宋曉婧 彭亞婷 陳海燕 鄭躍 許慶芳 龔子鑒 陸春 賴維510630廣州，中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院皮膚科

·論著·

miRNA?29c?3p對體外慢性光損傷皮膚成纖維細(xì)胞COL1A1和COL3A1基因表達(dá)及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白合成的影響

宋曉婧 彭亞婷 陳海燕 鄭躍 許慶芳 龔子鑒 陸春 賴維510630廣州，中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院皮膚科

目的研究miRNA?29（miR?29）家族對人慢性光損傷（光老化）皮膚Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的影響。方法將人皮膚成纖維細(xì)胞分為未照射組和慢性光損傷組，后者給予長波紫外線（UVA）連續(xù)照射以構(gòu)建慢性光損傷細(xì)胞模型，并用流式細(xì)胞儀及β半乳糖苷酶染色法驗證模型。Western印跡檢測兩組Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)，實時熒光定量PCR（qRT?PCR）檢測miR?29家族3個成員（miR?29a?3p、miR?29b?3p和miR?29c?3p）在兩組細(xì)胞中的表達(dá)，選擇表達(dá)具有顯著差異的miR?29c?3p進(jìn)行功能試驗。將人皮膚成纖維細(xì)胞分為4組，分別采用熒光標(biāo)記的miRNA?29c?3p模擬物（過表達(dá)組）、抑制物（抑制組）及二者各自的對照RNA寡核苷酸（陰性對照組和抑制對照組）轉(zhuǎn)染各組細(xì)胞，觀察各組熒光細(xì)胞比例，qRT?PCR法檢測各組miR?29c?3p的相對表達(dá)量，判定干擾效率。采用qRT?PCR法檢測轉(zhuǎn)染后4組COL1A1和COL3A1 mRNA水平，Western印跡法檢測轉(zhuǎn)染后Ⅰ和Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)水平。結(jié)果與未照射組相比，慢性光損傷組衰老染色細(xì)胞陽性率顯著升高（36.47%±3.20%比12.56%±1.46%，P＜0.01），G1期細(xì)胞比例明顯升高，S期細(xì)胞比例明顯降低（均P＜0.01），慢性光損傷模型成功建立。慢性光損傷組Ⅰ和Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)（0.40±0.19和0.52±0.10）明顯低于未照射組（1.00±0.12和1.00±0.10，均P＜0.01），而miR?29c?3p（4.42±2.05）明顯高于未照射組（0.89±0.10，P＜ 0.05），兩組間miR?29a?3p和miR?29b?3p表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞ 0.05）。轉(zhuǎn)染后24 h，過表達(dá)組和抑制組的轉(zhuǎn)染效率均大于90%，達(dá)到干預(yù)要求。過表達(dá)組miR?29c?3p的表達(dá)（224.17±2.00）明顯高于陰性對照組（2.45±0.34），而抑制組（0.20±0.08）明顯低于抑制對照組（2.24±0.14），干擾模型構(gòu)建成功。評價轉(zhuǎn)染效率顯示，過表達(dá)組COL1A1和COL3A1 mRNA和Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)水平均明顯低于陰性對照組和抑制組（均P＜0.05），而抑制組明顯高于抑制對照組（均P＜0.01）。結(jié)論miR?29c?3p在慢性光損傷皮膚成纖維細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，可能通過調(diào)控COL1A1、COL3A1的表達(dá)影響Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白合成。

紫外線；成纖維細(xì)胞；微RNAs；膠原Ⅰ型；膠原Ⅲ型；光老化；miR?29

皮膚光老化是紫外線［主要是長波紫外線（UVA）］照射引起的皮膚外源性老化，真皮膠原減少是其最重要的病理學(xué)特征之一［1?2］。皮膚Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白是構(gòu)成皮膚真皮細(xì)胞外基質(zhì)最主要的蛋白成分，具有保持皮膚水分、支撐皮膚正常結(jié)構(gòu)及維持皮膚韌性的功能，主要分布于真皮層，僅由成纖維細(xì)胞合成和分泌。miRNA?29家族（miR?29）是主要調(diào)控人體內(nèi)膠原表達(dá)的一類miRNA分子，在多種以膠原改變?yōu)橹鞯募膊≈谐史钦１磉_(dá)，通過負(fù)性調(diào)節(jié)膠原形成參與疾病發(fā)展［3?5］。最近研究發(fā)現(xiàn)，在自然衰老皮膚的真皮組織中miR?29表達(dá)上調(diào)［6］，但膠原含量下調(diào)，提示miR?29上調(diào)可能與真皮膠原合成減少有關(guān)。我們通過研究miR?29（miR?29a?3p、miR?29b?3p和miR?29c?3p）在慢性光損傷人皮膚成纖維細(xì)胞（HDF）中的表達(dá)及其對Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白合成的影響，進(jìn)一步揭示光老化的機制。

