朱 琳 常 水 曲振華 宋洪濤

CYP3A4、CYP3A5和MDR1基因多態(tài)性與腎移植受者他克莫司血藥濃度的關(guān)系

朱 琳1常 水1曲振華1宋洪濤2

目的：研究CYP3A4*18B、CYP3A5*3及MDR1基因突變對(duì)他克莫司血藥濃度/(劑量×體重)(C/D)的影響。 方法：采用PCR-RFLP方法檢測(cè)227例腎移植受者CYP3A4*18B、CYP3A5*3及MDR1 C1236T、G2677T/A及C3435T基因型，比較不同基因型受者之間他克莫司的C/D值的差異。 結(jié)果：CYP3A4*18B和CYP3A5*3基因多態(tài)性與腎移植受者他克莫司C/D值具有相關(guān)性(P<0.01)。但是消除CYP3A5*3等位基因影響后，CYP3A4*18B各基因型間他克莫司的C/D值無顯著性差異(P>0.05)；而消除CYP3A4*18B等位基因影響后，CYP3A5*1/*1型和*1/*3型受者型受者他克莫司的C/D值顯著性低于*3/*3(P<0.01)。MDR1各基因型組間他克莫司的C/D值均無顯著性差異。 結(jié)論：消除CYP3A5*3等位基因影響后，CYP3A4*18B和MDR1基因多態(tài)性對(duì)他克莫司血藥濃度無影響。

腎移植 他克莫司 基因多態(tài)性 血藥濃度

他克莫司屬鈣調(diào)磷酸酶抑制劑，廣泛用于預(yù)防器官移植后排斥反應(yīng)的發(fā)生，但其治療窗窄，藥動(dòng)學(xué)個(gè)體差異大(半衰期t1/2為3.5～40.5 h，口服生物利用度為4%～89%[1])，給予相同體重劑量的他克莫司后血藥濃度相差>10倍[2]。一般情況下需要通過數(shù)周甚至數(shù)月才能調(diào)整至他克莫司維持劑量，急性排斥反應(yīng)和不良反應(yīng)發(fā)生率較高，直接影響腎移植受者的生存率和生存質(zhì)量，甚至致使器官移植失敗。

研究表明藥物反應(yīng)和處置個(gè)體差異的20%～95%是由遺傳因素引起的[3]。他克莫司是細(xì)胞色素P450(cytochrome P450)3A酶和P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的作用底物[4]，它們的生物活性及表達(dá)水平會(huì)直接影響到他克莫司的吸收、分布及其代謝，而這些酶表達(dá)量及活性與編碼這些酶的基因多態(tài)性有一定關(guān)系。近年來，研究較多的基因主要有CYP3A4、CYP3A5和多藥耐藥基因1(multi-drug resistance gene l,MDR1)，僅CYP3A5*3(rs776746)基因多態(tài)性與他克莫司血藥濃度密切相關(guān)[5-8]，國內(nèi)外研究結(jié)論較為一致外，其他基因多態(tài)性的影響還有待進(jìn)一步進(jìn)行研究[9-11]。本研究通過對(duì)腎移植受者進(jìn)行回顧性研究，進(jìn)一步探討CYP3A4*18B、CYP3A5*3及MDR1 C1236T、G2677T/A 和C3435T基因多態(tài)性與他克莫司血藥濃度、療效及不良反應(yīng)之間的關(guān)系，從而為臨床他克莫司的個(gè)體化用藥提供理論依據(jù)。

材料與方法

試劑與儀器引物由寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)合成；Taq DNA聚合酶(TaKaRa)，限制性內(nèi)切酶(上海生工生物工程限公司)；瓊脂糖(BIO BASIC INC)，溴化乙錠(申能博彩biocolors)；化學(xué)試劑均為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

GeneAmp PCR system 9700(美國基因公司)；蛋白核酸測(cè)定儀(德國Eppendorf公司)；FX-DY-252型電泳儀(上海復(fù)興高科技(集團(tuán))有限公司)；WD-9413B凝膠成像分析系統(tǒng)(北京六一儀器制造廠)等。

