羅禮云 李玥 彭湖 危小良 林岫芳

基礎(chǔ)研究

左旋精氨酸對急性心肌梗死大鼠血管新生的影響及心肌保護(hù)作用

羅禮云 李玥 彭湖 危小良 林岫芳

目的 觀察左旋精氨酸干預(yù)對急性心肌梗死（AMI）大鼠心肌梗死邊緣區(qū)血管新生的影響及心肌保護(hù)作用。方法 冠狀動脈結(jié)扎法建立大鼠AMI模型，30只SD雄性大鼠被隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組、生理鹽水對照組及左旋精氨酸干預(yù)組。在冠狀動脈結(jié)扎后4周，超聲心動圖測量大鼠心臟左室舒張末內(nèi)徑（LVEDD）、左室收縮末內(nèi)徑（LVESD）、左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左室短縮分?jǐn)?shù)（LVFS），Masson染色測定梗死面積，ELISA法檢測各組大鼠血漿腦鈉尿肽（BNP）水平；采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測大鼠心肌梗死邊緣區(qū)CD31陽性的內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量及α-SMA陽性平滑肌細(xì)胞數(shù)量，以評估新生血管情況，Western blot檢測梗死邊緣區(qū)內(nèi)皮型一氧化氮合成酶（eNOS）及膠原-Ⅰ蛋白含量。結(jié)果 冠狀動脈結(jié)扎術(shù)后4周，與生理鹽水對照組相比，左旋精氨酸干預(yù)組 LVEF（48.20%比 35.20%，P＜0.01）、LVFS（24.10%比 17.38%，P＜0.01）明顯升高，而LVEDD（7.82 mm 比 9.06 mm，P＜0.01）及 LVESD（6.29 mm 比 7.32 mm，P＜0.01）降低；梗死面積明顯縮?。?5.11%比 35.02%，P＜0.01）；血漿 BNP水平亦較低（872.33 pg/ml比 1203 pg/ml，P＜0.01）；而梗死邊緣區(qū)CD31陽性的內(nèi)皮細(xì)胞高于生理鹽水對照組（101.4/mm2比34.8/mm2，P＜0.01），α-SMA陽性平滑肌細(xì)胞密度亦高于對照組（20.2/mm2比7.2/mm2，P＜0.01）；梗死周圍區(qū)eNOS蛋白水平高于對照組，而膠原-Ⅰ蛋白含量則低于對照組（P＜0.01）。結(jié)論 左旋精氨酸干預(yù)可促進(jìn)AMI大鼠梗死心肌邊緣區(qū)毛細(xì)血管及小動脈新生，減少膠原-1蛋白含量，促進(jìn)eNOS的表達(dá)，并具有改善左心收縮功能、降低血漿BNP水平、縮小梗死面積的心肌保護(hù)作用。

急性心肌梗死； 血管新生； 左旋精氨酸

為減少急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）患者死亡率，改善其心功能及臨床轉(zhuǎn)歸，應(yīng)用輔助性治療方法改善AMI預(yù)后的手段包括干細(xì)胞移植、細(xì)胞因子治療的研究受到國內(nèi)外學(xué)者的重視[1]。治療性血管新生（therapeutic neovascularization）是一種有前景的治療缺血性心臟病的方法，是指采取一定的治療措施促進(jìn)缺血區(qū)或其邊緣區(qū)血管新生，通過促進(jìn)缺血區(qū)域側(cè)支循環(huán)的開放及新生血管的形成，從而緩解心肌缺血[2,3]。在諸多可能促進(jìn)血管生長的物質(zhì)中，左旋精氨酸（L-Arginine）因其具有促進(jìn)血管新生及改善血管內(nèi)皮功能的雙重作用而成為研究的熱點(diǎn)[4]。