材料與方法

一、材料

1.細(xì)胞來源：HDF來源于中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院泌尿外科3～9歲健康兒童包皮環(huán)切術(shù)后包皮組織，兒童監(jiān)護(hù)人已被告知組織用途并簽署知情同意書。本研究通過中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（中大附三醫(yī)倫［2016］2?63號）。

2.主要試劑和儀器：Hairpin?itTMmiRNA實時定量PCR（qRT?PCR）定量檢測試劑盒、miR?29特異性引物和U6內(nèi)參引物（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司），PrimerScript RT?PCR試劑盒和SYBR Green實時PCR預(yù)混液（美國Clontech公司）。按照文獻(xiàn)［7］設(shè)計膠原基因（COL1A1及COL3A1）mRNA引物及內(nèi)參3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）基因引物序列，并由美國life公司合成。一抗鼠抗人Ⅰ型膠原蛋白IgG抗體、兔抗人Ⅲ型膠原蛋白多克隆抗體、鼠抗人β肌動蛋白抗體（美國Abcam公司），二抗辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG及羊抗鼠IgG（美國Cell Signaling Technology公司），BCA蛋白定量試劑盒（美國Pierce公司），蛋白提取試劑盒、細(xì)胞周期檢測試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司），總RNA提取試劑Trizol及Opti?MEM無血清培養(yǎng)基（美國Invitrogen公司），β半乳糖苷酶染色試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），ECL顯色試劑盒（美國Millpore公司）。

PCR儀（美國Applied Biosystems公司），酶聯(lián)免疫檢測儀（美國BioTek公司），UVA紫外線輻射儀和UVA照射計（上海希格瑪高技術(shù)有限公司），流式細(xì)胞儀（美國BD Biosciences公司）。

二、慢性光損傷細(xì)胞模型的建立與驗證

1.建立模型：取小兒包皮組織，參照文獻(xiàn)［8］方法分離、培養(yǎng)HDF，6代以內(nèi)的細(xì)胞用于后續(xù)試驗。按照文獻(xiàn)［9?10］方法照射HDF（慢性光損傷組）：HDF距離光源15 cm，平均照射功率12.7 mW/cm2，單次照射時間780 s，劑量9.9 J/cm2，每日照射1次，連續(xù)照射7 d；以同等條件下未照射的HDF為對照。兩組細(xì)胞處理完成后均置于95%濕度、含5%CO2、37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

2.驗證：采用β半乳糖苷酶染色法檢測老化比率，即末次UVA照射后48 h去除培養(yǎng)基，根據(jù)試劑盒說明書固定細(xì)胞和染色，置于37℃干燥、無CO2的培養(yǎng)箱避光孵育過夜。光鏡下觀察，每皿至少計數(shù)500個細(xì)胞及其中胞質(zhì)被染成藍(lán)色的老化細(xì)胞數(shù)量，計算老化細(xì)胞比率。參照文獻(xiàn)［6］收集和固定細(xì)胞，按照細(xì)胞周期檢測試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)胞染色，4℃避光孵育30 min后流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，記錄激發(fā)波長488 nm處紅色熒光強度。

三、檢測慢性光損傷HDF中miR?29及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)

1.qRT?PCR法檢測慢性光損傷HDF中miR?29的表達(dá)：按Trizol試劑說明書從樣品中提取總RNA，并用超微量核酸分析儀測定其濃度及純度。取2 μg總RNA，嚴(yán)格按照Hairpin?itTMmiRNA RT?PCR定量檢測試劑盒說明書操作，用莖環(huán)法反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)體系為20 μl，3個miR?29和U6的特異性反轉(zhuǎn)錄引物濃度均為60 nmol/L。按照說明書取2 μl cDNA在Applied Biosystems 7500 Fast PCR儀中擴增，擴增體系20 μl，包括2倍實時定量PCR緩沖液 10 μl，PCR 引物 0.32 μl，cDNA 2 μl，濃度均為80 nmol/L，Taq DNA聚合酶0.2 μl以及雙蒸水。擴增條件：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性12 s，62℃退火40 s，40個循環(huán)。以U6為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt方法計算miR?29a?3p、miR?29b?3p和miR?29c?3p的相對表達(dá)量。

