梁 順 張 鴻 杜 玥 章良佑 何 敏 李中和 劉雙信 杜 藝 章 斌

轉錄激活因子3通過調控活化T細胞核因子1介導足細胞損傷

梁 順1張 鴻2杜 玥3章良佑3何 敏3李中和1劉雙信3杜 藝1章 斌3

目的：探討輔助轉錄因子——轉錄激活因子3(activating transcription factor 3,ATF3)調控活化T 細胞核因子1(nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1,NFATc1)在足細胞損傷中的作用。 方法：(1)通過免疫熒光染色及激光共聚焦顯微鏡，觀察ATF3在不同腎小球疾病患者足細胞中的表達,并通過Western印跡驗證不同腎小球疾病患者腎組織ATF3的表達情況；(2)體外培養(yǎng)小鼠永生化足細胞，用脂多糖(LPS)100 μg/ml和ionomycin 2 μmol/L分別刺激足細胞0h、1h、2h、4h、6h后，采用實時熒光定量PCR(RT-PCR)和Western印跡檢測ATF3 mRNA和蛋白的表達；(3)足細胞轉染ATF3 siRNA后，通過Annexin V-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡情況，RT-PCR和Western印跡檢測凋亡相關標記物BAX、Bcl-2的表達，Western印跡檢測足細胞標記蛋白podocin的表達；(4)通過Western印跡、免疫熒光染色、激光共聚焦觀察在LPS和Ionomycin刺激下細胞核內ATF3表達情況；(5)通過免疫染色質共沉淀(ChIP)實驗觀察ATF3與核轉錄因子NFATc1啟動子之間的關系，并通過RT-PCR和Western印跡檢測足細胞沉默ATF3后對NFATc1的mRNA及蛋白表達的影響。 結果：(1)與正常腎組織相比，腎小球疾病患者腎組織足細胞ATF3表達明顯增多；(2)用LPS和Ionomycin刺激足細胞，2h后ATF3的表達增高最明顯，隨后降低，到6h基本恢復正常；(3)沉默ATF3基因后，細胞凋亡率減少，凋亡相關標記物BAX下調，Bcl-2上調，并部分逆轉足細胞標記蛋白podocin的下調；(4)在損傷刺激后，細胞核內ATF3表達增多；(5)ChIP實驗顯示ATF3與核轉錄因子NFATc1的啟動子區(qū)域有結合，在Ionomycin刺激后，結合量明顯增加，且沉默ATF3基因后，NFATc1表達減少。 結論：輔助轉錄因子ATF3參與NFATc1介導的足細胞損傷，即通過結合NFATc1啟動子，增強NFATc1表達，促進足細胞損傷。

足細胞 轉錄激活因子3 活化T細胞核因子1

足細胞損傷是蛋白尿發(fā)生的重要原因，但其損傷機制尚未完全清楚。本課題組[1-4]和國外[5-7]多個研究結果表明，核轉錄因子——活化T 細胞核因子(Nuclear factor of activated T-cells,cytoplasmic 1,NFATc1)是足細胞損傷、凋亡、腎小球硬化的重要因子。核轉錄因子NFATc1具有自身增強效應[8]，這種自身增強效應還需要有其他輔助轉錄因子的參與。轉錄激活因子3(activating transcription factor 3,ATF3)是應激誘導性輔助轉錄因子，是ATF/CREB轉錄因子家族的成員[9]，具有亮氨酸拉鏈結構(bZIP)，bZIP是DNA結合位點，可以通過其bZIP結合其他含bZIP蛋白調控轉錄[10]。ATF3在心肌細胞[11]、破骨細胞[12]、腫瘤細胞[13]等領域得到廣泛研究，然而在足細胞中表達及效應尚無報道。本研究擬通過人類腎小球疾病及細胞模型觀察ATF3在足細胞中的表達，在體外實驗驗證ATF3在損傷條件下的變化，并進一步探究輔助轉錄因子ATF3對足細胞效應機制是否與核轉錄因子NFATc1有關。

