/A0]×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 化學(xué)分析

總甾醇、馬尾藻甾醇和巖藻甾醇通過膽固醇定量法反應(yīng)顯示出陽性反應(yīng), 這是甾醇物質(zhì)的特征反應(yīng)。通過IR,1H-NMR和13C-NMR和質(zhì)譜表征了馬尾藻甾醇的化學(xué)結(jié)構(gòu)。馬尾藻甾醇的IR光在3393cm–1譜帶為-OH, 在 2941cm–1為-CH3和 1640cm–1為-C=C-。在1H-NMR 10.21×10–6一般作為寬譜帶為-OH 峰, 在0.66×10–6(3H, s, H-18)和 1.04×10–6(3H, s, H-19)處顯示兩個(gè)-CH3質(zhì)子。=CH質(zhì)子在5.42 (1H, br d, H-6)處顯示為寬譜帶, 在多個(gè)峰處顯示3.50 (1H, m, H-3),這是以羥基甾醇為母核的特征Δ5-3β-。在13C-NMR譜中145.09(C-24), 140.69(C-5), 42.89(C-13), 36.49(C-10)處觀察到馬尾藻甾醇的四個(gè)-C-基團(tuán)。121.88(C-6),115.86(C-28), 71.74(C-3), 58.32(C-14), 56.74(C-17),50.16(C-9), 35.98(C-20), 34.67(C-25), 31.93, 在41.80(C-4), 38.13(C-12), 37.83(C-1), 34.75(C-22),30.12(C-2), 27.70(C-7), 27.58(C-16), 27.04(C-23),24.12(C-15), 22.30, 在 21.67(C-27), 21.20(C-26),19.36(C-19), 15.34(C-21), 14.68(C-29), 13.34(C-18)處為六個(gè)-CH3-。

2.2 總甾醇、馬尾藻甾醇和巖藻甾醇的抗菌活性

通過在體外用不同菌株的最小抑制濃度(MIC)評價(jià)抗菌活性(Winanset al, 1999)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示, 總甾醇在30、60和80mg/kg對金黃色葡萄球菌(S.aureus4220, 503和209)和變異鏈球菌(S. mutans3065和 3289)顯示抑菌活性。馬尾藻甾醇和巖藻甾醇在4—32mg/kg對金黃色葡萄球菌(S. aureus4220, 503和209)和變異鏈球菌(S. mutans3065和3289)具有高抑菌活性, 但活性低于諾氟沙星和氧氟沙星。總甾醇、馬尾藻甾醇和巖藻甾醇對革蘭氏陰性菌株大腸桿菌(1924和1356)均為顯示抑菌活性。

2.3 對耐藥革蘭氏陽性菌株的臨床分離株

表 2顯示, 馬尾藻甾醇和巖藻甾醇對多種耐藥性革蘭氏陽性細(xì)菌的許多臨床分離物的抗細(xì)菌作用。在4—32mg/mL劑量下, 馬尾藻甾醇和巖藻甾醇對多重耐藥性革蘭氏陽性細(xì)菌的臨床分離物具有高度活性。而且諾氟沙星在64mg/kg劑量下對QRSA沒有抑菌活性。氧氟沙星64mg/mL劑量下對MRSA沒有抑菌活性。

表1 總甾醇、馬尾藻甾醇和巖藻甾醇抑制活性Tab.1 Inhibitory activity of the total sterols, saringosterol and fucosterol

表2 對多重耐藥革蘭氏陽性細(xì)菌菌株的臨床分離物的MIC值Tab.2 MIC values against clinical isolates of multidrug-resistant Gram-positive bacterial strains

2.4 DPPH自由基清除活性

產(chǎn)生的若干自由基和氧物質(zhì)可通過其氧化作用損傷蛋白質(zhì)、DNA和脂質(zhì)等并引發(fā)衰老、動(dòng)脈粥樣硬化和癌癥等癥狀。因此, 自由基的去除對于生物系統(tǒng)細(xì)胞可持續(xù)性而言非常重要?？寡趸瘎? 被稱為自由基清除劑具有捕獲自由基物質(zhì)的作用(Alamet al,2013)。通過 DPPH自由基清除試驗(yàn)檢測了總甾醇、馬尾藻甾醇和巖藻甾醇的自由基清除或抗氧化作用。結(jié)果如圖 2a所示。結(jié)果表明, 總甾醇、馬尾藻甾醇和巖藻甾醇對抑制這些自由基的形成具有顯著的效果?？傜薮嫉那宄Ч陀隈R尾藻甾醇和巖藻甾醇。在 2.5mg/mL的濃度下, 馬尾藻甾醇、巖藻甾醇和總甾醇對DPPH自由基的清除率分別為84.7%、81.5%和73.2%。

