劉 剛，劉詩穎，黃伍蓉，簡 燚，呼永河，吳麗娟△

(1.西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，成都 610031；2.中國人民解放軍成都軍區(qū)總醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)科/高濕醫(yī)學(xué)全軍重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610083;3.中國人民解放軍成都軍區(qū)總醫(yī)院病理科,成都 610083;4.中國人民解放軍成都軍區(qū)總醫(yī)院中醫(yī)科,成都 610083)

論著·基礎(chǔ)研究

SD大鼠極端高溫高濕環(huán)境暴露的實(shí)驗(yàn)研究*

劉 剛1,2，劉詩穎2，黃伍蓉2，簡 燚3，呼永河4，吳麗娟2△

(1.西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，成都 610031；2.中國人民解放軍成都軍區(qū)總醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)科/高濕醫(yī)學(xué)全軍重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610083;3.中國人民解放軍成都軍區(qū)總醫(yī)院病理科,成都 610083;4.中國人民解放軍成都軍區(qū)總醫(yī)院中醫(yī)科,成都 610083)

目的調(diào)查極端高溫高濕環(huán)境暴露對(duì)SD大鼠生存、血液生化指標(biāo)的影響及對(duì)主要臟器的傷害。方法26只SD大鼠分為常溫常濕組和極端高溫高濕組。觀察SD大鼠在極端高溫高濕環(huán)境中的死亡情況并于半數(shù)致死時(shí)間點(diǎn)捕殺動(dòng)物進(jìn)行血清生化指標(biāo)測定和心、肺、腎、腦、肌肉和小腸6種組織的病理檢測。結(jié)果極端高溫高濕環(huán)境暴露可導(dǎo)致SD大鼠死亡，半數(shù)致死時(shí)間為48 h；極端高溫高濕組與常溫常濕組相比，SD大鼠血清肌酐(Scr)顯著性升高(P<0.05)，血清堿性磷酸酶(ALP)、缺血修飾性清蛋白(IMA)明顯下降(P<0.05)，其他生化指標(biāo)無顯著性改變；極端高溫高濕組SD大鼠心、肺、腎、小腸組織可見炎性細(xì)胞浸潤，腦和肌肉組織未見明顯病理性改變。結(jié)論極端高溫高濕環(huán)境暴露對(duì)SD大鼠有明顯傷害，可引起某些血液生化指標(biāo)異常和心、肺、腎、小腸組織的炎性改變，甚至造成死亡。

高溫；高濕；環(huán)境暴露;大鼠,Sprague-Dawley；生物學(xué)標(biāo)記；病理學(xué),臨床

高溫高濕環(huán)境會(huì)導(dǎo)致機(jī)體不能有效散熱，體溫升高，引起機(jī)體一系列的生理應(yīng)激反應(yīng)，呼吸加深加快、心率增加、消化吸收功能下降等，嚴(yán)重時(shí)能導(dǎo)致神經(jīng)內(nèi)分泌、能量代謝及免疫功能等系統(tǒng)及組織器官功能的改變[1]。西南戰(zhàn)區(qū)部隊(duì)官兵在夏季進(jìn)行野外軍事訓(xùn)練時(shí)，常會(huì)經(jīng)受極端高溫高濕環(huán)境的考驗(yàn)，為了探究極端高溫高濕環(huán)境對(duì)機(jī)體造成的生理病理影響，本研究采用人工氣候箱模擬極端高溫高濕環(huán)境，觀察Sprague-Dawley(SD)大鼠的生存情況、血液生化指標(biāo)改變及主要臟器的病理損傷，為進(jìn)一步研究極端高溫高濕環(huán)境對(duì)人體的損傷作用、分子機(jī)制和干預(yù)措施提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠26只，6～8周齡，體質(zhì)量(180±10)g，成都達(dá)碩生物科技有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)scxk(川) 2008-24。本研究獲得成都軍區(qū)總醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2主要儀器與試劑 多段編程人工氣候箱(RXZ-100A，中國寧波江南儀器廠)，Beckman AU5800全自動(dòng)生化儀，轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)(徠卡-2016，德國)等。多聚甲醛、中性樹膠等由四川生工科技有限公司提供，各項(xiàng)生化指標(biāo)試劑盒由北京九強(qiáng)生物技術(shù)有限公司提供。

