潘潔雪，林鳳

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 溫州 325015，1.生殖醫(yī)學(xué)中心；2.婦科）

ARK5蛋白在上皮性卵巢癌細(xì)胞卡鉑耐藥中的作用

潘潔雪1，林鳳2

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 溫州 325015，1.生殖醫(yī)學(xué)中心；2.婦科）

目的：探索上皮性卵巢癌細(xì)胞卡鉑耐藥的機制，以提高卵巢癌患者化療的療效。方法：應(yīng)用CCK8法檢測卡鉑處理后的上皮性卵巢癌細(xì)胞增殖，Western blot法檢測上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變相關(guān)蛋白E-Cadherin和Vimentin表達情況，流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞表面CD133的變化情況，使用siRNA敲降A(chǔ)MP激活的蛋白激酶家族成員5（ARK5）后再觀察卡鉑的作用。結(jié)果：上皮性卵巢癌細(xì)胞系SKOV3與A2780的卡鉑IC50分別為2.824 μg/mL與1.760 μg/mL，并且卡鉑能誘導(dǎo)上皮性卵巢癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變；卡鉑誘導(dǎo)ARK5顯著上調(diào)，而不影響SNF1/AMP激活的蛋白激酶表達，敲降A(chǔ)RK5基因能顯著減弱卡鉑誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞產(chǎn)生上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變的效果。結(jié)論：ARK5在上皮性卵巢癌細(xì)胞卡鉑耐藥機制中具有重要作用，降低ARK5的表達可以減弱卡鉑誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變的作用。

上皮性卵巢癌；上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變；卡鉑；ARK5

上皮性卵巢癌在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤死亡原因中居第一位[1]，化療耐藥是卵巢癌患者預(yù)后較差的重要原因之一[2]。以鉑類為基礎(chǔ)的化療方案是上皮性卵巢癌的一線治療方案[2-3]，但對大部分的進展期上皮性卵巢癌效果較差，導(dǎo)致疾病進展較快。AMP激活的蛋白激酶家族成員5（AMP-activated protein kinase family member 5，ARK5）是一個新型的AMP依賴的蛋白激酶。研究顯示ARK5促進腫瘤細(xì)胞生長[4-5]，在腫瘤中高度表達，并與腫瘤患者預(yù)后較差相關(guān)[6-9]，但在卵巢癌中，尚未見ARK5相關(guān)的報道。本研究分析卡鉑耐藥與ARK5的關(guān)系，為減少卵巢癌患者耐藥提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人上皮性卵巢癌細(xì)胞株A2780和SKOV3購自中國科學(xué)院上海生物科學(xué)研究院。使用美國Gbico公司的RPMI-1640培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素以及2 mmol/L的谷氨酰胺。細(xì)胞在37 ℃和5% CO2條件下正常培養(yǎng)。

1.2 細(xì)胞活性檢測 使用日本Dojindo公司的CCK8試劑盒檢測細(xì)胞活性。將細(xì)胞接種在96孔培養(yǎng)板后，待細(xì)胞貼壁，分別加入指定濃度（分別為0、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32 μg/mL）的卡鉑，并繼續(xù)培養(yǎng)48 h，加入CCK8試劑，并于490 nm處測OD值。

1.3 Real-time PCR檢測細(xì)胞SNF1/AMP激活的蛋白激酶（SNF1/AMP activated protein kinase，SNARK）與ARK5的表達 將A2780和SKOV3細(xì)胞系分為對照組與卡鉑處理組，分別提取A2780和SKOV3細(xì)胞總RNA，采用SYBR Premix Ex Taq Kit（日本Takara公司）進行Real-time PCR測定。該方法是將目的基因與內(nèi)參基因的Ct值比較（△Ct）后，再將實驗組與對照組進行比較（△△Ct）。

