張志剛 王開梅 吳兆圓

摘要：以水瓊脂表面涂布法對早熟禾（Poa annua L.）和狗芽根[Cynodon dactylon （L.） Pers.]進行篩選敏感度和抗真菌能力的比較。測試了狗芽根種子在溫度、培養(yǎng)基量、生長時期3種不同條件下對標準化合物的敏感度。結(jié)果表明，狗芽根比早熟禾對除草劑標準化合物更敏感，且有更強的抗真菌污染能力。狗芽根種子在25 ℃的條件下，對除草劑標準化合物的敏感度最高；減少水瓊脂用量，即提高樣品的終濃度，等同于提高狗芽根篩選的敏感度；狗芽根種子培養(yǎng)48 h后，對標準化合物敏感度最高。對1 880個微生物源提取物進行篩選，表明狗芽根作為單子葉雜草，用于先導化合物篩選具有穩(wěn)定、高效、敏感度高等突出優(yōu)點；狗芽根是目前單子葉除草劑先導化合物篩選的首選靶標。

關(guān)鍵詞：早熟禾（Poa annua L.）；狗芽根[Cynodon dactylon （L.） Pers.]；先導化合物；除草活性；單子葉植物

中圖分類號：S482.4 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2018）20-0089-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.20.020 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： The screening sensitivity and antifungal contamination ability of Poa pratensis and Cynodon dactylon under artificial conditions were compared. C. dactylon had been assayed for their responses to 2 herbicide compounds under different temperature，amount of agar-solution and growth period. The results showed that C. dactylon was more sensitive to herbicide standard compounds and also stronger in antifungal ability than P. pratensis. C. dactylon showed the highest sensitivity at 25 ℃. C. dactylon showed the most sensitive to standard compound after 48 h incubation，reducing the amount of agar-solution could improve the final concentration of the compounds，it was equivalent to increasing the sensitivity of the C. dactylon screening. The screening of 1 880 real extracts showed that C. dactylon was stable，high efficiency，and high sensitivity target of monocotyledon weed for the screening. C. dactylon was one of the top choices of monocotyledon for screening of herbicide lead compounds.

Key words： Poa pratensis L.； Cynodon dactylon （L.） Pers.； lead compound； herbicidal activity； monocotyledon

適用于除草劑先導化合物篩選的單子葉雜草較少，早熟禾通常作為單子葉除草劑活性評價的靶標，但用于先導化合物的篩選卻存在春化時間長、發(fā)芽時間長及易受真菌污染等不足之處。先導化合物的篩選與除草劑農(nóng)藥活性生物測定在樣品性質(zhì)、靶標設定方面有很大差別。除草劑先導化合物篩選要求篩選通量大，目標化合物通常是低含量、低活性的先導化合物。用于初篩的樣品通常為成分復雜的粗提物，是引起真菌污染的良好營養(yǎng)源，所以除草劑先導化合物篩選的關(guān)鍵不僅要提高檢測敏感度和增加篩選通量，同時供試靶標的抗污染能力也很重要。狗芽根[Cynodon dactylon （L.） Pers.]是常用草坪植物，資源充足，品種純凈。使用狗芽根替代早熟禾進行除草劑先導化合物篩選，不僅提高了篩選的敏感度，減少了真菌污染，且突破了使用早熟禾種子在種子資源少、品質(zhì)差異大以及不能脫殼而易受真菌污染等不利因素的限制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 雜草種子 狗芽根和早熟禾（Poa pratensis L.）種子均為市售，保存在具透氣塞的玻璃燒瓶中，溫度為8 ℃。狗芽根種子已脫殼，早熟禾種子未脫殼。

1.1.2 主要儀器 蠕動泵、96通道半自動移液機（型號INTEGR，VIAFLO 96）、96孔組織培養(yǎng)板（深孔）、日光燈管組（0.4 m距離光強為7 000～8 000 lx）、人工氣候箱（光、溫可調(diào)）、無菌操作臺。

1.1.3 試劑及標準化合物 瓊脂粉由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司生產(chǎn)，型號DH010-4；75%乙醇、2%次氯酸鈉溶液；乙醇、吐溫-80試劑，均為市售分析純化學試劑；除草劑標準化合物草伏（Norflurazon 95%）、硝磺草酮（Mesotrione 98%）；放線菌和真菌發(fā)酵提取物，由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心先導化合物研究室提供。

1.2 方法

1.2.1 早熟禾、狗芽根種子除菌處理及篩選用培養(yǎng)板制備 早熟禾、脫殼狗芽根種子經(jīng)除菌處理后以無菌水反復振蕩、浸洗5次以上，移除積水，種子攤開置于無菌操作臺中吹干，備用。把經(jīng)過高壓滅菌后的水瓊脂加入96孔組織培養(yǎng)板（深孔）[1，2]，每孔水瓊脂加入量根據(jù)試驗需要進行定量，冷卻后備用。把早熟禾、狗芽根種子分別轉(zhuǎn)接到瓊脂表面，接入種子量以單層種子全部覆蓋水瓊脂表面為準。