左旋精氨酸是一種半必需氨基酸，可在缺氧條件下上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子表達(dá)，降低各種因子在缺氧條件下對內(nèi)皮細(xì)胞的損傷及改善血管內(nèi)皮功能，對缺血區(qū)域血管新生具有明顯的促進(jìn)作用[5]，但左旋精氨酸是否可改善心肌梗死后心室重塑尚未完全明確。本研究擬從血管新生及對心肌膠原-1表達(dá)的影響兩方面探討左旋精氨酸心肌保護(hù)作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物和試劑 30只SPF級雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠，體重 250～300 g，由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。戊巴比妥鈉購自上海西唐科技有限公司，重組PIGF-2購自美國R&D Systems公司，抗CD31抗體、一抗膠原-Ⅰ購自美國Abcam公司，α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）抗體購自美國Novus公司，大鼠血漿腦鈉尿肽ELISA試劑盒由武漢華美生物科技（CUSABIO）提供。

1.2 大鼠急性心肌梗死模型建立及分組 大鼠被隨機(jī)分為假手術(shù)組、生理鹽水對照組及左旋精氨酸組，每組10只。大鼠心肌梗死模型建立步驟如下[6]：稱重后1%戊巴比妥（30～45 mg/kg）腹腔內(nèi)注射麻醉，經(jīng)口行氣管插管成功后連接小動物呼吸機(jī)（呼吸機(jī)參數(shù)：呼吸比2∶1，潮氣量30 ml/kg，呼吸頻率65～80次/min），于左胸前區(qū)第3、4肋間行胸廓切開術(shù)，暴露心臟，撕開心包膜，左心耳下緣2～3 mm處用6-0縫合線結(jié)扎左冠狀動脈，進(jìn)針深度約2 mm（假手術(shù)組只穿線，不結(jié)扎）。結(jié)扎后肉眼可見結(jié)扎局部下方和左心室前壁呈灰白至發(fā)紺，Ⅱ?qū)?lián)心電圖R波增高伴明顯切跡（ST段抬高）并持續(xù)15 min以上即為心肌梗死結(jié)扎成功標(biāo)志。確認(rèn)模型建立成功后10 min，逐層縫合胸腔，逐漸撤停呼吸機(jī)恢復(fù)自主呼吸。待大鼠呼吸穩(wěn)定清醒后拔出氣管插管，放入籠內(nèi)繼續(xù)飼養(yǎng)（室溫24℃～26℃）。術(shù)后24 h進(jìn)行分組干預(yù)。生理鹽水對照組：應(yīng)用生理鹽水灌胃，劑量為 10 ml·kg-1·d-1，直至術(shù)后 4 周。左旋精氨酸治療組：應(yīng)用左旋精氨酸灌胃治療，劑量為100 mg·kg-1·d-1，直至術(shù)后 4 周。假手術(shù)組：只開胸，不結(jié)扎冠狀動脈。

1.3 超聲心動圖評估心臟結(jié)構(gòu)及功能 冠狀動脈結(jié)扎術(shù)前及術(shù)后4周，麻醉狀態(tài)下進(jìn)行大鼠經(jīng)胸超聲心動圖檢查（飛利浦IE33，12 MHZ探頭），以胸骨旁短軸切面，M超測量左室舒張末內(nèi)徑（LVEDD）、左室收縮末內(nèi)徑（LVESD）。左室短縮分?jǐn)?shù)（LVFS）=（LVEDD-LVESD）/LVEDD×100%。根據(jù)Teichholz公式[7]計(jì)算左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）：左室收縮末體積（LVESV）=（7.0×LVESD3）/（2.4+LVESD）左室舒張末體積（LVEDV）=（7.0×LVEDD3）/（2.4+LVEDD）左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）=（LVEDV-LVESV）/LVEDV×100%

