孟艷霞，鄧立普

（南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院 內(nèi)科，湖南 衡陽 421002）

硫化氫對糖尿病大鼠心肌纖維化及基質(zhì)金屬蛋白酶7和縫隙連接蛋白43表達的影響

孟艷霞，鄧立普

（南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院 內(nèi)科，湖南 衡陽 421002）

目的探討硫化氫（H2S）對糖尿病大鼠心肌纖維化及基質(zhì)金屬蛋白酶7（MMP-7）和縫隙連接蛋白43（Cx43)表達的影響。方法將52只SD大鼠隨機分為4組，每組13只：糖尿病模型組（STZ組），硫化氫干預(yù)模型組（STZ+H2S組），硫化氫干預(yù)正常組（H2S組），正常對照組（Control組）。予以鏈脲佐菌素（STZ）（40 mg/kg）處理STZ組和STZ+H2S，復(fù)制糖尿病大鼠模型，復(fù)制成功后，每天予以硫氫化鈉NaHS溶液（100μmol/kg）處理STZ+H2S組與H2S組，予以等量生理鹽水對Control組行腹腔注射，8周后將大鼠處死。VG染色觀察4組大鼠心肌組織病理學(xué)改變，Western blot檢測IV型膠原蛋白、MMP-7、Cx43蛋白的表達。結(jié)果STZ組與Control組相比，STZ大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂明顯，細(xì)胞間膠原沉積增加，心室肌組織中Ⅳ型膠原蛋白及MMP-7蛋白表達增加（P＜0.05），而Cx43蛋白表達降低（P＜0.05）；STZ+H2S組與STZ組相比，STZ+H2S組心肌細(xì)胞排列紊亂有所改善，細(xì)胞間膠原沉積減少，心室肌組織中Ⅳ型膠原蛋白及MMP-7蛋白表達也減少（P＜0.05），Cx43蛋白表達上調(diào)（P＜0.05）。結(jié)論H2S可改善糖尿病大鼠心肌纖維化，其機制可能與通過調(diào)控MMP-7上調(diào)Cx43蛋白表達有關(guān)。

硫化氫；糖尿??；纖維化；基質(zhì)金屬蛋白酶7；縫隙連接蛋白43

糖尿病是一組以慢性高血糖為特征的代謝性疾病，2013年全球糖尿病患者達3.82億[1]。近年來，糖尿病患病率在我國逐漸增加，成人糖尿病患病率目前高達9.7%[2]，我國成為全球糖尿病患病率增長速度最快的國家之一[3]。糖尿病可增加急性心血管事件和心源性猝死的發(fā)生率，其原因可能與糖尿病患者心室肌的縫隙連接重構(gòu)和離子通道重構(gòu)相關(guān)。

糖尿病引起的血管損害和代謝異?？蓪?dǎo)致心肌電生理重構(gòu)進而引起心肌纖維化和心肌重構(gòu)[4-5]。細(xì)胞縫隙連接廣泛存在于細(xì)胞間，是心肌細(xì)胞間電連接形式，具有維持心肌電生理活動的重要作用，縫隙連接蛋白43（Connexin 43，Cx43）是構(gòu)成心室細(xì)胞縫隙連接的主要蛋白，是心臟正常電活動的關(guān)鍵蛋白?；|(zhì)金屬蛋白酶 7（matrix metalloproteinase，MMP-7）主要表達于心肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，屬于基質(zhì)溶解因子。MMP-7可降解細(xì)胞外基質(zhì)中的Ⅳ膠原蛋白、層黏連蛋白、纖黏連蛋白等參與組織重建，同時可能具有降解Cx43的作用。

硫化氫H2S具有改善心室重構(gòu)、抗炎和抑制氧化應(yīng)激等作用[5]。而H2S對糖尿病大鼠心肌重構(gòu)和心室Cx43蛋白的調(diào)控作用以及相關(guān)機制尚少見研究。本研究擬通過復(fù)制糖尿病大鼠模型，觀察H2S通過調(diào)控MMP-7改善糖尿病大鼠心肌纖維化及上調(diào)心肌組織Cx43蛋白表達的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康成年清潔級雄性SD大鼠52只[購自南華大學(xué)動物實驗中心；動物合格證號：SYXK（湘）2010-0006]，體重（300±20）g。動物實驗在南華大學(xué)動物實驗中心完成，實驗室環(huán)境溫度12～24℃。分籠飼養(yǎng)，人工照明，白天黑夜各12 h；所有大鼠均可自由獲得水和食物。