1.4 Western blot檢測E-Cadherin、Vimentin、SNARK與ARK5蛋白水平 將細(xì)胞分為4組：對照組、卡鉑處理組、卡鉑+ARK5 siRNA轉(zhuǎn)染組、ARK5 siRNA組。各組分別處理好細(xì)胞，裂解細(xì)胞，提取總蛋白。使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，使蛋白分離，隨后采用濕轉(zhuǎn)法，將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜。之后用10%脫脂奶粉封閉，洗過之后，用E-Cadherin（1∶1 000，美國CST公司）、Vimentin（1∶1 000，美國CST公司）、SNARK（1∶1 000，美國Abcam公司）、ARK5（1∶1 000，美國Abcam公司）與GAPDH（1∶2 000，美國CST公司）一抗封閉緩沖液，4 ℃過夜。取出膜，使用TBST液洗滌3次，每次5 min。再使用相應(yīng)的二抗緩沖液4 ℃孵育2 h。清洗結(jié)束，化學(xué)發(fā)光法檢測印跡。使用Quantity One軟件進行條帶灰度定量（目的蛋白/GAPDH）。

1.5 免疫熒光檢測E-Cadherin、Vimentin的水平取待檢測的卵巢癌細(xì)胞置于蓋玻片上，4%多聚甲醛固定15 min，0.5% TritonX-100/PBS室溫通透30 min，5% BSA/PBS 37 ℃封閉1 h，再將一抗E-Cadherin（1∶300）與Vimentin（1∶300）溶于5%BSA/PBS中，均勻覆蓋在細(xì)胞上，4 ℃孵育過夜。將相應(yīng)熒光二抗抗體（1∶2 000）溶于5% BSA/PBS中，均勻覆蓋在細(xì)胞上，室溫避光孵育1 h。PBS洗滌，DAPI溶液均勻覆蓋在細(xì)胞上，室溫避光孵育5 min。熒光顯微鏡觀察拍照。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測CD133 將對照組與實驗組（卡鉑處理）細(xì)胞收集后，使用PBS清洗，重懸于適量的PBS中，加入PE標(biāo)記的CD133（美國Biolegend公司）抗體1 μL，4 ℃避光孵育30 min。PBS清洗3遍后流式細(xì)胞儀檢測CD133水平。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理方法 流式細(xì)胞學(xué)分析采用Flowjo 7.2軟件，其余數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 6軟件分析。兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用方差分析。p＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 卡鉑誘導(dǎo)上皮性卵巢癌細(xì)胞系發(fā)生上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變 CCK8法檢測結(jié)果顯示，SKOV3與A2780細(xì)胞系的卡鉑IC50分別為2.824 μg/mL與1.760 μg/mL，ARK5在SKOV3細(xì)胞系表達比在A2780高（0.86±0.04 vs. 0.66±0.07，p＜0.05），見圖1。進一步研究卵巢癌細(xì)胞系SKOV3與A2780在卡鉑作用下上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變相關(guān)蛋白的表達情況，發(fā)現(xiàn)在卡鉑作用下E-Cadherin顯著下調(diào)，而Vimentin顯著上調(diào)（見表1），并且卡鉑能誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞的CD133比例明顯上調(diào)（見圖2）。

2.2 卡鉑作用后ARK5顯著上調(diào) 為進一步探索卡鉑誘導(dǎo)上皮性卵巢癌細(xì)胞上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變形成的機制，PCR法檢測了ARK5與SNARK的表達，發(fā)現(xiàn)在卡鉑的作用下ARK5發(fā)生了顯著上調(diào)，SNARK無明顯變化（見表2），進一步檢測ARK5蛋白表達的水平，同樣發(fā)現(xiàn)ARK5顯著上調(diào)，而SNARK無明顯變化（見表3）。

