周夢(mèng)宇，古麗斯坦·阿不來(lái)提，姚 軍*，陳 玲

（新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011）

新疆地區(qū)是我國(guó)優(yōu)質(zhì)的棉產(chǎn)區(qū)，棉花副產(chǎn)物之一的棉籽大部分用于榨油，并且棉籽油含有較高的不飽和脂肪酸[1-2]，可有效降低膽固醇和預(yù)防心腦血管疾病[3-4]。棉酚作為棉籽中提取的小分子化合物，是一種黃色多酚羥基雙萘醛類化合物，在棉籽中含量高達(dá)0.15%～1.8%[5]。棉酚包含游離棉酚和結(jié)合棉酚兩種存在方式，其中結(jié)合棉酚是通過(guò)游離棉酚與賴氨酸中游離ε-氨基之間的共價(jià)鍵經(jīng)褐變反應(yīng)結(jié)合產(chǎn)生的，通常毒性較小[6]；而高濃度的游離棉酚會(huì)引起動(dòng)物急性中毒，并伴有呼吸窘迫，厭食虛弱，甚至死亡等癥狀[7-9]，攝食游離棉酚1～3 個(gè)月后會(huì)造成毒性作用的積累效應(yīng)[10-12]，有明顯的生殖毒性[13-16]，因此長(zhǎng)期食用含有游離棉酚的棉籽油會(huì)引起慢性中毒[17]。游離棉酚由于結(jié)構(gòu)中具有多個(gè)酚羥基及醛基，化學(xué)性質(zhì)非常不穩(wěn)定[18-19]，棉籽油中游離棉酚在室溫下放置30 d，80%的棉酚會(huì)發(fā)生降解[20]，在放置過(guò)程中，游離棉酚酚羥基中的H易發(fā)生甲基化反應(yīng)（結(jié)構(gòu)變化見圖1），根據(jù)本課題組研究發(fā)現(xiàn)證實(shí)游離棉酚在棉籽油中降解產(chǎn)物為四甲氧基棉酚[21]，并發(fā)現(xiàn)四甲氧基棉酚能夠?qū)π∈驡C-2精母細(xì)胞造成生長(zhǎng)抑制等毒性作用并導(dǎo)致細(xì)胞死亡[22]，造成雄性小鼠精子發(fā)生畸形變化，表明四甲氧基棉酚存在一定生殖毒性[23]；對(duì)SD大鼠灌服四甲氧基棉酚30 d后結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠肝臟組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，造成肝損傷，證實(shí)了四甲氧基棉酚的毒性作用[24]。

圖1 游離棉酚與四甲氧基棉酚結(jié)構(gòu)變化圖Fig. 1 Structural changes of free gossypol relative to tetramethoxy gossypol

目前食用粗制棉籽油中毒的現(xiàn)象仍然存在[25]，而市售棉籽油中生產(chǎn)加工過(guò)程及隨著存放時(shí)間和環(huán)境的改變，游離棉酚及降解產(chǎn)物四甲氧基棉酚的存在是危害消費(fèi)者健康的重要因素。GB 2716—2005《食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》[26]中規(guī)定食用植物油中棉籽油游離棉酚含量不得超過(guò)0.02%，然而對(duì)其降解產(chǎn)物四甲氧基棉酚的含量未作出規(guī)定，因而急需建立含量測(cè)定方法，因此本實(shí)驗(yàn)建立了同時(shí)測(cè)定棉籽油中游離棉酚及其降解產(chǎn)物四甲氧基棉酚含量的高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法，并進(jìn)行方法學(xué)考察，旨在建立更加科學(xué)的棉籽油質(zhì)量控制方法，防止游離棉酚及四甲氧基棉酚含量不合格的食用棉籽油進(jìn)入市場(chǎng)，對(duì)人民身體健康的保障起到積極作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

棉酚標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%）購(gòu)自陜西慈源生物科技有限公司；四甲氧基棉酚工作標(biāo)樣（純度85.30%）為課題組經(jīng)ODS柱層析分離得到；實(shí)驗(yàn)所檢測(cè)的1#～90#批市售棉籽油樣品來(lái)自新疆各地州大型油脂企業(yè)。

