李秧秧，陳涵斌，徐菲菲，萬(wàn)麗，陳國(guó)榮，陳壘，陳三妹，王蓉蓉

（1．溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 病理科，浙江 溫州 325015；2．溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 放化療科，浙江 溫州 325015；3．溫州醫(yī)科大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325035；4．紹興文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院護(hù)理系，浙江 紹興 312000）

棉酚對(duì)糖尿病大鼠非酒精性脂肪性肝病纖維化的影響

李秧秧1，陳涵斌2，徐菲菲1，萬(wàn)麗1，陳國(guó)榮1，陳壘3，陳三妹4，王蓉蓉1

（1．溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 病理科，浙江 溫州 325015；2．溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 放化療科，浙江 溫州 325015；3．溫州醫(yī)科大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325035；4．紹興文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院護(hù)理系，浙江 紹興 312000）

目的：研究棉酚對(duì)糖尿病大鼠非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）纖維化的影響及其可能機(jī)制。方法：雄性SD大鼠30只，隨機(jī)均分成3組：正常對(duì)照（NC）組、2型糖尿?。═2DM）組、棉酚治療（T2DMG）組。采用高脂飲食及低劑量鏈脲佐菌素（STZ）構(gòu)建糖尿病大鼠模型，T2DMG組模型構(gòu)建后用棉酚灌胃（15 mg·kg-1·d-1灌胃4周，再按每周15 mg·kg-1灌胃8周）。光鏡及電鏡下觀察肝組織形態(tài)學(xué)改變；Masson染色觀察肝組織纖維化病變；免疫組織化學(xué)檢測(cè)肝組織α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、11β-羥類固醇脫氫酶1（11β-HSD1）、糖皮質(zhì)激素受體（GR）、核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGFβ1）蛋白的表達(dá)；RT-PCR法檢測(cè)肝組織11β-HSD1、GR、NF-κB及TGFβ1 mRNA表達(dá)。結(jié)果：與NC組比較，T2DM組肝組織明顯纖維化，α-SMA、11β-HSD1、GR、NF-κB、TGFβ1蛋白表達(dá)明顯增多（P=0.001、0.004、0.001、0.001、0.002），GR、TGFβ1 mRNA表達(dá)明顯增加（P=0.01、0.001）；與T2DM組比較，T2DMG組肝纖維化病變明顯減輕，肝組織α-SMA、11β-HSD1、GR、NF-κB、TGFβ1蛋白表達(dá)明顯減少（P=0.009、0.031、0.002、0.009、0.027），11β-HSD1、GR、TGFβ1 mRNA表達(dá)明顯減少（P=0.003、0.038、0.014）。結(jié)論：棉酚可以有效改善NAFLD相關(guān)肝纖維化病變，其機(jī)制可能是抑制肝臟11β-HSD1、GR、NF-κB、TGFβ1的表達(dá)。

肝纖維化；糖尿??；棉酚；11β-羥類固醇脫氫酶1；糖皮質(zhì)激素受體；核轉(zhuǎn)錄因子-κB；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1