2.Western印跡法檢測慢性光損傷HDF中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)：按照蛋白提取試劑盒說明書提取總蛋白，用BCA法測量蛋白濃度。用8%分離膠電泳分離蛋白50 min，再將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用5%牛血清白蛋白（BSA）封閉。1 000倍稀釋的抗Ⅰ型膠原蛋白抗體、10 000倍稀釋的抗Ⅲ型膠原蛋白抗體及5 000倍稀釋的抗β肌動蛋白抗體為一抗，10 000倍稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠抗體為二抗。采用ECL化學(xué)發(fā)光顯色，電子成像系統(tǒng)成像。以β肌動蛋白為內(nèi)參，使用Image J軟件分析圖像。

四、miR?29c?3p的功能驗證

對上述發(fā)現(xiàn)的差異表達(dá)miR?29c?3p進(jìn)行功能驗證，研究其對HDF膠原合成的影響。

1.HDF轉(zhuǎn)染RNA寡核苷酸后miR?29c?3p水平：HDF培養(yǎng)24 h后，接種在6孔板上，培養(yǎng)24 h并融合至70%后分為4組。按照試劑說明書用Lipofectamine3000將miR?29c?3p模擬物（過表達(dá)組）、抑制物（含羥基熒光素綠色熒光標(biāo)記，抑制組）及各自的對照（陰性對照組和抑制對照組）分別轉(zhuǎn)染入各組HDF。其中模擬物（雙鏈RNA）序列為5′?UAGCACCAUUUGAAAUCGGUUA?3′、5′?ACCGAUU UCAAAUGGUGCUAUU?3′，抑制物（單鏈RNA）序列為5′?UAACCGAUUUCAAAUGGUGCUA?3′，陰性對照組（雙鏈RNA）序列為5′?UUCUCCGAACGUGUCA CGUTT?3′、5′?ACGUGACACGUUCGGAGAATT?3′，抑制對照組（單鏈RNA）序列為5′?CAGUACUUUUG UGUAGUACAA?3′。利用倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光細(xì)胞比例，評價轉(zhuǎn)染效率（熒光細(xì)胞比例超過80%認(rèn)為達(dá)到轉(zhuǎn)染要求），采用qRT?PCR法檢測過表達(dá)組相對陰性對照組及抑制組相對抑制對照組miR?29c?3p表達(dá)量，以判定過表達(dá)和抑制的干擾效率。

2.qRT?PCR法檢測轉(zhuǎn)染后24 h HDF中COL1A1、COL3A1 mRNA水平：取2 μg總RNA，按照PrimerScript RT?PCR試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，稀釋100倍后取2 μl按照SYBR Green實時PCR預(yù)混液說明書進(jìn)行PCR擴增。以GAPDH為內(nèi)參 基 因 ，采 用 2?ΔΔCt方法計算 HDF 中 COL1A1、COL3A1 mRNA相對表達(dá)量。

3.Western印跡法檢測轉(zhuǎn)染后HDF中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)：同上述慢性光損傷HDF中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)的檢測方法。

五、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，實驗結(jié)果以±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較首先采用單因素方差分析，再采用LSD?t檢驗進(jìn)行兩兩間的多重比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、慢性光損傷HDF模型的建立和驗證

1.UVA照射后HDF形態(tài)及β半乳糖苷酶染色結(jié)果：多次UVA照射后，細(xì)胞生長緩慢，形狀寬大扁平，胞質(zhì)透明，胞核內(nèi)顆粒增多，呈衰老表現(xiàn)。β半乳糖苷酶染色可見典型衰老細(xì)胞核周藍(lán)染。未照射組老化細(xì)胞比率為（12.56±1.46）%，慢性光損傷組為（36.47±3.20）%，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（n=3，t=6.80，P＜ 0.01）。見圖1。