冰醋酸（分析純） 天津博迪化工股份有限公司；95%乙醇（分析純） 天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；甲醇（色譜純） 美國(guó)Fisher公司；磷酸（優(yōu)級(jí)純）成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

TB-114型分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；TDL-5A型離心機(jī) 上海菲恰爾分析儀器有限公司；MS3BS25型渦旋振蕩器 德國(guó)IKA公司；1220型高效液相色譜儀 美國(guó)安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱為Inertsil?ODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相甲醇-2%磷酸（85∶15，V/V）溶液，進(jìn)樣量10 mL，流速1.0 mL/min，柱溫32 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)235 nm。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

分別稱取6.13 mg棉酚標(biāo)準(zhǔn)品與10.56 mg四甲氧基棉酚工作標(biāo)樣于25 mL容量瓶中，加入0.5 mL冰醋酸溶液，95%乙醇溶液溶解并定容至刻度，即為棉酚（0.245 mg/mL）及四甲氧基棉酚（0.422 mg/mL）的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精密吸取各1 mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用95%乙醇溶液定容至100 mL容量瓶中，得質(zhì)量濃度為2.452 mg/mL的棉酚和4.224 mg/mL的四甲氧基棉酚混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.3.3 供試品溶液的制備

精密量取市售油樣2 mL，加入95%乙醇溶液2 mL，劇烈振搖2 min后靜置分層，4 000 r/min離心5 min，吸取上清液即得含油樣的供試品溶液。

1.4 數(shù)據(jù)處理

各實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次以上，使用CDS、Excel等軟件進(jìn)行圖表的繪制和相關(guān)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉酚及四甲氧基棉酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精密吸取混合儲(chǔ)備液各0.5、1、1.5、2、2.5 mL置于10 mL棕色容量瓶中，用95%乙醇溶液定容，考察四甲氧基棉酚線性關(guān)系；精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液各1、2、3、4、5 mL置于10 mL棕色容量瓶中，用95%乙醇溶液定容，考察棉酚線性關(guān)系。各樣品經(jīng)0.22 mm微孔濾膜過(guò)濾，按1.3.1節(jié)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，HPLC見圖2。結(jié)果表明四甲氧基棉酚在0.211～1.056 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，得線性回歸方程為：Y=2 205 265.15X－135 755.00，r=0.999 6；棉酚在0.245～1.226 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，得線性回歸方程為：Y=1 809 717.37X－258 173.90，r=0.999 5。

圖2 四甲氧基棉酚（A）和棉酚（B）標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖Fig. 2 HPLC chromatogram of tetramethoxy gossypol (A) and gossypol (B) standards

2.2 精密度實(shí)驗(yàn)

取經(jīng)稀釋的同一份混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液（棉酚質(zhì)量濃度為0.736 mg/mL，四甲氧基棉酚質(zhì)量濃度為0.636 mg/mL），經(jīng)0.22 mm微孔濾膜過(guò)濾，按1.3.1節(jié)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)得四甲氧基棉酚峰面積值為1 280 614、1 294 758、1 308 224、1 259 180、1 315 379、1 289 456 ，計(jì)算得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.56%；測(cè)得棉酚峰面積值為1 105 268、1 080 236、1 095 491、1 102 300、1 090 330、1 103 457，計(jì)算得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.88%，表明該方法精密度良好。

2.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密量取同一批含有四甲氧基棉酚及棉酚的棉籽油樣品6 份于離心試管中，按1.3.3節(jié)方法操作，經(jīng)0.22 mm微孔濾膜過(guò)濾，按1.3.1節(jié)色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，測(cè)得四甲氧基棉酚峰面積值為1 489 375、1 493 646、1 505 442、1 486 409、1 458 576、1 472 375，計(jì)算得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.11%；測(cè)得棉酚峰面積值為1 330 995、1 277 432、1 308 919、1 298 049、1 329 467、1 283 157，計(jì)算得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.73%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一批含有四甲氧基棉酚及棉酚的棉籽油樣品于離心試管中，按1.3.3節(jié)方法操作，在4 ℃放置0、2、4、6、8、10，12 h，經(jīng)0.22 mm微孔濾膜過(guò)濾，按1.3.1節(jié)色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，測(cè)得四甲氧基棉酚峰面積值為2 507 353、2 492 601、2 472 286、2 488 623、2 600 460、2 519 553，計(jì)算得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.81%；測(cè)得棉酚峰面積為1 583 502、1 638 809、1 553 259、1 576 115、1 608 310、1 596 012，計(jì)算得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.65%，表明棉籽油樣品中四甲氧棉酚及棉酚在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