1.2 主要實驗試劑

兔 源MMP-7、Cx43和CollagenIV的 一 抗 和GAPDH一抗購于中國博士德公司，硫氫化鈉NaHS購于美國Sigma公司，抗兔二抗購于美國Proteintech公司，BCA蛋白定量試劑盒、細(xì)胞裂解液購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 實驗分組及糖尿病模型復(fù)制

SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為對照組（Control組）、糖尿病模型組（STZ組）、H2S干預(yù)模型組（STZ+H2S組）、H2S干預(yù)正常組（H2S組）。STZ+H2S組與STZ組大鼠按體重腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）（40 mg/kg）；予以鏈脲佐菌素注射后的24 h內(nèi)給予5%葡萄糖水防止大鼠發(fā)生低血糖休克；予以鏈脲佐菌素注射72 h后，尾靜脈采血測血糖，血糖值＞16.7 mmol/L提示復(fù)制模型成功。而后，每天予以硫氫化鈉NaHS溶液（100μmol/kg）對H2S組和STZ+H2S組大鼠進行腹腔注射；予以等量生理鹽水對Control組和STZ組行腹腔注射，持續(xù)8周。Control組、STZ組、STZ+H2S組和H2S組復(fù)制模型成功的實驗大鼠分別為：12、9、9和10只。

1.4 VG染色光鏡下觀察大鼠左心室心肌組織病理學(xué)形態(tài)

取4組大鼠左心室心肌組織，做成切片后，行VG（van gieson）染色，光鏡下觀察大鼠心肌結(jié)構(gòu)及纖維化程度。

1.5 Western blot檢測左心室心肌組織Ⅳ膠原蛋白、MMP-7、Cx43蛋白表達

取4組大鼠左心室心肌組織，提取蛋白并定量。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。用TBST配制的5%脫脂牛奶封閉1.5 h，CollagenⅣ、MMP-7、Cx43（稀釋度均為1∶400）以及（GAPDH）（稀釋度為1∶8 000）一抗37℃孵育1 h后于4℃條件下過夜，TBST緩沖液充分洗膜后用HRP標(biāo)記的二抗（稀釋度為1∶8 000）37℃孵育1 h，ECL顯色，曝光后掃描，用Image J圖像分析軟件進行光密度分析。以目的條帶與GAPDH的灰度比值分別表示Ⅳ膠原蛋白、MMP-7和Cx43的蛋白表達水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。均數(shù)間的比較采用方差分析，有統(tǒng)計學(xué)意義后，兩組間均數(shù)比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心肌組織VG染色結(jié)果

與Control組比較，STZ組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞間明顯膠原沉積；與STZ組比較，STZ+H2S組大鼠心肌排列紊亂有所改善，細(xì)胞間膠原沉積明顯減少。H2S組與Control組比較表現(xiàn)相似。見圖1。

圖1 4組大鼠心肌組織VG染色結(jié)果 （×400）

2.2 H2S對IV型膠原蛋白表達的影響

與Control組Ⅳ膠原蛋白表達水平（0.568±0.027）比較，STZ組大鼠心室肌組織的Ⅳ型膠原蛋白表達水平（0.716±0.026）升高（P＜0.05）；與STZ組比較，STZ+H2S組大鼠心室肌組織的Ⅳ型膠原蛋白表達水平（0.644±0.010）降低（P＜0.05）；H2S組心室肌組織Ⅳ型膠原蛋白表達水平（0.589±0.019）與Control組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2。

2.3 H2S對MMP-7和Cx43蛋白表達的影響

與Control組MMP-7蛋白表達水平（0.568±0.027）相比，STZ組大鼠心室肌組織的MMP-7蛋白表達水平（0.752±0.010）升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與Control組Cx43蛋白表達水平（0.691±0.019）相比，STZ組大鼠心室肌組織的Cx43蛋白表達水平（0.284±0.021）下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

與STZ組MMP-7蛋白表達水平（0.752±0.010）相比，STZ+H2S組大鼠心室肌組織MMP-7蛋白表達水平（0.644±0.010）下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與STZ組Cx43蛋白表達水平（0.284±0.021）相比，STZ+H2S組大鼠心室肌組織Cx43蛋白表達水平（0.772±0.025）升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

H2S組MMP-7、Cx43蛋白表達水平分別為（0.589±0.019）和（0.681±0.023），與 Control組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3。