2.UVA照射對HDF細(xì)胞周期的影響：慢性光損傷組G1期細(xì)胞比例（71.70%±2.43%）高于未照射組（41.89% ±1.86%），S期細(xì)胞比例（10.63% ±0.36%）及G2期細(xì)胞比例（12.00%±0.48%）均低于未照射組（分別為36.48%±1.31%、21.56%±0.51%），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（n=3，t值分別為9.75、19.02、13.67，均P＜ 0.01）。

圖1 β半乳糖苷酶染色法檢測連續(xù)UVA照射后人皮膚成纖維細(xì)胞（HDF）形態(tài)（×100） 1A：未照射組，僅見少量HDF核周藍(lán)染；1B：慢性光損傷組，可見多個HDF核周藍(lán)染

二、慢性光損傷HDF中miR?29的表達(dá)及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)水平

經(jīng)UVA處理后，慢性光損傷組HDF的miR?29c?3p明顯高于未照射組（n=3，t=2.98，P＜ 0.05），而miR?29a?3p和miR?29b?3p與未照射組相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（n=3，t分別為0.12、0.82，均P＞0.05）。見圖2。慢性光損傷組HDFⅠ型（0.40±0.19）、Ⅲ型膠原蛋白（0.52±0.10）表達(dá)均明顯低于未照射組（分別為1.00±0.12、1.00±0.10，t值分別為4.75和5.90，均P＜ 0.01），見圖3。

圖2 慢性光損傷人皮膚成纖維細(xì)胞中miR?29家族的表達(dá)差異 n=3；a：P＜0.05。慢性光損傷組miR?29c?3p表達(dá)顯著高于未照射組

圖3 Western印跡檢測慢性光損傷與未照射人皮膚成纖維細(xì)胞中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá) 與未照射組相比，慢性光損傷組Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)均明顯下調(diào)

三、miR?29c?3p對HDF膠原表達(dá)的影響

1.RNA寡核苷酸轉(zhuǎn)染效率和干擾效率：轉(zhuǎn)染后24 h，miR?29c?3p過表達(dá)組（94 ± 1.3）%和miR?29c?3p抑制組轉(zhuǎn)染效率（93±1.6）%均＞90%，達(dá)到轉(zhuǎn)染要求（圖4）。轉(zhuǎn)染后24 h，各組miR?29c?3p水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=36141.04，P＜0.01），過表達(dá)組（224.17±2.00）明顯高于陰性對照組（2.45±0.34，LSD?t=267.85，P＜ 0.01），抑制組（0.20 ± 0.08）明顯低于抑制對照組（2.24±0.14，LSD?t=2.46，P＜0.05），干擾模型構(gòu)建成功。

圖4 RNA寡核苷酸轉(zhuǎn)染人皮膚成纖維細(xì)胞效率（×100） 兩組綠色熒光細(xì)胞比例均占該視野下細(xì)胞總數(shù)的90%以上，箭頭所指為轉(zhuǎn)染成功的成纖維細(xì)胞

2.miR?29c?3p對HDF膠原表達(dá)的影響：轉(zhuǎn)染后各組COL1A1和COL3A1 mRNA水平和Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白水平組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=18.73、20.87、69.51、55.49，均P＜ 0.01）。過表達(dá)組COL1A1和COL3A1 mRNA水平和Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)均明顯低于陰性對照組（LSD?t=2.56、3.11、7.23、5.36，均P＜ 0.05）和抑制組（LSD?t=7.00、7.58、14.44、12.72，均P＜0.01），而抑制組均明顯高于抑制對照組（LSD?t=5.48、5.28、7.08、8.19，均P＜ 0.01）。見圖5、6。

圖5 人皮膚成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR?29c?3p后各組COL1A1和COL3A1 mRNA相對表達(dá)量 n=3。a：P ＜0.05；b：P ＜0.01。1：陰性對照組；2：miR?29c?3p過表達(dá)組；3：抑制對照組；4：miR?29c?3p抑制組。過表達(dá)組COL1A1和COL3A1 mRNA水平均明顯低于陰性對照組，而抑制組均明顯高于抑制對照組

圖6 人皮膚成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR?29c?3p后各組Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白表達(dá) n=3。1：陰性對照組；2：miR?29c?3p過表達(dá)組；3：抑制對照組；4：miR?29c?3p抑制組。過表達(dá)組Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)均明顯低于陰性對照組，而抑制組均明顯高于抑制對照組