材料與方法

主要儀器和試劑胎牛血清、0.05%胰酶(Gibco)；RMPI 1640培養(yǎng)基(CORNING)；γ干擾素(ProSpec)；核漿蛋白提取試劑盒、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(凱基)；ATF3、NFATc1抗體(Abcam)；GAPDH 抗體(Bioworld)；Histone、Bcl-2抗體(CST)；podocin抗體、鈣離子霉素(ionomycin)、脂多糖(LPS)(Sigama)；BAX、Synaptopodin、WT1抗體(Santa)；熒光二抗488、熒光二抗555(Thermo)；逆轉錄試劑盒、SYBR GREEN(Takara)；lipofectamine 2000、Trizol(Life Technologies)；ATF3 siRNA(廣州銳博)；ChIP試劑盒(Thermo)。

足細胞的培養(yǎng)和實驗分組條件永生化小鼠足細胞系由美國J. Resier 教授(Rush University Medical Center,Chicago,IL,USA)惠贈。足細胞先在33℃、5% CO2培養(yǎng)箱中增殖，細胞融合達到70%～80%時轉入5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中分化，在37℃培養(yǎng)10～12d，足細胞分化成熟。本實驗所有足細胞實驗均在分化成熟后進行。

為明確LPS和Ionomycin誘導ATF3的時間效應，分組如下：(1)LPS(100 μg/ml)和Ionomycin(2 μmol/L)培養(yǎng)刺激0h、1h、2h、4h、6h。為探討沉默ATF3對足細胞損傷的影響，分組如下：(2)Control組(正常對照組)、Control-siRNA組、ATF3 siRNA組，siRNA濃度均為50 nmol/L；(3)Ionomycin(2 μmol/L)干預：Ionomycin-24h組、Control-siRNA+Ionomycin組、ATF3-siRNA#2+Ionomycin組，作用時間均為24h。為探究LPS和Ionomycin刺激下ATF3細胞核內表達，分組如下：(4)LPS組(100 μg/ml)、Ionomycin組(2 μmol/L)，作用時間均為2h。

siRNA轉染將50 nmol/L siRNA與8 μl lipofectamine 2000的混合液加入無血清無抗生素培養(yǎng)基內，6h后換成完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h。

免疫熒光將細胞或腎組織固定、透化、封閉，然后滴加一抗過夜，加入二抗，封片，通過激光共聚焦顯微鏡觀察。其中腎小球疾病患者足細胞是在腎活檢組織免疫熒光染色中通過足細胞標記蛋白WT1來標記足細胞。

Western印跡提取蛋白，加入變性液煮沸變性。蛋白經(jīng)電泳、電轉到PVDF膜上，封閉，加入一抗二抗孵育，用化學發(fā)光液曝光，Image J軟件分析灰度值。

實時熒光定量PCR(RT-PCR) Trizol法提取細胞總RNA，采用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA。按照SYBR Green PCR試劑盒說明書操作檢測目的基因表達。引物序列：ATF3 正義鏈5′-G￣A￣G￣G￣A￣T￣T￣T￣T￣G￣C￣T￣A￣A￣C￣C￣T￣G￣A￣C￣A￣C￣C-3′，反義鏈5′-T￣T￣G￣A￣C￣G￣G￣T￣A￣A￣C￣T￣G￣A￣C￣T￣C￣C￣A￣G￣C-3′；GAPDH正義鏈5′-A￣G￣G￣T￣C￣G￣G￣T￣G￣T￣G￣A￣A￣C￣G￣G￣A￣T￣T￣T￣G-3′，反義鏈5′-T￣G￣T￣A￣G￣A￣C￣C￣A￣T￣G￣T￣A￣G￣T￣T￣G￣A￣G￣G￣T￣C￣A-3′；NFAT 正義鏈5′-C￣T￣C￣G￣G￣C￣C￣T￣T￣T￣G￣C￣C￣C￣A￣T￣C￣T￣C-3′，反義鏈5′-A￣G￣G￣A￣G￣C￣A￣C￣G￣G￣A￣G￣C￣A￣T￣C￣T￣G￣A-3′。每個樣本設3個復孔，定量結果取平均值。