1.4 Masson染色梗死面積測定 冠脈結(jié)扎后4周，處死大鼠后迅速開胸切取心臟，用生理鹽水清洗并去除心腔內(nèi)殘余血液，在長軸中點(diǎn)處垂直于長軸將左心室一分為二，心尖側(cè)的一半心肌組織于4%甲醛溶液中固定，保存24 h后經(jīng)石蠟包埋，取5 μm厚的切片行病理組織學(xué)檢查。Masson染色定量測定梗死面積，壞死瘢痕組織被染為藍(lán)色，存活心肌組織被染為紅色。應(yīng)用圖像處理軟件Image J測量梗死面積并取平均值[8]。梗死面積=（瘢痕內(nèi)弧長+瘢痕外弧長）/（外周長+內(nèi)周長）×100%。

1.5 ELISA法檢測各組大鼠血漿腦鈉尿肽（BNP）濃度 冠脈結(jié)扎后4周，戊巴比妥腹腔注射麻醉，切取心臟標(biāo)本前先從腹主動脈抽取動脈血，以3000 r/min離心10 min，去除顆粒后分裝保存于-70℃冰箱備用。按照大鼠鈉尿肽ELISA檢測試劑盒（CBS-E07972R，CUSABIO，中國）說明書提供的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行檢測[9]。

1.6 免疫組化檢測梗死邊緣區(qū)血管新生 采用免疫組化技術(shù)檢測大鼠心肌梗死邊緣區(qū)血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子（CD31）陽性的內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量，評估新生毛細(xì)血管情況；檢測抗α平滑肌肌動蛋白（α-SMA）陽性平滑肌細(xì)胞數(shù)量，以評估新生小動脈情況[10]。將組織切片在室溫中放置60 min或60℃恒溫箱中烘烤20 min，脫蠟和水化后用蒸餾水或PBS配置新鮮的3%H2O2，室溫封閉5～10 min，PBS洗3次，每次2 min。滴加封閉液，室溫10 min，滴加一抗（抗CD31抗體/α-SMA抗體），4℃過夜，滴加羊抗或兔IgG抗體-HRP多聚體，室溫孵育1 h，DAB顯色，蒸餾水洗后脫水、透明，中性樹脂50 μl封片，選擇5個梗死區(qū)視野，計(jì)算CD31陽性微血管數(shù)量（200倍目鏡下）及α-SMA陽性血管數(shù)量（100倍目鏡下）。

1.7 Western blot檢測梗死邊緣區(qū)膠原-1蛋白含量 收集細(xì)胞蛋白后，采用6%聚丙烯酰胺凝分離目的蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉后，將一抗膠原-Ⅰ（使用濃度1∶3000）4℃孵育過夜后，用TBST每次7 min洗2次后，用相應(yīng)的稀釋好的二抗（HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗，使用濃度1∶3000）室溫下孵育1～2 h后，TBST每次7 min洗3次后，行化學(xué)發(fā)光顯影（ECL）[11]。用Image J分析目標(biāo)條帶的光密度值。以bata-actin（使用濃度1∶5000）作為內(nèi)參照，比較不同處理后蛋白表達(dá)的差異。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用IBM SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)采用±s表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（正態(tài)分布資料）或Kruskal-Wallis檢驗(yàn)（非正態(tài)分布資料），兩組間均數(shù)比較采用Post-hoc檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 超聲心動圖對大鼠心功能的評估 在冠脈結(jié)扎前，超聲心動圖測得LVEDD、LVESD、LVEF及LVFS各項(xiàng)指標(biāo)在各組大鼠之間比較未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。冠脈結(jié)扎后4周，超聲心動圖檢查發(fā)現(xiàn)心肌梗死組（對照組）大鼠心室前壁運(yùn)動減弱或消失，反映心室收縮功能的指標(biāo)LVEF、LVFS較假手術(shù)組顯著降低，LVEDD及LVESD則顯著升高（P＜0.01）。與生理鹽水對照組相比，左旋精氨酸組LVEF、LVFS明顯升高，而LVEDD及LVESD明顯降低（P＜0.01）。見表1、圖 1。

2.2 梗死面積測定 冠脈結(jié)扎后4周，Masson染色結(jié)果見圖2。與生理鹽水對照組相比，左旋精氨酸組梗死面積明顯減?。≒＜0.01），見表2。