研究對(duì)象選擇在南京軍區(qū)福州總醫(yī)院首次接受異體腎移植手術(shù)且術(shù)后定期隨訪的受者為試驗(yàn)對(duì)象，共入選227例(均為漢族)，其中男性170例，女性57例，年齡39±11歲；體重56.7±11.8 kg；身高166.4±7.4 cm。試驗(yàn)排除術(shù)前肝功能異常、合并使用腎毒性藥物(如兩性霉素B、氨基糖苷類抗生素等)及給藥前兩周內(nèi)服用過CYP3A酶誘導(dǎo)劑或抑制劑(如利福平、大環(huán)內(nèi)酯類藥物等)的受者。

免疫抑制劑給藥方案免疫抑制治療方案采用他克莫司+嗎替麥考酚酯+糖皮質(zhì)激素三聯(lián)用藥，并服用地爾硫卓提高他克莫司血藥濃度。他克莫司劑量為0.1～0.12 mg/(kg·d)，早晚兩次服用，飯前1 h或飯后2 h口服給藥，首次劑量在腎移植術(shù)后第二天晚上給予，根據(jù)血藥濃度監(jiān)測(cè)結(jié)果調(diào)整劑量，使其谷濃度C0達(dá)到目標(biāo)濃度范圍5～10 ng/mL。嗎替麥考酚酯劑量為0.5～2 g/d，自術(shù)后第l天開始口服。激素為術(shù)后0～3d，常規(guī)給予甲潑尼龍琥珀酸鈉500 mg/d靜滴，于第4天改口服醋酸潑尼松20 mg/d。

全血DNA提取采集受者外周靜脈血2～3 ml置于EDTA抗凝管中低溫(4 ℃)保存，全血3 000 r/min離心5 min，棄上層血漿，在一周內(nèi)用改良碘化鉀法提取DNA。用紫外分光光度法測(cè)定所提取DNA的OD260、OD280，計(jì)算OD260/OD280，1.6

基因型分析采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和限制性內(nèi)切片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)方法分析CYP3A4*18B、CYP3A5*3、MDR1 C1236T、MDR1 G2677T/A及MDR1 C3435T基因型。各位點(diǎn)PCR引物設(shè)計(jì)見表1，各位點(diǎn)的酶切圖譜詳見圖1。

表1 PCR擴(kuò)增引物及限制性內(nèi)切酶

圖1 PCR-RFLP瓊脂糖凝膠電泳圖譜

臨床資料記錄查閱受者住院病歷，記錄人口學(xué)資料(年齡、性別、身高與體重)；受者用藥情況(他克莫司、嗎替麥考酚酯、潑尼松、地爾硫卓及其他合并用藥情況)；他克莫司維持劑量(他克莫司的維持劑量是指在服用相同劑量下，受者連續(xù)兩次測(cè)定谷濃度的值在其治療窗之間，兩次相隔時(shí)間至少14d以上)及此時(shí)的谷濃度及生化檢查指標(biāo)肌酐、尿素、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素、白蛋白、血紅蛋白及紅細(xì)胞壓積。

全血谷濃度的測(cè)定早晨服用藥物前處于穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)抽取腎移植受者靜脈血3 ml，用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定全血谷濃度。為便于比較，一般對(duì)他克莫司的血藥濃度進(jìn)行劑量校正，即血藥濃度/(劑量×體重)(C/D)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

結(jié) 果

基因分型227例腎移植受者DNA標(biāo)本經(jīng)PCR-RFLP基因分型的結(jié)果見表2。經(jīng)Hardy-Weinberg 檢驗(yàn)分析，結(jié)果顯示P>0.05，各基因頻率達(dá)到遺傳平衡，研究資料具有群體代表性。