流式細胞儀檢測細胞凋亡收集各組細胞，用Binding Buffer重懸細胞，加入Annexin V-FITC避光孵育15 min，再加入PI，在1h內用流式細胞儀檢測。

免疫染色質共沉淀(ChIP)實驗甲醛處理并收集細胞，超聲破碎，然后加入ATF3抗體，與ATF3蛋白-NFATc1 DNA復合物相互結合，加入Protein A結合ATF3抗體-ATF3蛋白-NFATc1 DNA復合物，并沉淀，清洗，得到富集的ATF3蛋白-NFATc1 DNA復合物，加熱解交聯(lián)，純化富集的NFATc1 DNA片斷通過PCR分析。

統(tǒng)計學處理采用統(tǒng)計軟件SPSS 19.0進行統(tǒng)計學分析，符合正態(tài)分布計量資料用均數(shù)±標準表示，組間比較用單因素方差分析，采用LSD檢驗進行兩組間比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

ATF3在腎小球疾病患者腎組織的足細胞中表達增多免疫熒光染色后，通過腎小球足細胞標記蛋白WT1來定位足細胞，結果顯示正常腎組織的足細胞中ATF3的表達量很少,而在微小病變腎病(MCD)、局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)、糖尿病腎病(DN)患者的腎小球足細胞內ATF3的表達量明顯增多。同時，通過提取MCD、FSGS、DN患者腎組織及正常腎組織蛋白質后，Western印跡也顯示與正常腎組織相比較，MCD、FSGS及DN患者腎組織中ATF3的表達明顯增加(圖1)。

圖1 ATF3在不同類型腎小球疾病腎組織的足細胞中表達增多MCD：微小病變腎??；FSGS：局灶節(jié)段性腎小球硬化；DN：糖尿病腎??；ATF3：轉錄激活因子3；A:人類腎組織免疫熒光染色(綠色為ATF3，紅色為WT1，激光共聚焦顯微鏡×400，箭頭指示ATF3和WT1染色Merge后雙染色的足細胞)；B:人類腎組織蛋白Western印跡及定量；Normal為腎癌患者周邊正常腎組織，MCD、FSGS、DN為不同類型的腎小球疾病患者腎穿組織標本；1：Normal組；2：MCD組；3：FSGS組；4：DN組；與Normal組比較，*P<0.05,n=3

足細胞ATF3在損傷刺激(LPS和Ionomycin)后表達增加用LPS處理足細胞0h、1h、2h、4h、6h，結果顯示ATF3 mRNA及蛋白在LPS刺激后開始升高，ATF3 mRNA在2h表達量達到高峰后，ATF3蛋白在4h表達量最大，隨后均逐漸下降(1、2、4均P<0.05)，到6h基本恢復到正常時水平(P>0.05)。用Ionomycin干預足細胞0h、1h、2h、4h、6h后，結果顯示ATF3 mRNA和蛋白在Ionomycin刺激后開始升高，到2h表達量達到高峰后逐漸下降(1h、2h、4h均P<0.05)，到6h基本恢復到正常時水平(P>0.05)(圖2)。

圖2 LPS和Ionomycin處理后，足細胞ATF3表達增加 LPS:脂多糖；ATF3：轉錄激活因子3；Ionomycin:鈣離子霉素；A、C：LPS干預足細胞不同時間對ATF3表達的影響；B、D:Ionomycin干預足細胞不同時間對ATF3表達的影響(A、B為實時定量PCR，C、D為Western印跡及定量分析)，與0h相比，*P<0.05,n=3

沉默ATF3對足細胞的保護作用驗證三組ATF3-siRNA的效率,結果顯示ATF3-siRNA#2組沉默效率最高。ATF3-siRNA#2沉默ATF3后，通過Annexin V-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡情況，結果顯示ATF3-siRNA#2+Ionomycin組與Ionomycin-24h組相比凋亡率減少(P<0.05)。檢測凋亡相關標記物BAX、Bcl-2發(fā)現(xiàn)，沉默ATF3后，ATF3-siRNA#2+Ionomycin組與Ionomycin-24h組相比BAX表達下調，Bcl-2表達上調。同樣在沉默ATF3后，ATF3-siRNA#2+Ionomycin組Podocin蛋白表達量較Ionomycin-24h組增高(P<0.05)。以上結果提示沉默ATF3對足細胞具有保護作用，即對足細胞而言，ATF3是一個損傷因子(圖3)。