圖3 H2S對MMP7和Cx43蛋白表達的影響

3 討論

糖尿病可引起一系列心肌損害導(dǎo)致糖尿病心肌病[6]。糖尿病與急性心血管事件和心源性猝死有密切關(guān)系，其原因與糖尿病導(dǎo)致的心肌病變相關(guān)，機制可能與心室肌的電生理重構(gòu)有關(guān)，但具體機制目前仍不清楚?？p隙連接蛋白Cx43表達于心室肌相鄰細(xì)胞的連接處及閏盤部位，其正常表達是心臟電-機械功能及心臟生理功能的保障[7-9]。大量研究發(fā)現(xiàn)心室肌Cx43表達下調(diào)和分布紊亂可導(dǎo)致心肌復(fù)極化的不一致性，從而導(dǎo)致惡性心律失常的發(fā)生[10-13]。

糖尿病心肌組織中同時存在MMPs的失調(diào)，并與心肌纖維化和心肌重構(gòu)有關(guān)，MMP-7屬于基質(zhì)溶解因子，在心肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞均可表達。魏英杰等[14]學(xué)者在缺血性心肌標(biāo)本中檢測了17種MMPs，發(fā)現(xiàn)只有MMP-7、MMP10在心肌組織中明顯升高。BOIXEL等[15]發(fā)現(xiàn)MMP-7參與了心房組織的早期重構(gòu)，與正常大鼠相比，急性心肌梗死后的大鼠心肌組織MMP-7表達明顯增加。MMP-7可通過降解細(xì)胞外基質(zhì)參與心肌重構(gòu)，同時研究發(fā)現(xiàn)MMP-7參與Cx43重構(gòu)的調(diào)控。當(dāng)注入MMP-7后正常小鼠也可發(fā)生心律失常，在MMP-7基因敲除的小鼠中則未見心電傳導(dǎo)異常；與野生型小鼠相比，沉默MMP-7基因表達的小鼠，其心肌梗死的心肌組織Cx43表達增加近1倍，同時作者在體外實驗也證實了Cx43正是MMP-7的酶解底物[16]。本研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠心室肌存在明顯心肌纖維化，IV型膠原蛋白表達增加，心室肌組織Cx43蛋白表達下調(diào)，而組織中MMP-7蛋白表達上調(diào)，提示糖尿病大鼠心室肌MMP-7的上調(diào)可直接促進心肌細(xì)胞Cx43降解，進而導(dǎo)致糖尿病大鼠心肌的電生理重構(gòu)和心律失常的發(fā)生。

本研究結(jié)果提示，H2S可通過抑制心肌組織MMP-7的表達上調(diào)心肌組織Cx43蛋白的表達，這一作用可能與其改善糖尿病大鼠心肌纖維化相關(guān)。更改作用機制可能為臨床防治糖尿病心肌病的發(fā)生、發(fā)展提供新的靶點。但H2S通過調(diào)控MMP-7上調(diào)心室肌組織Cx43蛋白表達的具體調(diào)控機制尚不清楚，其與H2S改善糖尿病大鼠心肌纖維化這一作用的內(nèi)在關(guān)系也需要進一步研究。

[1]GUARIGUATA L, LINNENKAMP U, BEAGLEY J, et al. Global estimates of the prevalence of hyperglycaemia in pregnancy[J].Diabetes Res & Clin Pract, 2014, 103(2): 176-185.

[2]張萍, 潘天榮, 鐘興, 等. 利拉魯肽聯(lián)合胰島素治療新診斷肥胖2型糖尿病的臨床療效及安全性觀察[J]. 中國糖尿病雜志,2014, 22(11): 974-977.

[3]XU Y, WANG L, HE J, et al. Prevalence and control of diabetes in Chinese adults[J]. JAMA, 2013, 310(9): 948-959.

[4]MAK K H, MOLITERNO D J, GRANGER C B, et al. In fl uence of diabetes mellitus on clinical outcome in the thrombolytic era of acute myocardial infarction. GUSTO-I Investigators. Global utilization of streptokinase and tissue plasminogen activator for occluded coronary arteries[J]. J Am Coll Cardiol, 1997, 30(1): 171-179.

[5]孫明謹(jǐn), 文重遠(yuǎn), 黃婷, 等. 糖尿病大鼠心肌Cx43的表達及纈沙坦對其影響[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志, 2009, 19(15): 2294-2297.

[6]STABLES C L, MUSA H, MITRA A, et a1. Reduced Na+current density underlies impaired propagation propagation in the diabetic rabbit ventricle[J]. J Mol Cell Cardiol, 2014(69): 24-31.

[7]SOVARI A A, RUTLEDGE C A, JEONG E M, et al. Mitochondria oxidative stress, connexin43 remodeling, and sudden arrhythmic death[J]. Circ Arrhythm Electrophysiol, 2013, 6(3): 623-631.