吸取同一批含有四甲氧基棉酚（0.562 mg/mL）及棉酚（0.719 mg/mL）的棉籽油樣9 份各0.50 mL，3 份為一組，取四甲氧基棉酚質(zhì)量濃度為0.636 mg/mL和棉酚質(zhì)量濃度為0.837 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別加入0.35、0.45、0.55 mL，按1.3.3節(jié)方法操作，經(jīng)0.22 mm微孔濾膜過(guò)濾，按1.3.1節(jié)色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，四甲氧基棉酚平均回收率100.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.12%；棉酚平均回收率為101.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.75%（表1、2）。

表1 四甲氧基棉酚加樣回收率Table 1 Recoveries of tetramethoxy gossypol from spiked sample

表2 棉酚加樣回收率Table 2 Recoveries of gossypol from spiked sample

2.6 市售棉籽油四甲氧基棉酚及棉酚含量測(cè)定

1#～90#市售棉籽油樣品均按1.3.3節(jié)方法操作，按1.3.1節(jié)色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)。研究表明，90 批市售棉籽油有25 批檢測(cè)到棉酚，質(zhì)量濃度為0.159～1.661 mg/mL，有56 批檢測(cè)到四甲氧基棉酚，質(zhì)量濃度為0.093～1.661 mg/mL，結(jié)果見表3，市售棉籽油樣品與混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的HPLC對(duì)比圖見圖3。

表3 市售棉籽油樣品中四甲氧基棉酚及棉酚質(zhì)量濃度Table 3 Contents of tetramethoxy gossypol and gossypol in commercially available cottonseed oil samples

續(xù)表3

圖3 混合標(biāo)準(zhǔn)品（A）與市售棉籽油（B）HPLC圖Fig. 3 HPLC chromatograms of mixed reference substance (A) and commercially available cottonseed oil (B)

3 結(jié)論與討論

本研究使用的四甲氧基棉酚工作標(biāo)樣，是課題組經(jīng)ODS柱分離純化自制未脫毒棉籽油中的游離棉酚降解產(chǎn)物，采用HPLC檢測(cè)，根據(jù)面積歸一化法，得純度為85.30%的四甲氧基棉酚[24]，因未達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)品純度范圍標(biāo)準(zhǔn)，所以僅作為工作標(biāo)樣來(lái)進(jìn)行研究考察。目前對(duì)于游離棉酚的檢測(cè)方法有很多，包括分光光度法[27]、高效薄層色譜法[28]、高效毛細(xì)管電泳法[29]、HPLC法[30]等。本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC法同時(shí)測(cè)定棉籽油中游離棉酚及降解產(chǎn)物四甲氧基棉酚含量的方法，該方法準(zhǔn)確度高，精密度和靈敏度均能滿足測(cè)定要求，可以監(jiān)管棉籽油生產(chǎn)企業(yè)的脫毒工藝，為棉籽油中游離棉酚及其降解產(chǎn)物四甲氧基棉酚的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)，同時(shí)制止游離棉酚及降解產(chǎn)物含量超標(biāo)的棉籽油進(jìn)入市場(chǎng)，為本地區(qū)食品安全問(wèn)題提供重要依據(jù)。

通過(guò)對(duì)新疆各地區(qū)市售棉籽油進(jìn)行抽查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)90 批市售棉籽油中有25 批檢測(cè)到游離棉酚，56 批檢測(cè)到四甲氧基棉酚，根據(jù)GB 2716—2005《食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》，檢測(cè)到市售棉籽油中游離棉酚及降解產(chǎn)物四甲氧基棉酚含量較低，且均低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，可能不足以對(duì)消費(fèi)者的健康造成威脅，表明所檢測(cè)的新疆各地大型油脂企業(yè)棉籽油樣品，脫毒較完全，安全性較高。課題組后期將對(duì)新疆各地榨油小作坊的棉籽油樣品進(jìn)行實(shí)地采集及檢測(cè)，用于更加全面地評(píng)價(jià)新疆市售棉籽油的脫毒情況及安全性。