1.3方法 SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為極端高溫高濕組和常溫常濕組，每組13只。人工氣候箱模擬溫度與濕度氣候環(huán)境，極端高溫高濕組設(shè)置為溫度(35.0±0.5)℃、相對(duì)濕度(95±5)%；常溫常濕組設(shè)置為溫度(25.0±0.5)℃、相對(duì)濕度(50±5)%。兩組大鼠置于相應(yīng)的環(huán)境下持續(xù)飼養(yǎng)，24 h不間斷暴露于模擬氣候條件中。實(shí)驗(yàn)中，記錄大鼠存活狀態(tài)與死亡情況，當(dāng)極端高溫高濕組死亡數(shù)量達(dá)到1/2時(shí)，對(duì)存活大鼠以水合氯醛麻醉，采集SD大鼠腹主動(dòng)脈血進(jìn)行血清生化指標(biāo)檢測并取心、肺、腎、腦、肌肉和小腸6種組織進(jìn)行病理檢查。常溫常濕組在極端高溫高濕組達(dá)到半數(shù)致死時(shí)選取6只SD大鼠，按照相同的方法采集血標(biāo)本及組織標(biāo)本。

1.4指標(biāo)檢測

1.4.1生化指標(biāo)測定 使用美國BD黃頭采血管(含血清分離膠)采集血液樣本4 mL，靜置30 min后3 000 r/min離心15 min分離血清，隨即對(duì)鉀(K+)、鈉(Na+)、氯(Cl-)、尿素氮(BUN)、血清肌酐(Scr)、總膽紅素(TBIL)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、γ谷氨?；D(zhuǎn)移酶(GGT)、血清堿性磷酸酶(ALP)、缺血修飾性清蛋白(IMA)和肌酸激酶(CK)共計(jì)12項(xiàng)血液生化指標(biāo)，按照北京九強(qiáng)生物技術(shù)有限公司提供的試劑盒說明書在全自動(dòng)生化儀上檢測。

1.4.2病理檢查 SD大鼠解剖暴露胸腹腔后，肉眼觀察并記錄主要臟器形態(tài)特點(diǎn)，摘取心、肺、腎、腦、肌肉和小腸6種組織，經(jīng)10 %多聚甲醛固定、脫水、包埋、切片及染色后，做常規(guī)病理分析，顯微鏡下觀察組織病理改變并拍照記錄。

2 結(jié) 果

2.1致死效應(yīng) 極端高溫高濕組SD大鼠暴露于人工氣候模擬箱提供的極端高溫高濕環(huán)境10 h后開始明顯出現(xiàn)活動(dòng)量減少，呼吸急促，反應(yīng)遲鈍的現(xiàn)象。在20.5 h之前無死亡發(fā)生，27.5 h死亡2只，48.0 h死亡5只，累計(jì)死亡過半剩余6只。SD大鼠的半數(shù)致死時(shí)間為48 h。常溫常濕組SD大鼠在實(shí)驗(yàn)期間反應(yīng)迅速，狀態(tài)無異常，48 h內(nèi)未出現(xiàn)死亡。SD大鼠生存曲線見圖1。

2.2血液生化指標(biāo)檢測結(jié)果 通過對(duì)血液生化指標(biāo)的測定與分析，極端高溫高濕組與常溫常濕組相比，K+、Na+、Cl-、ALT、AST 5項(xiàng)生化指標(biāo)降低但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，ALP和IMA降低差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；BUN、TBIL、GGT和CK升高但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，Scr明顯升高且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。上述各項(xiàng)指標(biāo)的詳細(xì)檢測結(jié)果見表1。

圖1 SD大鼠生存曲線

項(xiàng)目常溫常濕組極端高溫高濕組K+(mmol/L)6.03±0.395.41±1.35Na+(mmol/L)157.45±16.83139.95±3.94Cl-(mmol/L)107.08±13.4598.83±1.88BUN(mmol/L)6.43±1.266.91±1.55Scr(μmol/L)24.50±5.0034.67±6.31aTBIL(μmol/L)0.69±0.291.02±0.33ALT(IU/L)51.60±9.1542.98±8.19AST(IU/L)208.33±25.46180.67±24.02GGT(IU/L)4.48±0.324.50±0.45ALP(IU/L)406.85±61.41281.77±76.47aIMA(U/L)79.38±3.6274.65±1.75aCK(IU/L)1684.30±606.951698.23±205.29

a:P<0.05,與常溫常濕組比較

圖2 兩組心、肺、腎、腦、肌肉、小腸組織病理檢查結(jié)果(HE×100)

