黃顯德+王玉+田延平+古勤生+李向東

摘要：以感染番木瓜環(huán)斑病毒西瓜株系（papaya ringspot virus-watermelon strain，PRSV-W）的西葫蘆葉片為供試材料，通過RT-PCR克隆PRSV-W衣殼蛋白（coat protein，CP）基因，并將其連接到原核表達(dá)載體pEHISTEV上得到重組質(zhì)粒pEHISTEV-PRSV-W-CP。將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后可表達(dá)分子量約為37 kD的融合蛋白。將融合蛋白從凝膠中切下，乳化后免疫新西蘭長耳兔，制備PRSV-W CP的抗血清。間接ELISA測定該血清效價(jià)為1∶8192。Western blot檢測結(jié)果表明，該抗血清只與感染PRSV的西葫蘆樣品有特異性反應(yīng)，而與健康西葫蘆、感染西瓜花葉病毒的西葫蘆及感染馬鈴薯Y病毒的普通煙樣品均無反應(yīng)。本研究為PRSV的快速檢測以及CP蛋白功能的研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：番木瓜環(huán)斑病毒西瓜株系；衣殼蛋白；原核表達(dá)；抗血清制備；檢測

中圖分類號：S436.5：Q78文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號：A文章編號：1001-4942（2017）12-0086-04

Abstract The coat protein （CP） gene of papaya ringspot virus-watermelon strain （PRSV-W） was amplified by RT-PCR from infected zucchini leaf samples and cloned into the prokaryotic expression vector pEHISTEV to produce recombinant plasmid pEHISTEV-PRSV-W-CP. The recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli strain Rosetta and expressed a fusion protein with molecular weight of 37 kD after induction with IPTG. The fusion protein was cut from the gel， emulsified and used to immunize the New Zealand rabbits to produce polyclonal antiserum against the CP of PRSV-W. The titer of the resultant antiserum was 1∶8192 in ELISA. In Western blot analysis， the antiserum showed specific positive reaction only with the zucchini plants infected with PRSV， but not with healthy zucchini plants or those infected with Watermelon mosaic virus， or Nicotiana tabacum plants infected with Potato virus Y. This research laid foundations for the detection of PRSV and functional studies of PRSV CP.

Keywords Papaya ringspot virus-watermelon strain； Coat protein； Prokaryotic expression； Antiserum preparation； Detection

番木瓜環(huán)斑病毒（Papaya ringspot virus，PRSV）是危害葫蘆科（Cucurbitaceae）作物和番木瓜（Carica papaya L.）的重要病毒[1]，可導(dǎo)致番木瓜減產(chǎn)85%～90%，嚴(yán)重的甚至絕收，給西葫蘆、南瓜、黃瓜、西瓜等葫蘆科作物的生產(chǎn)也造成嚴(yán)重危害。自20世紀(jì)40年代末在美國首次報(bào)道以來[2]，目前在巴西、印度、波蘭等國均有該病毒病發(fā)生的報(bào)道[3，4]。2000—2001年，PRSV給海南番木瓜造成不可估量的損失。2005年以來，在廣東、四川等地檢測到PRSV侵染羅漢果、苦瓜等葫蘆科作物[5]。2016年，我們從山東西葫蘆上檢測到PRSV[6]。

PRSV屬于馬鈴薯Y病毒科（Potyviridae）馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus），根據(jù)寄主可劃分為P和W兩個(gè)株系，其中P株系侵染番木瓜和葫蘆科作物，而W株系只侵染葫蘆科作物[7]。兩者血清學(xué)反應(yīng)密切相關(guān)。我們分離到的PRSV屬于W株系。PRSV病毒粒子彎曲線狀，無包膜，約（760～800） nm×12 nm，基因組為正單鏈RNA，全長約10.4 kb，通過多聚蛋白策略編碼2個(gè)多聚蛋白，后加工形成11個(gè)成熟蛋白[7， 8]。

