李 磊，李 冉，劉 江，劉 銳，楊國(guó)海，張艷波△

(1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科,河北承德 067000；2.華北理工大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)系,河北唐山 063000;

3.河北省唐山市工人醫(yī)院口腔科 063000；4.華北理工大學(xué)解剖學(xué)系，河北唐山 063000)

論著·臨床研究

自噬調(diào)控因子mTOR和Beclin1在良惡性多形性腺瘤中的表達(dá)及意義*

李 磊1，李 冉2，劉 江3，劉 銳1，楊國(guó)海4，張艷波1△

(1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科,河北承德 067000；2.華北理工大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)系,河北唐山 063000;

3.河北省唐山市工人醫(yī)院口腔科 063000；4.華北理工大學(xué)解剖學(xué)系，河北唐山 063000)

目的研究自噬調(diào)控中的主要因子西羅莫司靶蛋白(mTOR)及Beclin1在良、惡性多形性腺瘤中的表達(dá)及意義。方法采用免疫組織化學(xué)顯色檢測(cè)Beclin1在35例腮腺瘤多形性腺瘤(CPA)，37例腮腺良性多形性腺瘤(PA)和20例正常腮腺組織中的表達(dá)情況。用蛋白免疫印跡法(Western blot)測(cè)定p-mTOR 、Beclin1在CPA、PA及正常腮腺組織中的表達(dá)情況。結(jié)果p-mTOR 在正常腮腺組織，PA，CPA中的陽性表達(dá)呈遞增的趨勢(shì)，三者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Beclin1在3種組織中表達(dá)呈遞減趨勢(shì),三者間差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論mTOR信號(hào)因子在CPA組織中過度表達(dá)，而Beclin1在CPA組織中的陽性表達(dá)受到抑制。

自噬;他克莫司結(jié)合蛋白質(zhì)類;Beclin 1；癌在多形性腺瘤

多形性腺瘤(pleomorphic adenoma，PA)又名混合瘤，多發(fā)生于腮腺，手術(shù)切除后常容易復(fù)發(fā)，生長(zhǎng)一段時(shí)期后，突然加速生長(zhǎng)，多為惡變。目前研究顯示，腫瘤的發(fā)生常伴隨著細(xì)胞自噬活性的改變，其調(diào)控機(jī)制及自噬通路相關(guān)蛋白在良、惡性腫瘤，如癌在多形性腺瘤(carcinoma in pleomorphic adenoma，CPA)中的作用尚不清楚，本課題將進(jìn)一步研究自噬相關(guān)因子在良、惡性腫瘤中的作用。

西羅莫司靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)和Beclin1都有介導(dǎo)自噬發(fā)生的作用，并形成mTOR-Beclin1交互調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，調(diào)節(jié)自噬。有研究證明 PI3K-Akt/TSC1/2-mTOR 信號(hào)通路在腫瘤的生成生長(zhǎng)中起重要作用，在肝癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌等均有報(bào)道[1-2]。本研究通過對(duì)PI3K/Akt-TSC1/2-mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白磷酸化mTOR(p-mTOR)及自噬相關(guān)蛋白Beclin1表達(dá)的檢測(cè)，分析其與腮腺良、惡性腫瘤的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1材料與試劑 所用組織來源于唐山市工人醫(yī)院和承德附屬醫(yī)院口腔外科手術(shù)病理組織，其中CPA組織35例， 腮腺組織37 例，正常腮腺組織20例。所有手術(shù)標(biāo)本有2名醫(yī)師進(jìn)行病理驗(yàn)證，且患者術(shù)前未進(jìn)行放療、化療等治療。p-mTOR、Beclin 1單克隆抗體均購(gòu)自Santa Cruz公司。