[8]SOVARI A A, IRAVANIAN S, DOLMATOVA E, et al. Inhibition of c-Src tyrosine kinase prevents angiotensin II-mediated connexin43 remodeling and sudden cardiac death[J]. J Am Coll Cardiol, 2011,58(22): 2332-2339.

[9]張旭敏, 范慧敏, 劉中民, 等. MYo Cx43基因轉(zhuǎn)染大鼠成纖維細(xì)胞產(chǎn)生電偶聯(lián)能力細(xì)胞實驗研究[J]. 中國急救醫(yī)學(xué), 2008,28(3): 235-238.

[10]袁勇華, 何學(xué)華, 方亦兵, 等. 縫隙連接蛋白43在擴張型心肌病大鼠心肌中的表達及其與左室射血分?jǐn)?shù)的相關(guān)性[J]. 臨床兒科雜志, 2014, 32(1): 66-69.

[11]WIEGERINCK R F, VAN VEEN T A, BLTERMAN C N, et al.Trans-mural dispersion of refractoriness and conduction velocity is associated with heterogeneously reduced connexin43 in a rabbit model of heart failure[J]. Heart Rhythm, 2008, 5(8): 1178-1185.

[12]HESKETH G G, SHAH M H, HALPERIN V L, et al. Ultra structure and regulation of lateralized connexin43 in the failing heart[J]. Circ Res, 2010, 106(6): 1153-1163.

[13]GLUKHOV A V, FEDOROV V V, LOU Q, et al. Transmural dispersion of repolarization in failing and nonfailing human ventricle[J]. Circ Res, 2010, 106(5): 981-991.

[14]魏英杰, 胡盛濤, 麗君, 等. MMP7、MMP10和TIMP4在心力衰竭心室重構(gòu)中的表達[J]. 中國病理生理雜志, 2009, 25(3):440-446.

[15]BOIXEL C, FONTAINE V, RüCKER-MARTIN C, et al. Fibrosis ofthe left atria during progression of heart failure is associated with increased matrix metalloproteinases in the rat[J]. J Am Coll Cardiol, 2003, 42(2): 336-344.

[16]LINDSEY M L, ESCOBAR G P, MUKHERJEE R, et al.Matrix metalloproteinase7 affects connexin43 levels, electrical conduction, and survival after myocardial infarction[J].Circulation, 2006, 113(25): 2919-2928.

Effect of hydrogen sul fi de on myocardial fi brosis and MMP7 and connexin 43 expressions in diabetic rats

Yan-xia Meng, Li-pu Deng
(Department of Medicine, the Aff i liated Nanhua Hospital, South China University,Hengyang 421002, Hunan, China)

ObjectiveTo investigate the effect of hydrogen sul fi de on myocardial fi brosis and the expressions of connexin 43 (Cx43) and MMP7 in diabetic rats.MethodsFifty-two rats were randomly divided into four groups(13 in each): diabetes mellitus group (STZ group), diabetes mellitus treated with H2S group (STZ+H2S group), normal rats treated with H2S group (H2S group) and control group. The STZ group and the STZ+H2S group were treated with Streptozotocin according to the standard of 40 mg/kg to make diabetes model. After the modeling, NaHS (the provider of H2S, 100 μmol/kg) was administered to the rats of the STZ+H2S group and the H2S group every day; the rats in the control group were injected with equal amount of saline into peritoneal cavity. After 8 weeks, the pathological changes of myocardium in the four groups were observed by VG staining. The expression levels of collagen IV,MMP7 and Cx43 were analyzed by Western blot.ResultsCompared with the control group, the expression levels of collagen IV and MMP7 in the myocardial tissue were signi fi cantly increased (P＜ 0.05), while the expression level of Cx43 protein was signi fi cantly decreased in the STZ group (P＜ 0.05), accompanied by disorder of myocardial cells. Compared with the STZ group, the expression levels of collagen IV and MMP7 protein in the myocardial tissue were signi fi cantly decreased in the STZ+H2S group (P＜ 0.05), while the expression level of Cx43 was signi fi cantly increased (P＜ 0.05) and the disorder of myocardial cells was improved.ConclusionsHydrogen sul fi de could reduce myocardial fi brosis in diabetic rats, which may be related to the upregulation of connexin 43 expression by MMP7.

hydrogen sul fi de; diabetes; fi brosis; matrix metalloproteinase 7; connexin 43

10.3969/j.issn.1005-8982.2018.01.005

1005-8982（2018）01-0021-04

2017-01-23

鄧立普，E-mail：1456608926@qq.com；Tel：18907345315

R-332；R587.1

A

（張西倩 編輯）