損傷性刺激(LPS和Ionomycin)誘導足細胞核ATF3表達增加用LPS和Ionomycin刺激足細胞2h后，通過DAPI標記細胞核，足細胞骨架蛋白Synaptopodin定位足細胞，免疫熒光染色結果顯示，與Control組相比，LPS組和Ionomycin組的ATF3表達量增加，且主要是細胞核內的ATF3表達增加。同樣用LPS和Ionomycin刺激足細胞2h后，提取細胞核蛋白，檢測細胞核內ATF3蛋白的表達影響，結果顯示與Control組比，LPS組和Ionomycin組細胞核內ATF3蛋白表達明顯增高(均P<0.05)(圖4)。

輔助轉錄因子ATF3對核轉錄因子NFATc1表達的調控作用(1)輔助轉錄因子ATF3與核轉錄因子NFATc1的啟動子區(qū)域直接結合：Ionomycin干預足細胞2h，按照Thermo ChIP試劑盒的操作流程，通過普通瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示輔助轉錄因子ATF3蛋白與核轉錄因子NFATc1啟動子區(qū)域有結合(圖5A)，且PCR定量分析結果發(fā)現(xiàn)與Control組比較，Ionomycin組中核轉錄因子NFATc1表達量明顯增加(P<0.05)(圖5B)；(2)輔助轉錄因子ATF3調控核轉錄因子NFATc1的轉錄：用ATF3-siRNA#2轉染沉默ATF3后，ATF3-siRNA#2+Ionomycin組NFATc1 mRNA和蛋白均較Ionomycin-24h組表達下降(P<0.05)(圖5C～E)。

圖3 沉默ATF3對足細胞的保護作用A、B：ATF3-siRNA的效率驗證(A為實時定量PCR，B為Western印跡及定量分析)；C～F:細胞流式凋亡圖；G、H:凋亡相關標記物BAX、Bcl-2檢測(G為實時定量PCR統(tǒng)計圖；H為Western印跡及定量分析)；I:細胞流式凋亡定量統(tǒng)計圖；J:沉默ATF3對Podocin影響Western印跡及定量分析；組1和C：Control組;組2：Control-siRNA組;組3：ATF3-siRNA#1組;組4：ATF3-siRNA#2組;組5：ATF3-siRNA#3組、組6和D：Ionomycin-24h組;組7和E：Control-siRNA+Ionomycin組;組8和F：ATF3-siRNA#2+Ionomycin組；圖A、B中與Control組比較，圖G、H、I、J中與Ionomycin-24h組比較，*P<0.05,n=3

圖4 LPS和Ionomycin誘導足細胞核ATF3表達 LPS：脂多糖；ATF3：轉錄激活因子3；Ionomycin:鈣離子霉素；A：細胞免疫熒光及定量統(tǒng)計(藍色為DAPI，綠色為Synaptopodin，紅色為ATF3，激光共聚焦顯微鏡×400)；B：細胞核內ATF3蛋白表達Western印跡及定量分析；組1：Control組；組2：Ionomycin組；組3：LPS組；與Control組比較，*P<0.05,n=3

圖5 輔助轉錄因子ATF3對核轉錄因子NFATc1的調控作用 ATF3：轉錄激活因子3；NFATc1:活化T細胞核因子；A：免疫染色質共沉淀(ChIP)后普通瓊脂糖凝膠電泳，引物為針對NFATc1的啟動子區(qū)域序列；B：ChIP后針對NFATc1啟動子區(qū)域進行的RT-PCR定量分析(A、B兩者為不同類型實驗)；C、D、E：沉默ATF3表達對核轉錄因子NFATc1表達影響(C為實時熒光定量PCR，D為Western印跡，E為Western印跡定量分析)；1：input組；2：IgG組：IP-IgG；3：IP組：IP-ATF3；4：Ionomycinl-24h組；5：Control-siRNA+Ionomycin組，6：ATF3-siRNA#2+Ionomycin組；圖B中與Control組比較，圖C、E中與Ionomycin組比較，*P<0.05,n=3