表1 三組大鼠超聲心動圖結(jié)果比較（±s）

表1 三組大鼠超聲心動圖結(jié)果比較（±s）

注：LVEDD：左室舒張末內(nèi)徑；LVESD：左室收縮末內(nèi)徑；LVEF：左室射血分?jǐn)?shù)；LVFS：左室短縮分?jǐn)?shù)。與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與生理鹽水組比較，bP＜0.01

組別 LVEDD（mm） LVESD（mm） LVEF（%） LVFS（%）假手術(shù)組 6.61±0.86 3.94±0.20 79.06±2.89 43.10±3.24生理鹽水組 9.06±0.23a 7.32±0.30a 35.20±0.91a 17.38±0.64a左旋精氨酸組 7.82±0.36ab 6.29±0.17ab 48.20±1.06ab 24.10±0.50ab

表2 三組大鼠梗死面積比較（±s）

表2 三組大鼠梗死面積比較（±s）

注：與生理鹽水組比較，aP＜0.01

組別 梗死面積（%）假手術(shù)組 0生理鹽水組 35.02±2.40左旋精氨酸組 25.11±2.17a

2.3 各組大鼠血漿BNP濃度比較 單因素方差分析發(fā)現(xiàn)，三組間BNP濃度存在明顯差異（P＜0.01）。進(jìn)一步兩組間比較（Post-hoc檢驗(yàn)）發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組血漿BNP濃度最低；與生理鹽水組相比，左旋精氨酸組血漿BNP濃度水平明顯降低（P＜0.01，表3）。

表3 三組大鼠血漿BNP濃度比較（±s）

表3 三組大鼠血漿BNP濃度比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.01；與生理鹽水組比較，bP＜0.01

組別 血漿 BNP 濃度（pg/ml）假手術(shù)組 141.00±10.62生理鹽水組 1203.00±100.64a左旋精氨酸組 872.33±78.90ab

2.4 各組大鼠梗死周圍區(qū)新生血管比較 各組大鼠梗死周圍區(qū)內(nèi)皮細(xì)胞中CD31免疫組織化學(xué)測定結(jié)果見圖3。單因素方差分析發(fā)現(xiàn)，毛細(xì)血管密度（CD31陽性細(xì)胞數(shù)量/mm2）在各組間存在差異（P＜0.05），其中假手術(shù)組最高（169.20±5.78）/mm2；Post-hoc檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，左旋精氨酸組毛細(xì)血管密度為（101.40±6.74）/mm2，高于生理鹽水組的（34.80±5.15）/mm2（P＜0.01，表4）。α-SMA陽性細(xì)胞數(shù)量在各組之間亦存在明顯差異（圖4），假手術(shù)組為（42.00±4.56）/mm2，高于其他兩組；左旋精氨酸組小動脈密度（α-SMA陽性細(xì)胞數(shù)量/mm2）（20.20±3.12）/mm2，明顯高于對照組（7.2±1.72）/mm2（P＜0.01）。見表5。

2.5 大鼠梗死周圍區(qū)內(nèi)皮型一氧化氮合成酶（eNOS）及膠原-Ⅰ蛋白表達(dá)水平檢測 心肌梗死后4周，Western blot檢測到生理鹽水組eNOS表達(dá)水平最低，而左旋精氨酸組eNOS表達(dá)水平較對照組顯著升高；假手術(shù)組膠原-Ⅰ蛋白含量最低，以假手術(shù)組作為參照，與生理鹽水組相比，左旋精氨酸組膠原-1蛋白含量較低（P＜0.01）。見圖5。

表4 三組大鼠梗死周圍區(qū)CD31陽性細(xì)胞數(shù)量比較（±s）

表4 三組大鼠梗死周圍區(qū)CD31陽性細(xì)胞數(shù)量比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.01；與生理鹽水組比較，bP＜0.01