表2 CYP3A4、CYP3A5和多耐藥基因1(MDR1)基因多態(tài)性在227例腎移植受者中的突變頻率

基因多態(tài)性對(duì)他克莫司C/D的影響本研究的結(jié)果顯示，CYP3A4*1/*18B和*18B/*18B基因型受者他克莫司維持劑量顯著性高于*1/*1型受者(P<0.01)；CYP3A4*1/*1型受者他克莫司C/D值明顯高于*1/*18B和*18B/*18B型受者，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖2A)；CYP3A4*1/*18B和*18B/*18B間他克莫司維持劑量及C/D值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CYP3A5*3/*3基因型受者他克莫司維持劑量明顯低于*1/*1型和*1/*3型受者(P<0.01)，組間他克莫司C/D具有顯著性差異(P<0.01)(圖2B)，*1/*1型和*1/*3型間維持劑量及C/D值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MDR1 C1236T、G2677T/A和C3435T各基因型組他克莫司維持劑量及其C/D值差異無顯著性(P>0.05)(圖2C～E)。

圖2 基因多態(tài)性對(duì)腎移植受者他克莫司C/D值影響的箱式分布圖C/D：血藥濃度/劑量×體重比值

CYP3A4*18B和CYP3A5*3基因多態(tài)性對(duì)他克莫司C/D的影響CYP3A5*3與CYP3A4*18B存在連鎖不平衡[13]，為避免研究結(jié)果的混淆，進(jìn)行分層分析。表4顯示消除掉CYP3A5*3的影響，在維持劑量時(shí)，CYP3A4*18B各基因組間的C/D的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表3)。消除CYP3A4*18B影響因素后，在維持劑量時(shí)，CYP3A5*3/*3與CYP3A5*1/*1型和*1/*3型組間的C/D仍存在顯著性差異(P<0.01)(表4)。

表3 以CYP3A5分組后CYP3A4基因多態(tài)性對(duì)他克莫司C/D的影響

C/D：血藥濃度/(劑量×體重)比值

表4 以CYP3A4分組后CYP3A5基因多態(tài)性對(duì)他克莫司C/D的影響

C/D：血藥濃度/(劑量×體重)比值；#：與*3/*3組比較，P<0.01

討 論

他克莫司在腎移植受者中被廣泛應(yīng)用，目前臨床上常規(guī)給予相同體重劑量的藥物，然后根據(jù)治療藥物監(jiān)測(cè)(TDM)結(jié)果對(duì)這一初始劑量進(jìn)行調(diào)整，但由于其治療窗窄、藥動(dòng)學(xué)差異大，使得移植術(shù)后受者需要較大劑量范圍和較長(zhǎng)時(shí)間的進(jìn)行劑量調(diào)整，急性排斥反應(yīng)和不良反應(yīng)的發(fā)生率較高，嚴(yán)重影響移植手術(shù)的治療效果以及移植術(shù)后受者的生存質(zhì)量。

個(gè)體間遺傳背景的差異可能是導(dǎo)致他克莫司用藥個(gè)體差異的原因之一，明確相關(guān)基因多態(tài)性對(duì)他克莫司血藥濃度、療效及不良反應(yīng)的影響，能為腎移植受者他克莫司的個(gè)體化給藥提供依據(jù)。我們的研究發(fā)現(xiàn)CYP3A4*18B、CYP3A5*3、MDR1 C1236T、MDR1G2677T/A以及MDR1C3435T五個(gè)位點(diǎn)的突變頻率，分別為30.8%、74.2%、65.6%、38.8%(G2677T)、10.3%(G2677A)和38.3%，各基因頻率均達(dá)到遺傳平衡，與文獻(xiàn)報(bào)道的中國漢族人群各位點(diǎn)突變頻率基本一致[10-12]。

CYP3A4和CYP3A5是他克莫司的代謝酶，他們的遺傳多態(tài)性可能是造成他克莫司藥動(dòng)學(xué)個(gè)體差異的主要原因。研究結(jié)果顯示，腎移植受者獲得維持劑量時(shí)，CYP3A4*18B和CYP3A5*3基因多態(tài)性與他克莫司的C/D值顯著相關(guān)(P<0.01)，但考慮到CYP3A5*3與CYP3A4 *18B存在一定的連鎖不平衡(D=0.43)[13]，我們對(duì)其進(jìn)行了分層分析。結(jié)果表明，消除CYP3A5*3的影響后則CYP3A4*18B各基因型組間他克莫司C/D值沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；但是以CYP3A4*18B分層后，CYP3A5*3基因多態(tài)性與他克莫司C/D之間仍有顯著相關(guān)性(P<0.01)。因此推測(cè)CYP3A4*18B對(duì)他克莫司C/D的影響還是來自于與CYP3A5*3的連鎖不平衡，其單獨(dú)對(duì)他克莫司血藥濃度沒有影響，起作用的主要還是CYP3A5*3。CYP3A5*3基因多態(tài)性對(duì)他克莫司的血藥濃度的影響，與國內(nèi)外的研究結(jié)果相一致[5-8]。