1.2免疫組織化學(xué)檢測(cè) 石蠟切片按常規(guī)脫蠟置水，3%過氧化氫孵育10 min(室溫下)，清洗后加正常山羊血清于切片封閉，室溫孵育10 min滴加1∶400一抗工作液，37 ℃ 孵育 1～2 h，切片加生物素標(biāo)記的二抗工作液，室溫孵育15～30 min后滴加適量辣根過氧化物酶工作液孵育。切片滴加DAB顯色，組織細(xì)胞著棕黃色后終止反應(yīng)，以蘇木素復(fù)染、分色，切片脫水透明后封片。陰性對(duì)照組不加一抗以PBS替代。

1.3Western blot法半定量分析Beclin1、p-mTOR表達(dá)情況 4 ℃預(yù)冷的細(xì)胞裂解液裂解保存的組織，冰浴中用勻漿器將組織勻漿， 4 ℃ 30 min后提取上清液，以微孔酶標(biāo)儀法進(jìn)行蛋白定量，樣品處理后加樣，轉(zhuǎn)膜并加抗靶蛋白的特異性一抗，以牛血清清蛋白(BSA)溶液稀釋，其中Beclin1稀釋比例1∶500，p-mTOR稀釋比例1∶1 000，加針對(duì)一抗的堿性磷酸酶偶聯(lián)二抗于室溫下孵育，經(jīng)自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)半定量分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。應(yīng)用Image J醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)在同一條件下測(cè)定目標(biāo)條帶整合光密度值，計(jì)算出各組樣品目標(biāo)條帶與內(nèi)參(β-actin)比值大小作為分析對(duì)象進(jìn)行比較。

A:正常腮腺;B:PA;C:CPA

圖1 Beclin1在各組織中的表達(dá)(免疫組織化學(xué)×400)

1.4免疫組織化學(xué)結(jié)果評(píng)價(jià) 將細(xì)胞質(zhì)內(nèi)染色為棕黃色顆粒標(biāo)記為陽性細(xì)胞。由2名病理科醫(yī)師觀察10個(gè)高倍視野，采用雙盲法閱片，以每個(gè)視野100個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)，以陽性細(xì)胞率和陽性細(xì)胞染色深度進(jìn)行細(xì)胞陽性率評(píng)定。陽性細(xì)胞率：1分，陽性細(xì)胞數(shù)比率占細(xì)胞總數(shù)小于10%；2分，陽性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)10%～50%；3分，陽性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)大于50%。染色深度：0分為無染色標(biāo)記；1分為淡黃色標(biāo)記，2分為黃色標(biāo)記，3分為棕黃色標(biāo)記。2項(xiàng)評(píng)分相乘即為總評(píng)分，陰性0～3分，陽性4分及以上。結(jié)果定量：免疫組織化學(xué)陽性分析經(jīng)自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量。

2 結(jié) 果

2.1Beclin1在正常、PA、CPA腮腺組織中的表達(dá) Beclin1在正常、PA、CPA腮腺組織中的陽性率分別為100%、89%、56%(圖1)，三者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A：Western blot；B：Western blot分析圖；a:P<0.05比較，與正常腮腺組織;b:P<0.05，與PA組腮腺組織比較

圖2 p-mTOR在正常、PA和

CPA腮腺組織中的表達(dá)

2.2Western blot法檢測(cè)p-mTOR、Beclin1在各組織中的表達(dá)結(jié)果 p-mTOR在3種腮腺組織中均有表達(dá)，其表達(dá)量在正常、PA、CPA腮腺組織中呈遞增趨勢(shì)，三者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。Beclin1在正常、PA、CPA、腮腺組織中的表達(dá)呈遞減趨勢(shì)，三者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

A：Western blot；B：Westerh blot分析圖；a:P<0.05，與正常腮腺組織比較;b:P<0.05，與PA比較

圖3 Beclin1在正常、PA和CPA腮腺組織中的表達(dá)