2.5 根據(jù)ABTS…+部分脫色測定的抗氧化活性

ABTS自由基測定是適用于親脂性和親水性抗氧化劑, 包括羥基肉桂酸酯, 類胡蘿卜素和血漿抗氧化劑的脫色測定(Zhanget al, 2013)。通過用過硫酸鉀氧化 ABTS產(chǎn)生 ABTS…+形成自由基單分子, 再進(jìn)行還原反應(yīng)。圖2b中顯示了總甾醇、馬尾藻甾醇和巖藻甾醇的ABTS自由基清除作用, 總甾醇、馬尾藻甾醇和巖藻甾醇表現(xiàn)出令人滿意的 ABTS自由基清除作用, 其濃度排列總甾醇＜巖藻甾醇＜馬尾藻甾醇。在2.5mg/kg的濃度下, 馬尾藻甾醇, 巖藻甾醇和總甾醇的清除率分別為86.9%、82.4%和70.7%。

圖2 總甾醇、馬尾藻甾醇和巖藻甾醇對DPPH自由基(a)和ABTS自由基(b)的清除活性Fig.2 Scavenging activity of total sterols, saringosterol and fucosterol on DPPH radical (a) and ABTS radical (b)

2.6 超氧自由基測定

超氧化物基團(tuán)是通過許多生物學(xué)和光化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的高毒性物質(zhì)。超氧自由基可以分解形成單線態(tài)氧和羥基(Chenet al, 2015)?？傜薮?、巖藻甾醇和馬尾藻甾醇對超氧化物陰離子的清除效果顯示在圖 3a中?？傜薮?、巖藻甾醇和馬尾藻甾醇表現(xiàn)出具有劑量效應(yīng)關(guān)系的顯著清除活性?？傜薮?、馬尾藻甾醇和巖藻甾醇對超氧化物自由基的清除效應(yīng)為的總甾醇＜巖藻甾醇＜馬尾藻甾醇, 并且在2.5mg/kg的濃度下的影響為分別為60.3%、44.5%和34.6%。

2.7 羥基自由基測定

羥基自由基是反應(yīng)性較強(qiáng)并且能誘導(dǎo)鄰近的雙分子分解, 因此消除羥基自由基增強(qiáng)抗氧化能力。羥基容易在酸的存在下 Fe(II)絡(luò)合物與 H2O2的反應(yīng)產(chǎn)生的雙分子的氧化損傷。水楊酸具有吸收-OH以產(chǎn)生著色材料的能力。添加的羥基自由基清除劑與水楊酸競爭, 使得著色材料的含量下降。該方法用于評價(jià)天然化合物的羥基自由基清除能力(Yanget al, 2011;Lapshinaet al, 2015)。總固醇、馬尾藻甾醇和巖藻甾醇的清除效果見圖3b中。清除羥基自由基的活性是隨濃度增加而加強(qiáng), 且馬尾藻甾醇和巖藻甾醇的清除效果總是遠(yuǎn)低于總甾醇。在2.5mg/kg的濃度下, 總甾醇、馬尾藻甾醇和巖藻甾醇對羥基自由基的清除率分別為85.8%, 65.6%和45.3%。

圖3 總甾醇、馬尾藻甾醇和巖藻甾醇對超氧化物基團(tuán)(a)和羥基自由基(b)的清除作用Fig.3 Scavenging effects of total sterols, saringosterol and fucosterol on superoxide radicals (a) and hydroxyl radicals (b)

3 結(jié)論

總甾醇、馬尾藻甾醇和巖藻甾醇對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌均具有抑菌活性。馬尾藻甾醇和巖藻甾醇MIC為4—32mg/mL對于金黃色葡萄球菌和變異鏈球菌具有高活性。而總甾醇對革蘭氏陰性菌株大腸桿菌(1924和1356)顯示出抗菌作用。但是, 馬尾藻甾醇和巖藻甾醇在4-32mg/mL體外對革蘭氏陰性菌株沒有表現(xiàn)出抗菌作用。馬尾藻甾醇和巖藻甾醇對多重耐藥性革蘭氏陽性細(xì)菌的臨床分離物具有高度活性。另外, DPPH自由基、ABTS自由基、超氧化物自由基和羥基自由基測定中的所有數(shù)據(jù)表明, 總甾醇、馬尾藻甾醇和巖藻固醇的抗氧化活性與它們清除DPPH自由基、ABTS自由基、超氧自由基和羥基的能力有關(guān)。

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