MDR1編碼的P-gp在他克莫司的吸收過程中起很大的作用，近年的許多研究證實(shí)遺傳因素在個(gè)體間P-gp表達(dá)和功能的差異中扮演了重要角色。在已發(fā)現(xiàn)的48個(gè)SNPs中，外顯子12、21和26的C1236T、G2677T/A和C3435T SNP具有重要的功能意義，此類突變的發(fā)生將明顯降低基因編碼蛋白的表達(dá)或改變蛋白的分子結(jié)構(gòu)，從而影響蛋白功效的充分發(fā)揮。國內(nèi)外對(duì)有許多報(bào)道研究了MDR1基因多態(tài)性對(duì)他克莫司藥代動(dòng)力學(xué)的影響作用，但結(jié)論不甚一致，甚至完全相反[9，14-17]。造成不同的研究所產(chǎn)生的結(jié)論并不完全一致的原因包括：不同的研究其研究人群的種族背景、飲食習(xí)慣等環(huán)境因素不同；不同的研究研究的時(shí)間點(diǎn)不同，在研究過程中受者同時(shí)服用了不同種類的其他藥物(如激素、鈣拮抗劑)等。本研究結(jié)果表明在維持劑量時(shí)，MDR1 C1236T、G2677T/A和C3435T不同基因型組間受者C/D差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

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AssociationofCYP3A4,CYP3A5andMDR1polymorphismswithindividualtacrolimusdosageregimeninrenaltransplantrecipients

ZHULin1，CHANGShui1,QUZhenhua1,SONGHongtao2

1DepartmentofPharmacy,YantaiAffiliatedHospitalofBinzhouMedicalUniversity,Yantai264000,China2DepartmentofPharmacy，F(xiàn)uzhouGeneralHospitalofNanjingMilitaryRegion，F(xiàn)uzhou350025，China

SONGHongtao(E-mail：sohoto@vip.163.com)

Objective：To investigate the effect of CYP3A4*18B, CYP3A5*3 and MDR1 on concentration/dosage×body body weight ratios (C/D) of tacrolimus in renal transplant patients.MethodologyThe CYP3A4*18B, CYP3A5*3, MDR1 C1236T, G2677T/A and C3435T genotypes of 227 renal transplant patients were determined by PCR-RFLP method. The differences of C/D ratios were compared among all of the genotype groups treated with tacrolimus.ResultsCYP3A4*18B and CYP3A 5*3 gene polymorphisms were associated with the C/D ratios of patients (P<0.01). No significant association was found between C/D of tacrolimus and CYP3A4*18B genotypes when they were classified by two CYP3A5 genotypes (P>0.05), While after the effects of CYP3A4*18B genotype was eliminated, the C/D ratio of tacrolimus in patients with CYP3A5*1/*1 and *1/*3 genotype group were significantly lower than those with CYP3A5*3/*3 genotype groups (P<0.01). There was no significant difference in the C/D ratio of tacrolimus among MDR1 C1236T，MDR1 G2677T/A and MDR1 C3435T genotype groups．ConclusionCYP3A4*18B and MDR 1 gene polymorphisms do not affect blood concentration of tacrolimus.

renal transplantation tacrolimus polymorphism Blood drug concentration

10.3969/cndt.j.issn.1006-298X.2017.06.005

1濱州醫(yī)學(xué)院煙臺(tái)附屬醫(yī)院藥學(xué)部(煙臺(tái)，264000)；2南京軍區(qū)福州總醫(yī)院藥學(xué)科

宋洪濤(E-mail：sohoto@vip.163.com)

? 2017年版權(quán)歸《腎臟病與透析腎移植雜志》編輯部所有

2017-06-15

(本文編輯 逸 沐)