3 討 論

自噬是真核細(xì)胞特有的生命現(xiàn)象，是亞細(xì)胞水平變化的一種進(jìn)化保守的細(xì)胞功能。在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中都存在細(xì)胞自噬及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的改變。本課題組前期研究顯示，自噬相關(guān)蛋白LC3在腮腺PA及CPA中表達(dá)下調(diào)，提示自噬功能改變可能在腮腺腫瘤形成中具有一定作用[3]。mTOR和Beclin1是自噬調(diào)控的重要因子，在Beclin1調(diào)節(jié)自噬的網(wǎng)絡(luò)功能中mTOR細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通道的作用及之間存在的相互反饋調(diào)控機(jī)制的研究也是當(dāng)今熱點(diǎn)問題之一[4]。

mTOR屬于磷脂酰肌醇激酶相關(guān)激酶蛋白家族成員，是細(xì)胞調(diào)節(jié)的主要激酶。調(diào)控著大量促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程的蛋白質(zhì)的翻譯，異常的mTOR活性與大量的人類癌癥有著密切的關(guān)系。mTOR在自噬的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要調(diào)控作用，是自噬調(diào)控通路上的關(guān)鍵位點(diǎn)。mTOR作為下游信號(hào)分子，可以直接被AKT激活，也可以通過抑制TSC來激活。Johnson等[5]在對(duì)直結(jié)腸癌的分析研究中顯示p-mTOR的表達(dá)明顯高于正常黏膜組織。Guo等[6]對(duì)患有腎囊腺瘤的小鼠使用西羅莫司進(jìn)行治療，4周后測(cè)量腫瘤體積顯著減小，同時(shí)發(fā)現(xiàn)mTOR的表達(dá)量下降，這顯示mTOR在腎囊腺瘤的發(fā)展中起到了重要的作用。本試驗(yàn)探討了mTOR信號(hào)通路在腮腺CPA、正常腮腺組織、良性PA中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)p-mTOR在大部分腮腺PA中呈過度表達(dá)。p-mTOR在正常腮腺組織、良性PA、CPA中的陽性表達(dá)呈遞增趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示mTOR信號(hào)通路在腮腺CPA組織中表達(dá)異常，可能在腮腺CPA的發(fā)生、發(fā)展中起到了重要的作用。

Beclin1基因是人們?cè)谘芯恐滤繱inbis病毒性腦炎大鼠過程中，在其中分離出的一個(gè)與腫瘤抑制相關(guān)的基因[7]，Beclin1蛋白由4個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成：卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域、BH3、進(jìn)化保守結(jié)構(gòu)域和核輸出結(jié)構(gòu)域[8]，通過這些結(jié)構(gòu)域形成復(fù)合體定位于自噬體膜上從而介導(dǎo)自噬，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Beclin1復(fù)合體與含有BH3結(jié)構(gòu)域的Bcl-2結(jié)合后可改變細(xì)胞自噬進(jìn)程，并且Beclin1與Bcl-2的作用受環(huán)境影響較大，當(dāng)環(huán)境養(yǎng)分減少時(shí)自噬基因Beclin1和Bcl-2之間的相互作用顯著減少。研究發(fā)現(xiàn)在子宮頸癌[9]、結(jié)腸癌、卵巢癌[10]等多種腫瘤中都發(fā)現(xiàn)表達(dá)異常的Beclin1蛋白。本試驗(yàn)用Western blot法測(cè)定Beclin1在35例CPA、37例PA和20例正常腮腺組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示在正常腮腺組織Beclin1有較高水平表達(dá)，在PA中表達(dá)較低，在CPA中表達(dá)最低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示Beclin1的表達(dá)降低可能與CPA的形成及病理進(jìn)程密切相關(guān)，可作為判斷惡性多形性腺瘤的預(yù)后的輔助指標(biāo)，同時(shí)有望成為其生物治療的新靶點(diǎn)。

自噬調(diào)控因子mTOR和Beclin1是介導(dǎo)調(diào)控自噬的重要因子，在細(xì)胞自噬中扮演重要角色，其在腫瘤中的表達(dá)異常可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要意義，其分子學(xué)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

[1]Huang GM,Jiang QH,Cai C,et al.SCD1 negatively regulates autophagy-induced cell death in human hepatocellular carcinoma through inactivation of the AMPK signaling pathway[J].Cancer Lett,2015,358(2)；180-190.