討 論

足細胞是腎小球濾過屏障的重要組成部分，幾乎所有的腎小球疾病產生蛋白尿都與足細胞損傷有關[14]。轉錄激活因子ATF3是應激誘導性輔助轉錄因子。在細胞靜息狀態(tài)下，ATF3基因低表達，但在一系列應激刺激下(如低氧、缺血)可被誘導表達[15]。ATF3是ATF/CREB轉錄因子家族的成員[9]，具有bZIP，bZIP是DNA結合位點，可結合其他含bZIP蛋白形成異構復合體來調控轉錄[10]。因ATF3結合不同的bZIP蛋白，ATF3既可抑制轉錄，也可活化轉錄[9]，其在調控細胞增殖、凋亡、炎癥、免疫穩(wěn)態(tài)以及器官和組織的分化等方面具有重要功能[11-13,16]。在足細胞中，ATF3的表達和效應尚未有報道。本研究首次發(fā)現(xiàn)在人類腎組織的足細胞及體外培養(yǎng)的足細胞中均有ATF3的表達，且在人類慢性腎臟病患者足細胞中表達增加，體外培養(yǎng)的足細胞在損傷刺激下也表達增加。因此猜測ATF3表達變化極可能與足細胞損傷有關，研究表明當足細胞受損時細胞凋亡增加[2]，凋亡相關標記物BAX上調[2]，Bcl-2下調[17]，足細胞標記蛋白Podocin表達下降[18]。進一步探究ATF3在足細胞中的效應發(fā)現(xiàn)，沉默ATF3表達后，部分逆轉了損傷刺激引起的足細胞凋亡，且凋亡標記物BAX下調、Bcl-2上調及足細胞標記蛋白Podocin表達增加。以上結果表明對于足細胞而言ATF3是一個損傷因子。

為了探究ATF3在足細胞中的損傷作用機制，進一步實驗發(fā)現(xiàn)，損傷刺激下，ATF3在足細胞核內表達增加。ATF3對足細胞的損傷效應是否與核轉錄因子NFATc1有關？當細胞受到刺激引起細胞內游離鈣離子增加時，鈣調磷酸酶(CaN) 活化，催化核轉錄因子NFAT去磷酸化后進入細胞核，啟動目的基因的轉錄[19]。本課題組[1-4]和國內外研究者[5-7]報道，CaN-NFAT信號軸活化導致足細胞損傷、凋亡和腎小球硬化。臨床上，CaN抑制劑(如環(huán)孢素A)在絕大多數(shù)腎小球疾病，都有顯著的降低尿蛋白和保護足細胞的作用，這反映了經(jīng)典通路CaN-NFAT在腎小球疾病發(fā)病機制中的核心地位。同時有研究表明，核轉錄因子NFATc1具有自身增強效應，除調控自身NFATc1基因[8]，還需要有其他輔助轉錄因子參與其自身增強效應。為探究輔助轉錄因子ATF3在足細胞中的損傷效應是否與核轉錄因子NFATc1有關，我們通過ChIP實驗發(fā)現(xiàn)，ATF3確實與NFATc1啟動子有結合，且在損傷刺激下結合明顯增加。沉默ATF3的表達后，NFATc1的表達也減少，可見ATF3可直接調控NFATc1的轉錄，從而介導足細胞損傷。