2.3 敲降A(chǔ)RK5能抑制卡鉑誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞系的上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變作用 使用ARK5 siRNA敲降A(chǔ)RK5在上皮性卵巢癌細(xì)胞中的表達，并與卡鉑一起作用，發(fā)現(xiàn)在將卡鉑與ARK5 siRNA一起作用時，其誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞系形成上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變的作用被削弱，Vimentin表達較卡鉑單獨作用顯著下降，ECadherin則顯著上調(diào)（見表4），使用免疫熒光方法觀測到相同的現(xiàn)象（見圖3），因此我們推測，卡鉑誘導(dǎo)上皮性卵巢癌細(xì)胞系形成上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變的作用有可能是通過ARK5這條通路。

圖1 上皮性卵巢癌細(xì)胞系（SKOV3與A2780）在卡鉑作用后的細(xì)胞增殖變化

圖2 上皮性卵巢癌細(xì)胞系（SKOV3與A2780）在卡鉑作用后的CD133的比例變化

表1 SKOV3與A2780細(xì)胞系在卡鉑處理后的蛋白表達（n=3，

表1 SKOV3與A2780細(xì)胞系在卡鉑處理后的蛋白表達（n=3，

與對照組比：aP＜0.05

細(xì)胞系 組別 E-Cadherin Vimentin SKOV3 對照組 0.94±0.07 0.47±0.04卡鉑處理組 0.39±0.08a 0.93±0.06a A2780 對照組 0.88±0.06 0.39±0.07卡鉑處理組 0.53±0.02a 0.84±0.07a

表2 SNARK與ARK5在SKOV3與A2780細(xì)胞系卡鉑處理后的mRNA表達（n=3，

表2 SNARK與ARK5在SKOV3與A2780細(xì)胞系卡鉑處理后的mRNA表達（n=3，

與對照組比：aP＜0.05

細(xì)胞系 組別 SNARK ARK5 SKOV3 對照組 1.05±0.07 0.98±0.04卡鉑處理組 1.20±0.40 5.63±0.67a A2780 對照組 1.10±0.14 0.95±0.04卡鉑處理組 1.18±0.53 9.12±1.40a

表3 SNARK與ARK5在SKOV3與A2780細(xì)胞系卡鉑處理后的蛋白表達（n=3，）

與對照組比：aP＜0.05

細(xì)胞系 組別 SNARK ARK5 SKOV3 對照組 0.84±0.07 0.32±0.02卡鉑處理組 0.83±0.09 0.87±0.01a A2780 對照組 0.72±0.07 0.23±0.10卡鉑處理組 0.75±0.07 0.89±0.16a

3 討論

卵巢癌患者的早期癥狀并不明顯，大部分患者多因腹脹不適就診，導(dǎo)致60%～70%的卵巢癌患者發(fā)現(xiàn)時即處于3期或者4期[10]。因此，卵巢癌患者的總體5年生存率不到50%，進展期的卵巢癌患者更低，只有不到25%[11]。 因此，解決卵巢癌的卡鉑耐藥，是進一步提高卵巢癌患者生存期的當(dāng)務(wù)之急。有研究表明ARK5能促進卵巢癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變[9]，而上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變在卵巢癌患者的卡鉑耐藥中占有重要地位[12]，因此ARK5與卵巢癌細(xì)胞卡鉑耐藥可能相關(guān)。

表4 SNARK與ARK5在SKOV3與A2780細(xì)胞系卡鉑處理后的蛋白表達（n=3，）

表4 SNARK與ARK5在SKOV3與A2780細(xì)胞系卡鉑處理后的蛋白表達（n=3，）

與對照組比：aP＜0.05；與卡鉑處理組比：bP＜0.05

細(xì)胞系 組別 E-Cadherin Vimentin SKOV3 對照組 0.89±0.01 0.46±0.04卡鉑處理組 0.28±0.03a 0.79±0.04a卡鉑+ARK5 siRNA組 0.82±0.06b 0.53±0.03b ARK5 siRNA組 0.91±0.13 0.54±0.04 A2780 對照組 0.74±0.04 0.36±0.05卡鉑處理組 0.40±0.07a 0.81±0.05a卡鉑+ARK5 siRNA組 0.65±0.06b 0.60±0.02b ARK5 siRNA組 0.84±0.08 0.54±0.02