2.3病理檢查結(jié)果 解剖發(fā)現(xiàn)與常溫常濕組比較，極端高溫高濕組大鼠肉眼可見心臟顏色暗紅，肺臟輕微充血，小腸與腎臟輕度腫脹，其他臟器無肉眼可見差異。六大臟器的病理檢查發(fā)現(xiàn)，極端高溫高濕組SD大鼠心組織出現(xiàn)輕微心肌纖維水腫伴嗜酸性粒細(xì)胞浸潤；肺組織出現(xiàn)血管擴(kuò)張充血、輕微肺間質(zhì)增寬伴淋巴細(xì)胞浸潤；小腸絨毛排列整齊緊密、黏膜出血且黏膜層內(nèi)有淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞浸潤；腎組織出現(xiàn)間質(zhì)充血伴淋巴細(xì)胞浸潤、腎小球未見血管增生、腎曲小管無濁腫變性；腦和肌肉組織結(jié)構(gòu)完整，無明顯病理改變。常溫常濕組SD大鼠心、肺、腎、腦、肌肉和小腸組織結(jié)構(gòu)完整，無明顯病理改變。病理檢查結(jié)果見圖2。

3 討 論

高溫對(duì)機(jī)體的影響及其機(jī)制已經(jīng)被人們了解，但高濕對(duì)機(jī)體的影響還鮮為人知。本課題組在高濕醫(yī)學(xué)全軍重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室專項(xiàng)資金的資助下，開展了系列高濕環(huán)境暴露對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物機(jī)體傷害的基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究，其中在慢性傷害研究中，課題組為了盡量減少動(dòng)物少食[高溫和(或)高濕時(shí)動(dòng)物主動(dòng)少食]帶來的干擾，采取了間斷性暴露(每天12 h暴露，12 h修整)30 d以上，結(jié)果表明高濕環(huán)境暴露對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)[2]、水通蛋白表達(dá)[3]等存在明顯影響，且高溫與高濕環(huán)境暴露存在協(xié)同效應(yīng)，能夠加重實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的慢性高濕損傷[4]。

本研究旨在模擬我國南方尤其是西南地區(qū)夏季處于極端炎熱和極端高濕的氣候條件，設(shè)置相對(duì)濕度(95±5)%、環(huán)境溫度(35.0±0.5) ℃，使SD大鼠24 h不間斷暴露于上述極端高溫高濕環(huán)境中，發(fā)現(xiàn)48 h暴露即可導(dǎo)致半數(shù)實(shí)驗(yàn)大鼠死亡，提示極端高溫高濕環(huán)境暴露對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物具有致死效應(yīng)。在接下來對(duì)暴露48 h仍然存活實(shí)驗(yàn)大鼠的研究中，本研究將極端高溫高濕組與常溫常濕組各項(xiàng)血清學(xué)檢測指標(biāo)和病理檢查結(jié)果進(jìn)行了逐一比較發(fā)現(xiàn)：(1)暴露48 h存活SD大鼠的血清電解質(zhì)(K+、Na+、Cl-)無明顯變化，提示極端高溫高濕環(huán)境暴露48 h內(nèi)存活SD大鼠體內(nèi)滲透壓平衡未受明顯影響。(2)暴露48 h存活SD大鼠的血清BUN和Scr水平均出現(xiàn)升高，其中Scr升高差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，同時(shí)病理檢查也提示腎組織出現(xiàn)間質(zhì)充血伴淋巴細(xì)胞浸潤，上述結(jié)果表明極端高溫高濕環(huán)境對(duì)腎臟造成了明顯的病理損傷，提示腎功異常是極端高溫高濕環(huán)境暴露引起SD大鼠急性死亡的重要原因。該結(jié)果與本課題組楊蕓等[3]在高濕環(huán)境致SD大鼠慢性傷害研究中[環(huán)境溫度(25.0±0.5)℃，相對(duì)濕度(90±2)%，連續(xù)間斷暴露30 d]的結(jié)果一致。(3)暴露48 h存活SD大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT均出現(xiàn)降低，其中ALP降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，血清TBIL升高但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，據(jù)此本研究認(rèn)為極端高溫高濕暴露可導(dǎo)致血清酶水平降低。程建波等[5]認(rèn)為機(jī)體可以通過體溫調(diào)節(jié)中樞抑制甲狀腺功能進(jìn)而引起ALP降低支持了本研究發(fā)現(xiàn)；但是上述結(jié)果與汪曉[6]的研究報(bào)道明顯不同，汪曉采用環(huán)境濕度(35±2)℃、相對(duì)濕度(80±10)%氣候條件，用1.00 mA電流電擊大鼠強(qiáng)迫實(shí)驗(yàn)大鼠運(yùn)動(dòng)力竭，并在大鼠被迫運(yùn)動(dòng)15 min時(shí)采樣檢測，因此本研究認(rèn)為汪曉的研究結(jié)果需要排除電擊、恐慌和極限運(yùn)動(dòng)等帶來的影響才能反映環(huán)境溫度和濕度對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠的影響。(4)暴露48 h存活SD大鼠的血清CK水平出現(xiàn)升高，病理檢查中肌肉和腦組織結(jié)構(gòu)完整、無明顯病理改變，僅在心臟組織中發(fā)現(xiàn)存在輕微心肌纖維水腫伴嗜酸性粒細(xì)胞浸潤的情況，說明極端高溫高濕環(huán)境暴露可致大鼠心臟病理損傷，是極端高溫高濕環(huán)境暴露引起SD大鼠死亡的又一重要原因。(5)暴露48 h存活SD大鼠的血清IMA水平顯著性下降；血清蛋白(serum albumin，ALB)由肝臟合成，在ALB的氨基末端存在與銅、鈷、鎳等過渡金屬離子結(jié)合的位點(diǎn)，當(dāng)體內(nèi)出現(xiàn)組織缺血缺氧的氧化應(yīng)激[7]及組織炎癥[8]時(shí)，ALB氨基末端序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸發(fā)生N-乙?；?、缺失或替換，ALB即轉(zhuǎn)變成為了IMA，與上述過渡金屬離子的結(jié)合能力降低，因此血清IMA水平能反映組織缺血缺氧的氧化應(yīng)激程度及組織的炎癥程度，臨床上已經(jīng)將血清IMA作為心肌缺血等的靈敏指標(biāo)[9]；理論上，高溫環(huán)境暴露可導(dǎo)致體內(nèi)血液由內(nèi)臟轉(zhuǎn)向皮膚，引起機(jī)體臟器處于相對(duì)缺血缺氧的狀態(tài)，本研究在心、肺、腎及小腸病理檢查中均觀察到了存在炎性細(xì)胞浸潤，筆者預(yù)期高溫會(huì)導(dǎo)致血清IMA升高，但本研究卻發(fā)現(xiàn)血清IMA下降，具體原因有待進(jìn)一步探討。