討 論

有研究發(fā)現(xiàn)，miR?29家族參與人體內(nèi)多個器官、多種疾病中膠原蛋白的調(diào)控［11?12］。然而，同一miRNA家族的不同成員，甚至同一miRNA，對不同組織和器官中的同一靶分子的影響不同，有明顯的組織或器官傾向性。van Rooij等［13］發(fā)現(xiàn)，miR?29b在心肌梗死組織周圍的表達(dá)明顯高于miR?29a和miR?29c。Roderburg等［11］和Sekiya等［5］則發(fā)現(xiàn)，miR?29b除了可以通過直接靶向結(jié)合膠原基因的方式下調(diào)肝臟的膠原合成，還可以通過細(xì)胞阻滯機制抑制肝星狀細(xì)胞的活化，起到抗肝纖維化的作用。我們在體外光老化HDF中發(fā)現(xiàn)，miR?29家族的3個成員中僅miR?29c?3p表達(dá)顯著上調(diào)，說明miR?29c?3p與光老化相關(guān)，相比于其他兩個miR?29成員更可能參與調(diào)控光老化過程，這為下一步發(fā)現(xiàn)調(diào)控光老化成纖維細(xì)胞膠原合成的特異miRNA奠定了基礎(chǔ)。本研究還通過體外構(gòu)建過表達(dá)和抑制表達(dá)模型證明，miR?29c?3p能負(fù)性調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的膠原蛋白表達(dá)。Plaisier等［14］和Sengupta等［15］也利用熒光素酶報告系統(tǒng)驗證了COL1A1和COL3A1是miR?29c?3p的靶基因。因此，miR?29c?3p很可能通過調(diào)控膠原基因的表達(dá)參與光老化膠原蛋白合成。這一特異性上調(diào)的miRNA對研究光老化發(fā)病機制和干預(yù)手段新工具的開發(fā)都有重要的意義。

盡管我們的結(jié)果已證實miR?29c?3p在皮膚膠原合成中起重要作用，但miR?29c?3p和膠原表達(dá)水平之間并沒有直接對等的化學(xué)劑量關(guān)系。例如，UVA連續(xù)照射后miR?29c?3p表達(dá)升高了5倍左右，伴隨著膠原蛋白降低2倍左右，而miR?29c?3p模擬物轉(zhuǎn)染（miR?29c?3p上調(diào)200倍以上）導(dǎo)致的膠原下調(diào)也僅2倍左右，表明miRNA靶基因結(jié)合位點不是miR?29調(diào)控靶基因mRNA的唯一決定因素，光老化中還可能存在另外的調(diào)控機制影響miR?29的作用和膠原合成減少的控制。我們推測，UVA可能會增加miR?29的作用，同樣的現(xiàn)象也見于心肌梗死，心肌梗死后miR?29表達(dá)降低數(shù)倍，伴隨著膠原mRNA表達(dá)增加20倍，而miR?29抑制物誘導(dǎo)的膠原合成僅略微增加［13］，表明應(yīng)激可能會增加miR?29的作用。

另外，也有研究報道，miR?29家族與自然衰老和病理性衰老有關(guān)［6］。研究發(fā)現(xiàn)，miR?29能夠通過影響RNA穩(wěn)定性、激活p53信號通路，導(dǎo)致DNA損傷，抑制B?Myb等途徑抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞衰老［16?17］。這也解釋了miR?29在自然衰老的皮膚組織中也存在上調(diào)現(xiàn)象［6］。特別的是，Suh 等［12］發(fā)現(xiàn)，miR?29特異性調(diào)控靜止期細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)，提示miR?29對細(xì)胞外基質(zhì)的調(diào)控與其對細(xì)胞增殖和衰老的影響是分不開的。至于光老化皮膚中miR?29對光老化細(xì)胞的增殖和衰老的作用及對光老化膠原合成的影響，仍需要進(jìn)一步研究。

本研究雖然發(fā)現(xiàn)miR?29c?3p與HDF膠原合成的調(diào)控有關(guān)，但具體的膠原調(diào)控機制、在光老化形成中的具體作用、UVA如何導(dǎo)致miR?29c?3p上調(diào)以及后者在活體的光老化皮膚中表達(dá)的情況等仍需進(jìn)一步研究。