上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變在很多腫瘤的耐藥中起重要作用[13-14]。在上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變過程中，上皮細(xì)胞會轉(zhuǎn)向為活躍的、侵襲的間質(zhì)性細(xì)胞，失去上皮的標(biāo)記如E-Cadherin，而間質(zhì)的標(biāo)記Vimentin會增強[15]；另一方面上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變會增強腫瘤細(xì)胞的干性，如CD133的表達上調(diào)，進而使這部分細(xì)胞具有更強的侵襲與轉(zhuǎn)移的能力[16]，并對腫瘤藥物具有更明顯的耐藥。有報道顯示，上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變在肝癌中與肝癌多柔比星耐藥相關(guān)[17]。本研究發(fā)現(xiàn)卡鉑能顯著誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞系E-Cadherin表達下調(diào)，Vimentin表達上調(diào)，并且誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞干性標(biāo)志CD133表達比例上調(diào)，說明卵巢癌細(xì)胞系在卡鉑作用下發(fā)生上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變，并增強其干性，進而促進腫瘤細(xì)胞耐藥。

圖3 免疫熒光法觀察Vimentin與E-Cadherin的表達（×200）

鉑類藥物的耐藥機制十分復(fù)雜，主要涉及PI3KAKT、Hippo與MAPK通路的異常，ARK5可以通過抑制caspase-8與caspase-6相關(guān)的FasL/Fas的活化，從而抑制腫瘤細(xì)胞死亡。本研究還發(fā)現(xiàn)卡鉑誘導(dǎo)ARK5顯著上調(diào)，而與ARK5同屬于NUAK家族，且與ARK5具有55.0%作用同源性[18]的SNARK蛋白表達并沒有上調(diào)，并且當(dāng)敲減ARK5的表達時，卡鉑引起上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變的作用被減弱。因此，我們認(rèn)為卡鉑可能是通過ARK5這條通路引起上皮性卵巢癌細(xì)胞上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變，進而引起卵巢癌細(xì)胞耐藥。

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The role of ARK5 in carboplatin resistance in epithelial ovarian cancer cell

PAN Jiexue1, LIN Feng2.
1.Reproductive Medicine Center, the First Af fi liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015;2.Department of Gynecology, the First Af fi liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective： To investigate the mechanisms of carboplatin resistance in epithelial ovarian cancer(EOC) cells, and provide preliminary exploration on improving the effect of chemotherapy in ovarian cancer patients. Methods： Cell counting kit-8 was used to evaluate the effect of carboplatin on the proliferation of SKOV3 and A2780 cells, meanwhile the expression of epithelial-mesenchymal transition related proteins E-cadherin and vimentin were detected by Western blot. Flow cytometry assay was used to detect the expression of CD133. In addition, knockdown of ARK5 was to evaluate the role of ARK5 in the carboplatin-induced epithelial-mesenchymal transition. Results： The IC50of carboplatin in SKOV3 and A2780 was 2.824 μg/mL and 1.760 μg/mL, respectively. Furthermore, we also found that carboplatin could signif i cantly induce epithelial-mesenchymal transition in EOC cells. Carboplatin could increase the expression of ARK5, but not SNARK. Knockdown of ARK5 could attenuate the induction of epithelial-mesenchymal transition. Conclusion： ARK5 plays an important role in carboplatin resistance in EOC cells. Knockdown of ARK5 may reduce the carboplatin-induced epithelial-mesenchymal transition.

epithelial ovarian cancer cells; epithelial-mesenchymal transition; carboplatin; ARK5

R711

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.11.006

2017-03-30

浙江省中醫(yī)藥管理局青年人才基金項目（2017ZQ0 20）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目（2017KY462）；溫州市科技局科研基金資助項目（Y20160037）。

潘潔雪（1986-），女，浙江溫州人，住院醫(yī)師，博士。

林鳳，副主任醫(yī)師，Email：234898067@qq.com。

丁敏嬌）