假手術(shù)組 169.20±5.78生理鹽水組 34.80±5.15左旋精氨酸組 101.40±6.74ab

表5 三組大鼠梗死周圍區(qū)小動脈數(shù)量比較（±s）

表5 三組大鼠梗死周圍區(qū)小動脈數(shù)量比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.01；與生理鹽水組比較，bP＜0.01

假手術(shù)組 42.00±4.56生理鹽水組 7.20±1.72a左旋精氨酸組 20.20±3.12ab

3 討論

目前成熟的再灌注治療特別是直接經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI）可迅速開通AMI患者的梗死相關(guān)動脈，盡快恢復(fù)心肌正常血供是改善患者預(yù)后的關(guān)鍵[12]。但相當(dāng)部分患者由于條件所限并未得到及時再灌注治療，即使進(jìn)行再灌注治療，術(shù)中的再灌注損傷及無復(fù)流的發(fā)生導(dǎo)致心肌微循環(huán)組織水平灌注仍不理想，這部分患者常出現(xiàn)明顯的心室重塑并最終導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)生。

本研究觀察了左旋精氨酸干預(yù)對AMI大鼠血管新生的影響及心肌保護(hù)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，左旋精氨酸干預(yù)可提高AMI大鼠左室射血分?jǐn)?shù)，縮小梗死面積，增加毛細(xì)血管及小動脈新生；且發(fā)現(xiàn)左旋精氨酸干預(yù)組血漿BNP水平降低明顯，而BNP是心功能不全嚴(yán)重程度及預(yù)后不良較為特異性的生物標(biāo)志物。本研究發(fā)現(xiàn)，在心肌梗死后4周大鼠梗死周圍區(qū)心肌eNOS表達(dá)明顯下降，而左旋精氨酸干預(yù)可增強(qiáng)eNOS表達(dá)，據(jù)此我們推測左旋精氨酸對血管新生的促進(jìn)作用主要與其對eNOS表達(dá)的影響相關(guān)。本研究還初步探討了左旋精氨酸干預(yù)對梗死后心肌間質(zhì)重構(gòu)的關(guān)鍵成分膠原-1的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)左旋精氨酸可減少心肌梗死慢性期梗死周圍區(qū)心肌內(nèi)膠原-1的含量。

關(guān)于左旋精氨酸對血管新生影響及心肌保護(hù)作用的機(jī)制尚未完全明確。動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大鼠心肌梗死后早期心肌內(nèi)皮型一氧化氮合成酶（eNOS）mRNA表達(dá)明顯降低[13]，其機(jī)制可能與血漿及左心室梗死區(qū)、邊緣區(qū)的非對稱性二甲基精氨酸（Asymmetric dimethylarginine，ADMA） 濃度升高有關(guān)[14]。ADMA可抑制eNOS的活性，而eNOS的主要作用為催化精氨酸轉(zhuǎn)化為瓜氨酸和一氧化氮（NO），后者是強(qiáng)有力的內(nèi)源性血管舒張因子，可抑制白細(xì)胞黏附及血小板聚集，維持內(nèi)皮細(xì)胞功能的穩(wěn)定，若NO合成不足，則會影響心肌組織水平灌注及血管新生[15]。左旋精氨酸是一種半必需氨基酸，是一氧化氮合成酶的底物，可在缺氧條件下上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子表達(dá)，降低各種因子在缺氧條件下對內(nèi)皮細(xì)胞的損傷[16]，此外，左旋精氨酸可拮抗ADMA對內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制作用[5]。它雖不能使體內(nèi)的ADMA水平下降，但可恢復(fù)L-Arginine/ADMA比值，從而拮抗ADMA的效應(yīng)，增加eNOS mRNA的表達(dá)及其活性。研究表明，eNOS在AMI后血管新生及心肌重塑方面發(fā)揮著重要作用，eNOS基因敲除大鼠缺血區(qū)心肌血管新生明顯受到抑制[17,18]。