1.2.2 篩選用樣品溶液 以含0.1%吐溫-80無菌水作為溶劑進行制備。

1.2.3 早熟禾、狗芽根在水瓊脂培養(yǎng)基表面的抗真菌污染能力試驗 按“1.2.1”的方法接入早熟禾、狗芽根種子，分別分成4組進行試驗：未除菌種子、除菌種子、除菌種子加溶劑對照、除菌種子加培養(yǎng)基對照。把無菌水制備10%的乙醇溶液作為對照溶劑，把空白培養(yǎng)基提取獲得的提取物配制成1 mL溶液，作為空白培養(yǎng)基對照。溶劑對照和空白培養(yǎng)基對照表面涂布量為0.02 mL/孔，移液后置于無菌操作臺中，靜置4 h后移入人工氣候箱中培養(yǎng)。第3天開始以目測法確定各培養(yǎng)孔中是否有真菌污染，統(tǒng)計各培養(yǎng)板中被真菌污染的孔數(shù)。每個試驗組分別使用兩塊培養(yǎng)板，持續(xù)記錄到第4天，統(tǒng)計真菌浸染率。重復試驗3次。培養(yǎng)條件為：溫度25 ℃，相對濕度70%～80%，每天光照9 h，光照強度8 000 lx。

1.2.4 早熟禾、狗芽根對除草劑標準化合物的敏感度試驗

1）活性評價指標。根據(jù)活性反應的不同，使用分級指標數(shù)（0、3、5、7、9）標記除草活性[3]。

2）早熟禾、狗芽根對除草劑標準化合物的敏感度試驗[4]。把標準化合物配制成母液，濃度為1.00 mg/mL，以含0.1%TW-80的無菌水稀釋成12個不同的濃度梯度。各組織培養(yǎng)板中瓊脂加入量為1 mL/孔，按“1.2.1”方法接入狗芽根和早熟禾種子。每個濃度設2個復孔，重復試驗3次。培養(yǎng)條件同“1.2.3”。5 d后檢查并記錄結(jié)果，計算IC50。

1.2.5 進一步提高狗芽根對除草劑標準化合物的敏感度試驗

1）不同的培養(yǎng)溫度對狗芽根的篩選敏感度比較試驗。把硝磺草酮配制成母液，濃度為1.00 mg/mL，以含0.1%TW-80的無菌水稀釋成12個不同的濃度梯度（下同）。表面涂布樣品溶液量為0.02 mL/孔，按“1.2.1”方法接入狗芽根種子。每個濃度設2個復孔，重復試驗3次。培養(yǎng)條件為：溫度20、25、28、31 ℃，相對濕度70%～80%，每天光照9 h，光照強度8 000 lx。5 d后檢查并記錄結(jié)果，計算IC50，同時統(tǒng)計對照溶劑種子的發(fā)芽率。

2）不同的水瓊脂加入量對狗芽根的篩選敏感度比較試驗。把兩個標準化合物分別配制成母液，濃度梯度與上述相同。不同組織培養(yǎng)板中水瓊脂加入量不同，分別為1.0、0.5、0.3 mL/孔。表面涂布樣品溶液量為0.02 mL/孔，按“1.2.1”的方法接入狗芽根種子。每個濃度設2個復孔，重復試驗3次。培養(yǎng)條件同“1.2.3”。5 d后檢查并記錄結(jié)果，計算IC50。

3）狗芽根種子預先培養(yǎng)不同時間后加入標準化合物，對狗芽根的篩選敏感度比較試驗[5]。把硝磺草酮（98%）配制成母液，濃度梯度與上述相同。不同組織培養(yǎng)板中水瓊脂加入量為1.2 mL/孔，按“1.2.1”的方法接入狗芽根種子，移入培養(yǎng)室中，分別培養(yǎng)0、1、2、3、4 d后加入標準化合物溶液。表面涂布樣品溶液量為0.02 mL/孔。每個濃度設2個復孔，重復試驗3次。培養(yǎng)條件同“1.2.3”。各組試驗分別在加樣5 d后檢查并記錄結(jié)果，計算IC50。

1.2.6 微生物源提取物篩選試驗 隨機選擇1 880個放線菌、真菌發(fā)酵提取物樣品，首先分4批用狗芽根進行初篩。篩選出來的活性樣品再同時用狗芽根和早熟禾進行復篩。比較狗芽根及早熟禾對活性樣品的重現(xiàn)性。放線菌、真菌發(fā)酵提取樣品先用0.1 mL乙醇（在母液中溶劑濃度為10%）溶解，加入0.9 mL含0.1%TW-80的無菌水稀釋成母液。初篩剩余樣品放入4 ℃冰箱室保存?zhèn)溆?。初篩、復篩樣品加入量均為0.02 mL/孔。以0.1% TW-80和10%乙醇無菌水作為空白對照。按“1.2.1”方法接入狗芽根或早熟禾種子。每個樣品設2個復孔。培養(yǎng)條件同“1.2.3”。5 d后檢查并記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 早熟禾、狗芽根在水瓊脂培養(yǎng)基表面的抗真菌污染率