[2]Prasad R,Vaid M,Katiyar SK,et al.Grape proanthocyanidin inhibit pancreatic cancer cell growth in vitro and in vivo through induction of apoptosis and by targeting the PI3K/Akt pathway[J].PLoS One,2012,7(8):e43064.

[3]李冉，李磊，劉江，等.Beclin 1 與LC3 蛋白在腮腺多形性腺瘤及腮腺癌在多形性腺瘤中的表達(dá)和意義[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012,34(13)：1293-1295.

[4]Kang R,Zeh HJ,Lotze MT,et al.The Beclin 1 network regulates autophagy and apoptosis [J].Cell Death Differ,2011,18(4)：571-580.

[5]Johnson SM,Gulhati P,Rampy BA,et al.Novel expression patterns of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway components in colorectal cancer[J].J Am Coll Surg,2010,210(5):767-778.

[6]Guo Y,Kwiatkowski DJ.Equivalent benefit of rapamycin and a potent m TOR ATP-competitive inhibitor,MLN0128(INK128),in a mouse model of tuberous sclerosis[J].Mol Cancer Res,2013,11(5)：467-473.

[7]Cao Y,Klionsky DJ．Physiological functions of Atg6/Beclin1：a unique autophagy- related protein[J].Cell Res,2007,17(10)：839-849.

[8]Oberstein A,Jeffrey PD,Shi Y.Crystal structure of the Bcl-XL Beclin 1 peptide complex：Beclin-1 is a novel BH3 only protein[J].J Biol Chem,2007,282(17)：13123-13132.

[9]Cheng HY,Zhang YN,Wu QL,et al.Expression of beclin 1,an autophagy-related protein,in human cervical carcinoma and its clinical significance [J].Eur J Gynaecol Oncol,2012,33(1)：15-20.

[10]Miracco C,Cosci E,Oliveri G,et al.Protein and mRNA expression of autophagy gene Beclin-1 in human brain tumours [J].Int J Col,2007,30(2)：429-436.

ExpressionandsignificanceofautophagicregulatoryfactormTORandBeclin1inbenignandmalignantpleomorphicadenoma*

LiLei1,LiRan2,LiuJiang3,LiuRui1,YangGuohai4，ZhangYanbo1△

(1.DepartmentofStomatology,AffiliatedStomatologyHospitalofChengdeMedicalCollege,Chengde,Hebei067000,China2.FacultyofHistologyandEmbryology，NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan,Hebei063000,China；3.DepartmentofStomatology，Workers′HospitalofTangshanCity,Hebei067000,China；4.FacultyofAnatomy,NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan,Hebei063000,China)

ObjectiveTo explore the expression and significance of main autophagic regulatory factors of mTOR and Beclin1 in benign and malignant pleomorphic adenoma.MethodsThe expression of Beclin1 in 35 cases of carcinoma in parotid pleomorphic adenoma(CPA),37 cases of benign pleomorphic adenoma(PA) and 20 cases and normal parotid tissues was measured by adopting the immunohistochemical staining method.The expression of p-mTOR and Beclin1 in CPA,PA and normal parotid tissues was measured by Western blot.ResultsThe positive expression of p-mTOR in normal parotid tissue,parotid pleomorphic adenoma and parotid pleomorphic adenoma showed the increasing trend,and the difference among them was statistically significant(P<0.05).The Beclin1 level in 3 kinds of tissue showed the descending trend,the difference among the three tissues was statistically significant(P<0.05).ConclusionmTOR signal factor is over-expressed in CPA tissue,while the positive expression of Beclin 1 is inhibited in CPA tissue.

] autophagy;tacrolimus binding proteins;Beclin 1;carcinoma in pleomorphic adenoma

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.36.015

河北省重點(diǎn)科技研究計(jì)劃(20130338，20150079)；河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(H2014105079)。

李磊(1978-)，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事口腔臨床研究?！?/p>

，E-mail:13831476354@163.com。

R739.87

A

1671-8348(2017)36-5083-03

2017-08-09

2017-09-11)