本研究發(fā)現(xiàn)，PIGF的心肌保護(hù)作用還可能與其對梗死周圍區(qū)心肌內(nèi)膠原-Ⅰ蛋白表達(dá)的影響相關(guān)。膠原-Ⅰ是細(xì)胞間基質(zhì)的主要成分，在心肌梗死后心肌纖維化過程中扮演重要角色，調(diào)節(jié)膠原合成已成為治療心室重塑的重要靶點(diǎn)[19]。左旋精氨酸減少心肌梗死慢性期梗死周圍區(qū)心肌內(nèi)膠原-Ⅰ表達(dá)的可能機(jī)制為：隨著新生血管增加，心肌組織缺血、缺氧得到改善，基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-2（TIMP-2）及基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）表達(dá)增加，導(dǎo)致膠原-Ⅰ降解增加[20]。

血管新生的發(fā)現(xiàn)是缺血性心臟病治療的一大進(jìn)步。然而，諸多促進(jìn)血管生成的細(xì)胞因子在動物實(shí)驗(yàn)獲得較好的治療效果，但在人體進(jìn)行臨床試驗(yàn)卻未能取得預(yù)期效果。越來越多的研究表明，之所以會出現(xiàn)上述情況，與患者的選擇差異、應(yīng)用時機(jī)、新生血管成熟等多種因素相關(guān)；另外，給藥途徑、藥物載體、藥物劑量等問題尚未解決，大規(guī)模應(yīng)用于臨床實(shí)踐尚需進(jìn)一步加強(qiáng)對其作用機(jī)制及安全性方面的研究[21]。

（本文圖片見封三）

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Effect of angiogenesis and cardioprotective activity of L-Arginine in a rat model of acute myocardial infarction

LUO Li-yun＊，LI Yue，PENG Hu，et al.＊Department of Cardiology，the Fifth Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University，Zhuhai 519000，China

LIN Xiu-fang，E-mail：linxiufang_126@126.com

ObjectiveTo investigate the effect of angiogenesis in peri-infarct area of the L-Arginine therapy for acute myocardial infarction rats and its cardioprotective activity.MethodsThe AMI rat model was established by ligation of the left anterior descending of coronary arteries.Thirty male Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups:sham group，normal saline group（control group）and L-Arginine group.Four weeks after ligation and treatment，cardiac function，scar area，plasma concentration of BNP，angiogenesis and arteriogenesis，myocardial collagen Ⅰ protein expression were studied.Echocardiography，Masson staining，enzyme-linked immunosorbent assay，immunehistochemistry，western blot were performed.ResultsFour weeks after ligation，compared with the control group，LVEF（48.20%vs 35.20%，P＜0.01），LVFS（24.10%vs 17.38%，P＜0.01）were higher in L-Arginine group，while LVEDD（7.82 mm vs 9.06 mm，P＜0.01）and LVESD（6.29 mm vs 7.32 mm，P＜0.01）decreased obviously.Average scar percentage and plasma concentration of BNP were lower in L-Arginine group（872.33 pg/ml vs 1203 pg/ml，P＜0.01）.The mean CD31-positive microvessels（101.4/mm2vs 34.8/mm2，P＜0.01）and α-SMA positive microvessels of the peri-infarct area （20.2/mm2vs 7.2/mm2，P＜0.01）were higher in L-Arginine group，while collagen Ⅰ protein content was decreased in this group（P＜0.01）.ConclusionL-Arginine intervention improves cardiac function and reduces infarction size in AMI rats，the possible mechanism is related to dual function of promoting angiogenesis and arteriogenesis，reducing collagen Ⅰ expression is also one of the important mechanisms.

Acute myocardial infarction； Angiogenesis； L-Arginine

珠海市科技局課題（項(xiàng)目編號：2015A1009）

519000 廣東省珠海市，中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院心血管內(nèi)科（羅禮云、彭湖、危小良、林岫芳），老年病科（李玥）

林岫芳，E-mail：linxiufang_126@126.com

10.3969/j.issn.1672－5301.2017.12.024

Q95-33；R542.2+2

A

1672-5301（2017）12-1140-05

2017-05-17）