未經(jīng)除菌處理的早熟禾和狗芽根種子在自然條件下都能正常萌發(fā)，通常不受真菌污染的影響。但在以水瓊脂為培養(yǎng)載體的室內(nèi)篩選中，真菌污染非常嚴重，當真菌污染率大于15%時，種子萌發(fā)和幼芽的正常生長都會受到抑制，導致試驗呈假陽性。結(jié)果（表1）顯示，常規(guī)的除菌處理，對早熟禾種子抗真菌污染的作用有限，培養(yǎng)第5天時真菌已經(jīng)抑制了正常幼苗的生長，空白培養(yǎng)基的加入加劇了真菌的污染；經(jīng)過常規(guī)的除菌處理后，狗芽根種子在培養(yǎng)第7天，真菌污染率仍小于15%，對幼苗生長無影響，但空白培養(yǎng)基的加入也會加劇培養(yǎng)板內(nèi)真菌污染。

2.2 早熟禾、狗芽根對除草劑標準化合物的敏感度

由表2可知，狗芽根對兩種標準化合物的IC50均小于早熟禾。為了計算方便，本試驗中沒有采用培養(yǎng)基中的終濃度，而是采用表面涂布的母液濃度，每孔涂布樣品溶液量為20 μL。

2.3 進一步提高狗芽根篩選敏感度的方法

2.3.1 不同培養(yǎng)溫度對狗芽根篩選敏感度的影響

狗芽根為暖季型雜草，高溫有利于種子萌發(fā)、植株生長，對除草劑的抗性也增強。結(jié)果（表3）顯示，隨著溫度升高，狗芽根對除草劑敏感度降低，同時種子發(fā)芽率也升高。綜合比較溫度對種子的敏感度和發(fā)芽率的影響，選擇25 ℃作為篩選標準溫度。

2.3.2 不同水瓊脂加入量對狗芽根篩選敏感度的影響 結(jié)果（表4）顯示，瓊脂加入量由1 mL降低到0.4 mL后，狗芽根對草伏和硝磺草酮的IC50平均值分別下降了43.54%和55.43%。

2.3.3 狗芽根種子預先培養(yǎng)不同時間后加入標準化合物對篩選敏感度的影響 各培養(yǎng)板需要培養(yǎng)5～11 d，為保障水瓊脂在長時間培養(yǎng)中持續(xù)為狗芽根提供足夠水分，各組培養(yǎng)板中加入水瓊脂的量均增加到1.2 mL。預先培養(yǎng)0～4 d后加入標準化合物，各組對應IC50依次為（225.00±43.30） μg/mL、（129.00±6.93） μg/mL、（113.33±20.21） μg/mL、（208.33±72.19） μg/mL、500 μg/mL。結(jié)果（圖1）顯示，種子加入培養(yǎng)板，預先培養(yǎng)1～2 d后加入標準化合物溶液的IC50比其他時間加入樣品的IC50明顯降低。綜合培養(yǎng)中真菌污染程度與培養(yǎng)時間的關(guān)系，在實際篩選中選擇接種后繼續(xù)培養(yǎng)1 d后加入待測樣品。

2.4 微生物源提取物篩選

隨機選擇了1 880個放線菌、真菌提取物樣品，用狗芽根進行初篩。然后用檢出的活性樣品對狗芽根和早熟禾進行復篩。1 880個樣品用狗芽根進行初篩后，檢出活性樣品31個；對初篩獲得的31個活性樣品進行復篩，以狗芽根進行的復篩有30個樣品能重現(xiàn)活性，以早熟禾進行的復篩中有7個樣品能重現(xiàn)活性。這一結(jié)果與狗芽根和早熟禾對標準化合物的敏感度差異一致。

3 討論

微生物源除草劑先導化合物篩選的主要障礙有兩個。其一是真菌污染。在無菌的水瓊脂培養(yǎng)基上，真菌污染種子的速度極快，被污染的種子發(fā)芽及植株生長會受到抑制，引起假陽性結(jié)果。早熟禾種子不能脫殼，其穎殼不僅降低除菌效果，而且穎殼還是真菌生長的良好培養(yǎng)基。過度除菌處理會降低種子發(fā)芽率，也會引起假陽性結(jié)果；二是種子的敏感度直接影響活性樣品的檢出率。以硝磺草酮為例，當樣品中硝磺草酮含量達到50 μg/mL左右時，在以狗芽根為靶標的篩選體系中能被發(fā)現(xiàn)。而在早熟禾為靶標的篩選體系中，只有當樣品中硝磺草酮含量達到200 μg/mL左右時，才可能被檢出。本研究雖然通過幾種方法提高了單子葉雜草靶標的篩選敏感度，但與雙子葉雜草的篩選靶標擬南芥（硝磺草酮含量0.05 μg/mL左右即可檢出）相比，還存在極大的差距[4]。從目前進行的不同雜草種子敏感度篩選試驗可以發(fā)現(xiàn)，種子越小，其篩選敏感度越高[6]。能夠發(fā)現(xiàn)一個適用于除草劑先導化合物篩選的敏感單子葉雜草靶標，同時能產(chǎn)出足量的種子供高通量篩選，目前仍然是較大的挑戰(zhàn)。

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