非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是常見(jiàn)的糖尿病并發(fā)癥。在NAFLD的發(fā)病過(guò)程中，高糖致線粒體內(nèi)超氧陰離子（O2-）產(chǎn)生過(guò)多，組織細(xì)胞內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激，使肝星形細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）激活，促進(jìn)肝臟纖維化損傷。炎癥反應(yīng)啟動(dòng)及調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor-β1，TGFβ1）可相互協(xié)同，在NAFLD肝纖維化過(guò)程中起重要作用。棉酚（gossy-pol）是一種黃色多酚羥基雙萘醛類化合物，是錦葵科植物草棉、樹(shù)棉或陸地棉成熟種子、根皮中提取的一種多元酚類物質(zhì)，為11β-羥類固醇脫氫酶1（11β-hydroxysteroid dehydrogenase 1，11β-HSD1）抑制劑，可顯著抑制大鼠、豚鼠以及人的11β-HSD1[1]，有效改變脂質(zhì)過(guò)氧化代謝動(dòng)力學(xué)[2]及拮抗肺纖維化[3]。本課題組前期研究證實(shí)棉酚可有效減輕胰島素抵抗，降低糖尿病大鼠的血糖、血脂水平[4]。本研究通過(guò)觀察棉酚對(duì)2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）大鼠NAFLD肝纖維化及11β-HSD1、糖皮質(zhì)激素受體（glucocorticoid receptor，GR）、NF-κB、TGFβ1表達(dá)的影響，為糖尿病相關(guān)肝臟纖維化損傷的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 模型復(fù)制與處理 雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量140～180 g，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（浙）2015-0004。隨機(jī)均分成3組：正常對(duì)照（NC）組、2型糖尿病（T2DM）組、棉酚治療（T2DMG）組。后2組通過(guò)高脂飲食建立T2DM大鼠模型，按文獻(xiàn)[5]進(jìn)行。NC組腹腔注射等容積0.1 mmol/L枸櫞酸緩沖液。T2DMG組按15 mg·kg-1·d-1劑量棉酚灌胃4周，后以每周15 mg·kg-1劑量繼續(xù)棉酚灌胃8周（棉酚+2%羧甲基纖維素，棉酚由美國(guó)洛克菲勒大學(xué)葛仁山教授惠贈(zèng)）。T2DM組、NC組給予等容積的2%羧甲基纖維素灌胃，次數(shù)及時(shí)間同T2DMG組。實(shí)驗(yàn)期間T2DM組與T2DMG組持續(xù)供給高脂飲食，NC組供給普通飲食，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死大鼠。

1.2 HE染色及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[6]取新鮮肝組織1塊（約10 mm×10 mm×2 mm），4%甲醛固定，脫水，透明，浸蠟及石蠟包埋，切片（厚度3 μm），HE染色及封固。NAFLD病變程度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：①脂肪變性程度：隨機(jī)選10個(gè)低倍視野（×100），0分為無(wú)脂肪變性，1分為脂肪變性范圍＜33%，2分為脂肪變性范圍33%～66%，3分為脂肪變性范圍＞66%；②肝細(xì)胞小葉內(nèi)炎癥及匯管區(qū)炎癥程度：隨機(jī)選10個(gè)高倍視野（×200），0分為無(wú)炎癥細(xì)胞，1分為炎癥細(xì)胞1～2個(gè)，2分為炎癥細(xì)胞2～3個(gè)，3分為炎癥細(xì)胞≥4個(gè)。

1.3 Masson三色法及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[6]各組肝組織切片、脫蠟、蘇木素染色、分化，Masson液中染色5 min后水洗，亮綠液染色1 min，脫水，過(guò)石碳酸二甲苯，透明封固。結(jié)果判定：肝細(xì)胞呈紅色，膠原纖維呈藍(lán)綠色。纖維化評(píng)分：隨機(jī)選擇10個(gè)低倍鏡視野（×100），0分為無(wú)纖維化，1分為肝小葉3區(qū)竇周或肝細(xì)胞外纖維化，2分為匯管區(qū)出現(xiàn)纖維化，3分為肝小葉纖維化與匯管區(qū)纖維化相互連接，形成橋接纖維化，4分為肝硬化（典型的假小葉出現(xiàn)）。

1.4 肝臟超微結(jié)構(gòu)檢查 取新鮮肝組織1小塊（1 mm×1 mm×1 mm），即刻入2.5%戊二醛4 ℃固定，鋨酸后固定，PBS漂洗及脫水。包埋及半薄切片定位后切片、行鉛鈾雙重染色后電鏡下觀察（德國(guó)萊卡公司RM2245型石蠟切片機(jī)，日本日立公司H-7500型透射電鏡機(jī)）。

1.5 免疫組織化學(xué)染色 各組肝組織切片后按Envision二步法染色。α-SMA、NF-κB為鼠單抗（稀釋濃度為1：100），11β-HSD1、GR、TGFβ1為兔多抗（稀釋濃度1：100）。結(jié)果判定：α-SMA、11β-HSD1、TGFβ1細(xì)胞胞漿顯示棕黃色為陽(yáng)性表達(dá)；GR細(xì)胞胞核顯示棕黃色為陽(yáng)性表達(dá)；NF-κB表達(dá)出現(xiàn)細(xì)胞漿陽(yáng)性表達(dá)并出現(xiàn)核轉(zhuǎn)位，發(fā)生細(xì)胞核表達(dá)為陽(yáng)性表達(dá)。隨機(jī)選擇5個(gè)低倍鏡視野（×100），應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件計(jì)算11β-HSD1、GR、NF-κB、TGFβ1累積光密度。按下列評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估α-SMA的表達(dá)[7]：0分為無(wú)著色，1分為輕度（＜10%），2分為中度（11%～25%），3分為重度（26%～50%），4分為極重度（＞50%）。