本研究首次發(fā)現(xiàn)ATF3在足細胞中有表達，且在足細胞中ATF3是一個損傷因子，介導足細胞的損傷機制是通過直接結合NFATc1啟動子，增強NFATc1轉錄活性。本研究從一個全新的視角探究NFATc1的轉錄調控機制，豐富了CaN-NFAT信號軸機制，為臨床治療慢性腎小球疾病提供新的干預策略。ATF3作為轉錄因子，是否能直接調控足細胞的凋亡和Podocin的表達改變，或除本研究發(fā)現(xiàn)的ATF3-NFATc1信號軸，是否還存在其他信號通路調控足細胞損傷，ATF3是否在內皮細胞或系膜細胞中也表達，后續(xù)我們將繼續(xù)探究相關問題，并構建轉基因動物模型，進一步驗證ATF3和NFATc1之間的關系及對腎臟損害的影響，從而為ATF3應用于臨床提供更多的實驗依據(jù)。

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Actvatingtranscriptionfactor3modulatesnuclearfactorofactivatedT-cellscytoplasmic1incucedpodocyteinjury

LIANGShun1,ZHANGHong2,DUYue3,ZHANGLiangyou3,HEMin3,LIZhonghe1,LIUShuangxin3,DUYi1,ZHANGBin3

1DepartmentofNephrology,TheFifthAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Zhuhai519000,China2SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China3DepartmentofNephrology,GuangdongGeneralHospital,Guangzhou510080,China*LIANGShunandZHANGHongareconsideredtobefirstauthors

ZHANGBin(E-mail:13925056339@163.com);DUYi(E-mail:2412127110@qq.com)

Objective：To explore the role of transcriptional coactivator-activating transcription factor 3(ATF3) in the nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1 (NFATc1) induced podocyte injury.Methodology(1) The expression of ATF3 in the glomeruli of proteinuric patients (MCD, FSGS or DN) were observed by laser confocal microscopy and Western blotting; (2) The conditionally immortalized mouse podocyte cell line was cultured in vitro and exposed to LPS (100 μg/ml) or ionomycin (2 μmol/L) for different times. Real-time quantity PCR and Western blotting were used to analyze the expression of ATF3; (3) Cell apoptosis in ATF3 knockdown podocytes was observed by flow cytometry. Real-time quantity PCR and Western blotting were used to analyze the expression of BAX and Bcl-2, and podocin expression in ATF3 knockdown podocytes was analyzed using Western blotting; (4) Western blotting and immunofluorescent staining were used to evaluate the change of nuclear localization of ATF3; (5) A chromatin immunoprecipitation assay (ChIP assay) was performed to confirm the potential ATF3 binding sites in the NFATc1 promoter region.Results(1) The expression of ATF3 was all elevated in podocytes from MCD patients, FSGS or DN. (2) ATF3 mRNA and protein increased in LPS or Ionomycin-treated podocytes for 1,2,4 hours. Western blot analysis demonstrated that ATF3 activation peaked at 2 hours and diminished 6 hours after LPS or ionomycin treatment. (3) After the knockdown of ATF3, the apoptosis ratio reduced, BAX mRNA and protein was down-regulated, Bcl-2 mRNA and protein was up-regulated, podocin protein increased and recovered to a nearly normal expression. (4) After injury-stimulation, nuclear localization of ATF3 increased. (5) ChIP assay demonstrated ATF3 were binding to the NFATc1 promoter region. When ionomycin-treated, more chromatin immunoprecipitated by ATF3 antibodies was observed. In ATF3 knockdown podocytes, reduced NFATc1 mRNA and protein expression were observed by Real-time quantity PCR and Western blotting.ConclusionATF3, a transcriptional coactivator, promotes the transcription of NFATc1 through binding to NFATc1 promoter region and thus contributes to NFATc1-mediated podocyte injury.

podocytes activating transcription factor 3 nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1

10.3969/cndt.j.issn.1006-298X.2017.06.006

國家自然科學基金面上項目(81570642，81370808，81670656)；國家臨床重點專科建設項目

1中山大學附屬第五醫(yī)院腎內科(珠海,519000)；2南方醫(yī)科大學研究生學院；3廣東省人民醫(yī)院腎內科 廣東省醫(yī)學科學院；梁 順和張 鴻為共同第一作者

章 斌(E-mail：13925056339@163.com)；杜 藝(E-mail：2412127110@qq.com)

? 2017年版權歸《腎臟病與透析腎移植雜志》編輯部所有

2017-06-13

(本文編輯 春 江 律 舟)