總之，通過對(duì)極端高溫高濕環(huán)境下大鼠生存情況、血液生化指標(biāo)及主要臟器病理損傷的監(jiān)測，加深了極端高溫高濕環(huán)境對(duì)機(jī)體生理病理影響的認(rèn)識(shí)。極端高溫高濕環(huán)境暴露引起生化指標(biāo)的改變與病理損傷存在哪些聯(lián)系，這一過程中生化指標(biāo)隨暴露時(shí)間的變化及哪些通路的改變引起了這一系列變化，這都有待進(jìn)一步研究。

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TheexperimentalresearchoftheSDratsexposedtothehigh-temperatureandhigh-humidityenvironment*

LiuGang1,2,LiuShiying2,HuangWurong2,JianYi3,HuYonghe4,WuLijuan2△

(1.SchoolofLifeScienceandEngineering,SouthwestJiaotongUniversity,Chengdu,Sichuan610031,China;2.DepartmentofTranslationalMedicine/KeyLaboratoryofHighHumidityMedicine,ChengduMilitaryGeneralHospital,Chengdu,Sichuan610083,China;3.DepartmentofPathology,ChengduMilitaryGeneralHospitalofPLA,Chengdu,Sichuan610083,China;4.DepartmentofTraditionalChineseMedicine,ChengduMilitaryGeneralHospital,Chengdu,Sichuan610083,China)

ObjectiveTo investigate the effect of extremely high temperature and high humidity exposure on the survival and blood biochemical indexes of SD rats and the to the major organs.MethodsTwenty - six SD rats were divided into the normal temperature and humidity group and the extremely high-temperature and high-humidity group.The mortality of SD rats in extremely high-temperature and high humidity environment was observed,and at the median lethal time,the living rats were undergoing the tests of serum biochemical indicators and the pathological examination of the heart,lung,kidney,brain,muscles and intestinal tissues.ResultsThe exposure to the extremely high-temperature and high-humidity environment could lead to the death of SD rats,the median lethal time was 48 h.The serum creatinine(Scr) increased significantly(P<0.05),and the serum alkaline phosphatase(ALP) and ischemia modified albumin (IMA) decreased significantly (P<0.05) when compared with the normal temperature and humidity group,and there was no significant difference in other biochemical indicators.The inflammatory cell infiltration was observed in heart,lung,kidney and intestines,and there were no obvious pathological changes in brain and muscle.ConclusionThe exposure to the extremely high-temperature and high-humidity environment has obvious lesion on SD rats,it can lead to the abnormality of some biochemical indicators,the inflammatory changes in heart,lung,kidney and intestines,and even death.

] high-temperature;high-humidity;environmental exposure;rats,Sprague-Dawley;biological markers;pathology,clinical

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.36.005

四川省科技廳青年科技創(chuàng)新研究團(tuán)隊(duì)資助(2013TD0016)。

劉剛(1991-),碩士，主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究?！?/p>

，E-mail:wulijuan1638@126.com。

Q494

A

1671-8348(2017)36-5052-03

2017-07-07

2017-08-09)