1.6 RNA提取及RT-PCR 3組各取100 mg肝組織加1 mL Trizol（美國(guó)Invitrogen公司），提取大鼠肝組織的總mRNA。取2 μg總mRNA，用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶（美國(guó)Promega公司）合成cDNA（20 μL）。取1 μL cDNA為模板，在Taq DNA聚合酶（大連寶生物公司）催化下行肝臟11β-HSD1、GR、NF-κB、TGFβ1基因mRNA擴(kuò)增（引物由上海Invitrogen公司合成）。PCR引物及反應(yīng)條件見(jiàn)表1，用Gel-pro31凝膠分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，以目的基因和內(nèi)參照RPS16基因的累積吸光度比值作為目的基因的相對(duì)水平。

表1 PCR引物及反應(yīng)條件

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。正態(tài)分布數(shù)據(jù)以 ±s表示，用單因素方差分析比較組間差異。偏態(tài)分布數(shù)據(jù)以M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 光鏡下形態(tài)學(xué)改變

2.1.1 HE染色：NC組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝索整齊；T2DM組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞明顯水腫伴脂肪變性，并可見(jiàn)多灶區(qū)細(xì)胞點(diǎn)狀壞死，伴小膽管增生及慢性炎細(xì)胞浸潤(rùn)；T2DM組脂肪變性、小葉間炎癥、匯管區(qū)炎癥與NC組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。T2DMG組與T2DM組比較，脂肪變性、小葉間炎癥、匯管區(qū)炎癥稍改善，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖1、表2。

2.1.2 Masson染色：NC組肝組織散在綠染的膠原纖維，均表達(dá)于血管壁，T2DM組膠原纖維明顯增生，T2DMG組膠原纖維增生與T2DM組比較明顯減輕。T2DM組與NC組纖維化評(píng)分比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001），T2DMG組與T2DM組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.035），見(jiàn)圖2、表2。

圖1 各組肝組織的病理變化（HE，×400）

表2 各組大鼠肝組織脂肪變性、小葉間炎癥、匯管區(qū)炎癥、纖維化、α-SMA評(píng)分（n=10， ±s）

2.2 電鏡下形態(tài)學(xué)改變 NC組肝細(xì)胞核圓形居中，胞漿內(nèi)線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，未見(jiàn)脂滴；T2DM組肝細(xì)胞核固縮偏位，線粒體減少、體積變小、密度增加，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)目減少，胞漿內(nèi)可見(jiàn)大量脂滴，狄氏竇膠原纖維增生，HSC明顯增生；T2DMG組肝細(xì)胞線粒體數(shù)目稍增多、密度稍降低，板狀嵴變清晰，胞漿內(nèi)脂滴稍減少，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量與NC組相近，狄氏竇未見(jiàn)明顯膠原纖維及HSC增生。見(jiàn)圖3。

2.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 NC組肝組織未見(jiàn)α-SMA陽(yáng)性表達(dá)的HSC，T2DM組肝組織內(nèi)α-SMA陽(yáng)性表達(dá)明顯增多，與NC組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001），T2DMG組α-SMA表達(dá)陽(yáng)性減少，與T2DM組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.009），見(jiàn)表2。NC組11β-HSD1、TGFβ1細(xì)胞漿呈弱陽(yáng)性表達(dá)，GR細(xì)胞核呈弱陽(yáng)性表達(dá)，NF-κB細(xì)胞漿弱表達(dá)；T2DM組11β-HSD1、TGFβ1細(xì)胞漿表達(dá)明顯增強(qiáng)，GR細(xì)胞核表達(dá)明顯增強(qiáng)，NF-κB細(xì)胞漿表達(dá)增強(qiáng)且出現(xiàn)胞核表達(dá)，與NC組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.004、0.002、0.001、0.001）；T2DMG組11β-HSD1、TGFβ1細(xì)胞漿表達(dá)明顯減弱，GR細(xì)胞核表達(dá)明顯減弱，NF-κB細(xì)胞漿表達(dá)減弱，個(gè)別胞核弱表達(dá)，與T2DM組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.031、0.027、0.002、0.009），見(jiàn)表3。