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Effects of miRNA?29c?3p on the expression of collagen typeⅠα1 and collagen type Ⅲ α1 genes and the synthesis of collagenⅠandⅢ in chronically photodamaged human dermal fibroblastsin vitro

Song Xiaojing,Peng Yating,Chen Haiyan,Zheng Yue,Xu Qingfang,Gong Zijian,Lu Chun,Lai Wei
Department of Dermatology,The Third Affiliated Hospital,Sun Yat?sen University,Guangzhou 510630,China

Lai Wei,Email:drlaiwei@163.com

ObjectiveTo evaluate the effect of miRNA?29（miR?29）family on the synthesis of collagenⅠandⅢ in chronically photodamaged（photoaged）skin.MethodsSome cultured human dermal fibroblasts（HDFs）were divided into 2 groups:non?irradiated group receiving no treatment,and chronic photodamage group treated with repetitive ultraviolet A（UVA）radiation,which served as a chronically photodamaged cell model and was verified by flow cytometry and β ?galactosidase staining.Western blot analysis was performed to determine the protein expression of collagenⅠand Ⅲ,and real?time fluorescence?based quantitative PCR（qRT?PCR）to measure expression of 3 members of the miR?29 family（miR?29a?3p,miR?29b?3p and miR?29c?3p）in the above 2 groups.The differentially expressed miR?29c?3p between the above 2 groups was chosen for further functional tests.Some HDFs were divided into 4 groups to be transfected with fluorescein?labelled miR?29c?3p mimics（overexpression group）,inhibitors（inhibition group）,and their control RNA oligonucleotides（negative control group and inhibitor control group）respectively.The transfection efficiency was evaluated by the proportion of fluorescent cells,and the relative expression of miR?29c?3p in the above 4 groups was measured by qRT?PCR for evaluating the RNA interference efficiency.qRT?PCR was conducted to determine the mRNA expression of collagen typeⅠα1（COL1A1）and collagen type Ⅲ α1（COL3A1）genes,and Western blot analysis to measure the protein expression of collagenⅠandⅢ.ResultsCompared with the non?irradiated group,the chronic photodamage group showed significantly increased proportion of senescent cells（36.47% ±3.20%vs.12.56% ±1.46%,P＜0.01）and G1?phase cells（71.70% ±2.43%vs.41.89% ±1.86%,P＜0.01）,but significantly decreased proportion of S?phase cells（10.63% ± 0.36%vs.36.48% ± 1.31%,P＜ 0.01）,which indicated that the chronically photodamaged cell model was established successfully.The protein expression of collagenⅠandⅢwas significantly lower in the chronic photodamage group（0.40±0.19 and 0.52±0.10）than in the non?irradiated group（1.00±0.12 and 1.00±0.10,respectively,bothP＜ 0.01）.The expression of miR?29c?3p was significantly higher in the chronic photodamage group than in the non?irradiated group（4.42±2.05vs.0.89±0.10,P＜0.05）,while there were no significant differences in the expression of miR?29a?3p or miR?29b?3p between the 2 groups（bothP＞ 0.05）.Twenty?four hours after transfection,the overexpression group and inhibition group both showed more than 90%transfection efficiency which met the interference requirements.The expression of miR?29c?3p was significantly higher in the overexpression group than in the negative control group（224.17±2.00vs.2.45±0.34,P＜0.01）,but significantly lower in the inhibition group than in the inhibitor control group（0.20±0.08vs.2.24±0.14,P＜ 0.01）,suggesting that a RNA interference model was successfully established.The mRNA expression of COL1A1 and COL3A1 and the protein expression of collagenⅠandⅢ were significantly lower in the overexpression group than in the negative control group and inhibition group（allP＜ 0.05）,and significantly higher in the inhibition group than in the inhibitor control group（allP＜ 0.01）.ConclusionThe expression of miR?29c?3p is up?regulated in chronically photodamaged HDFs,likely by regulating the mRNA expression of COL1A1 and COL3A1 and the protein expression of collagenⅠandⅢ.

Ultraviolet rays;Fibroblasts;MicroRNAs;Collagen type I;Collagen type III;Photoaging;miR?29

Fund program:National Natural Science Foundation of China（81673047）

賴維，Email：drlaiwei@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.12.003

國家自然科學(xué)基金（81673047）

2017?03?06）

周良佳 顏艷）