2.4 mRNA表達(dá)結(jié)果 T2DM組肝組織GR、TGFβ1基因mRNA表達(dá)明顯高于NC組（P=0.01、0.001）；11β-HSD1、NF-κB mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.443、0.438）。T2DMG組11β-HSD1、GR、TGFβ1 mRNA表達(dá)明顯低于T2DM組（P=0.003、0.038、0.014），NF-κB mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.431），見(jiàn)表3。

3 討論

圖2 各組肝組織纖維化病變（Masson染色，×100）

圖3 3組大鼠肝組織超微結(jié)構(gòu)（TEM）

表3 各組大鼠肝組織11β-HSD1、GR、NF-κB、TGFβ1蛋白及mRNA表達(dá)水平比較（n=10， ±s）

NAFLD是常見(jiàn)的糖尿病并發(fā)癥，伴隨肝臟纖維化加重可進(jìn)展為不可逆轉(zhuǎn)的肝硬化甚至肝功能衰竭，導(dǎo)致NAFLD病死率上升[8]，因此，有效地治療NAFLD具有重要的臨床意義。11β-HSD1為糖皮質(zhì)激素（glucocorticoid，GC）的代謝酶，具有氧化/還原兩種活性，在肝臟內(nèi)11β-HSD1主要以還原形式存在，可將無(wú)活性的皮質(zhì)酮轉(zhuǎn)化為有活性的皮質(zhì)醇，增強(qiáng)GC的作用。GR屬于保守的核受體超家族中的一員，大多數(shù)已知的GC的作用都是由GR介導(dǎo)。GC與GR結(jié)合，使糖異生的限速酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK）和葡萄糖6磷酸酶（glucose-6-phosphatase，G6Pase）表達(dá)上調(diào)，加速糖異生的過(guò)程，對(duì)抗胰島素的活性并使血糖升高。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)棉酚可有效改善胰島素抵抗，降低糖尿病大鼠的血糖水平[4]，本研究發(fā)現(xiàn)T2DM大鼠肝組織11β-HSD1、GR蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，GR mRNA水平明顯升高，提示糖尿病時(shí)11β-HSD1表達(dá)上調(diào)使GC的活性增強(qiáng)。經(jīng)棉酚治療后，11β-HSD1、GR蛋白表達(dá)及mRNA水平表達(dá)明顯減少，提示棉酚可能通過(guò)抑制肝11β-HSD1，使肝臟局部的GC活性減弱，從而抑制糖異生作用，降低血糖。

NF-κB作為激活炎癥反應(yīng)啟動(dòng)及調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子，可誘導(dǎo)TNF-α、白細(xì)胞介素、黏附分子等的表達(dá)，對(duì)肝臟炎癥后的纖維化病變起著重要作用[9]。在靜息的細(xì)胞中，NF-κB和IκB形成復(fù)合體，并以無(wú)活性形式存在于胞漿中。當(dāng)細(xì)胞受細(xì)胞外信號(hào)刺激后，IκB激酶復(fù)合體（IκB kinase，IKK）活化，將IκB磷酸化，使NF-κB暴露核定位位點(diǎn)并使游離的NF-κB迅速移位到細(xì)胞核（核轉(zhuǎn)位）并激活炎癥反應(yīng)[10]。TGFβ1是最強(qiáng)的致肝纖維化細(xì)胞因子之一，它通過(guò)Smad或MAPK/ERK通路促進(jìn)HSC增殖及活化[11]。HSC位于肝竇周隙內(nèi)，正常情況下HSC處于靜止?fàn)顟B(tài)，當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)氧化應(yīng)激時(shí)可引起該細(xì)胞活化，導(dǎo)致α-SMA表達(dá)增多，加速合成細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）并促進(jìn)肝纖維化。在肝臟損傷及炎癥反應(yīng)過(guò)程中，TGFβ1分泌增多導(dǎo)致HSC活化，活化的HSC數(shù)量增多又可使TGFβ1分泌增多，兩者相互作用維持HSC進(jìn)一步活化，最終導(dǎo)致肝臟纖維化。此外，大量的TGFβ1產(chǎn)生可激活ERK通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致NF-κB轉(zhuǎn)位入核，發(fā)揮更強(qiáng)的炎癥作用[12]。本研究發(fā)現(xiàn)T2DM大鼠肝組織出現(xiàn)NF-κB蛋白胞漿表達(dá)增強(qiáng)并出現(xiàn)個(gè)別細(xì)胞核轉(zhuǎn)位，TGFβ1蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，HSC明顯增生；經(jīng)棉酚治療后，NF-κB蛋白表達(dá)量減弱伴個(gè)別細(xì)胞核表達(dá)，TGFβ1蛋白表達(dá)及mRNA水平明顯降低，HSC明顯減少，提示棉酚一方面可能通過(guò)降低血糖使氧化應(yīng)激作用減弱，間接抑制NF-κB、TGFβ1的表達(dá)，另一方面通過(guò)抑制肝NF-κB核轉(zhuǎn)位、協(xié)同抑制TGFβ1蛋白表達(dá)，兩者共同減弱HSC的激活，從而減少肝內(nèi)膠原纖維的合成，改善肝纖維化病變。

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Effect of gossypol on hepatic fibrosis of nonalcoholic fatty liver disease in diabetic rats

LI Yangyang1,CHEN Hanbin2, XU Feifei1, WAN Li1, CHEN Guorong1, CHEN Lei3, CHEN Sanmei4, WANG Rongrong1.
1.Department of Pathology, the First Aff i liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 2.Department of Radiation and Chemotherapy, the First Aff i liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou,325015; 3.The First Clinical Medical College, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035; 4.Department of Nursing, School of Medical Sciences, Shaoxing University, Shaoxing, 312000

Objective： To investigate the effect of gossypol on nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) and its mechanism. Methods： Thirty male Sprague-Dawley rats were divided randomly into 3 groups： normal control(NC) group, type 2 diabetes mellitus (T2DM) group, type 2 diabetes mellitus treated with gossypol (T2DMG)group. After fed with a high-fat diet, the rats were injected with low-dose streptozotocin (STZ) intraperitoneally to induce type 2 diabetes mellitus. The T2DMG group were given 15 mg·kg-1·d-1gossypol by gavage for 4 weeks,followed by 15 mg·kg-1·d-1dose of gossypol every week for 8 weeks. The morphology of the liver was observed under light and transmission electronmicroscopy. Masson staining were used to observe the fi brosis of liver tissue.The protein expression of α-SMA, 11β-HSD1, GR, NF-κB and TGFβ1 were assayed by immunohistochemistry.The mRNA expression of 11β-HSD1, GR, NF-κB and TGFβ1 from rats livers were assayed by semi-quantitative RT-PCR. Results： Compare with NC group, T2DM group hapatic fi brosis was obvious, α-SMA, 11β-HSD1, GR,NF-κB and TGFβ1 protein expression was signif i cantly enhanced (P=0.001, 0.004, 0.001, 0.001, 0.002), GR and TGFβ1 mRNA expression was significantly increased (P=0.01, 0.001). Compare with T2DM group, T2DMG group liver fibrosis was significantly ameliorated, α-SMA, 11β-HSD1, GR, NF-κB and TGFβ1 expression was signif i cantly decreased (P=0.009, 0.031, 0.002, 0.009, 0.027), 11β-HSD1, GR and TGFβ1 mRNA expressionwas signi fi cantly reduced (P=0.003, 0.038, 0.014). Conclusion： Gossypol exerts the capacity to relieve hepatic fi brosis from NAFLD, inhibiting the expression of 11β-HSD1, GR and NF-κB, TGFβ1 may be involved in it.

liver fi brosis; diabetes mellitus; gossypol; 11β-hydroxysteroid dehydrogenase 1; glucocorticoid receptor; nuclear transcription factor-κB; transforming growth factor-β1

R363

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.11.002

2017-04-24

浙江省公益性技術(shù)應(yīng)用研究計(jì)劃項(xiàng)目（Y2011c23123）；溫州市科技局科研基金資助項(xiàng)目（Y20120010，Y20130166）。

李秧秧（1986-），女，浙江溫州人，住院醫(yī)師。

王蓉蓉，副主任醫(yī)師，Email：997683344@qq.com。

丁敏嬌）