衣殼蛋白（coat protein，CP）是一種多功能的結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒的復(fù)制、移動(dòng)及傳播，寄主癥狀表現(xiàn)等過程中均發(fā)揮著重要作用[9，10]。本研究構(gòu)建了能高效表達(dá)PRSV-W CP的原核表達(dá)載體，并通過免疫新西蘭長耳兔制備了PRSV-W CP的特異性抗血清，為PRSV的檢測以及其CP蛋白功能研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

感病樣品采自山東濟(jì)南感染PRSV-W的西葫蘆葉片，通過摩擦接種保存在西葫蘆植株上。原核表達(dá)載體pEHISTEV由英國安德魯斯大學(xué)劉煥庭老師惠贈(zèng)，大腸桿菌菌株DH5α、Rosetta由本實(shí)驗(yàn)室保存。

反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、dNTP、無RNA酶的水均購自TaKaRa公司；Phusion DNA聚合酶購自Thermo公司；植物總RNA提取試劑盒TransZol、DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購自北京全式金公司；硝酸纖維素膜為Pall Gelman公司產(chǎn)品；堿性磷酸酯酶標(biāo)記的羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗兔IgG、福氏不完全佐劑購自Sigma公司；其它試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。endprint

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室測定的PRSV-W全序列（序列號MF085000）設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增PRSV-W CP基因，由上海生工生物工程有限公司合成。正向引物為PRSV-W-CP-NcoⅠ-F：5′-CATGCCATGGTCTAAAAATGAAGCTGTGGACGCT-3′，下劃線部分為NcoⅠ酶切位點(diǎn)；反向引物為PRSV-W-CP-BamHⅠ-R：5′-CGCGGATCCTCAATTGCGCATACCCAGG-3′，下劃線部分為BamHⅠ酶切位點(diǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因擴(kuò)增及原核表達(dá)載體構(gòu)建 參照TransZol試劑盒說明，提取感病西葫蘆葉片總RNA，以此為模板，利用隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。利用引物PRSV-W-CP-NcoⅠ-F和PRSV-W-CP-BamH Ⅰ-R，以cDNA為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增CP基因。PCR反應(yīng)程序：98℃預(yù)變性30 s；98℃變性10 s，65.7℃退火20 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，純化回收后用Nco Ⅰ和BamHⅠ雙酶切，與同樣酶切處理的pEHISTEV用T4 DNA連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞。將PCR驗(yàn)證和酶切鑒定的陽性克隆送濟(jì)南博尚公司測序驗(yàn)證。

1.2.2 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和SDS-PAGE分析 將測序正確的重組質(zhì)粒（pEHISTEV-PRSV-W-CP）轉(zhuǎn)化E. coli Rosetta。挑取單菌落接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中（含50 mg/L卡那霉素），37℃培養(yǎng)過夜。第二天按1∶100稀釋于20 mL含50 mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600值為0.4～0.6。將菌液分為兩份，一份加入IPTG使其終濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L，于28℃、150 r/min誘導(dǎo)4 h；另一份加入IPTG使其終濃度為0.4 mmol/L，于28℃、150 r/min分別誘導(dǎo)1、2、3、4、5、6 h。12 000 r/min離心2 min收集菌體，加適量TE緩沖液（pH 8.0）振蕩懸浮，再加入等體積2×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸5 min，-20℃放置5 min，12 000 r/min離心10 min，取上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

1.2.3 抗血清制備、效價(jià)及特異性測定 通過SDS-PAGE分離原核表達(dá)產(chǎn)物，用0℃的0.25 mol/L KCl 和1 mmol/L DTT染色，切取目的蛋白條帶，按1∶1（W/V）加入0.9%生理鹽水在預(yù)冷的研缽中研磨。采取皮下多點(diǎn)注射免疫新西蘭大耳兔，初次免疫所用目的蛋白要加入等體積的弗氏完全佐劑進(jìn)行乳化，之后改用弗氏不完全佐劑。每隔一周注射一次，首次免疫計(jì)量為1 mg，之后加強(qiáng)免疫計(jì)量為0.6 mg，免疫4次。最后一次免疫后7天耳緣靜脈取血，測效價(jià)。效價(jià)達(dá)到要求后心臟取血，分離血清，加入0.02%的疊氮化鈉于-20℃保存。

利用ACP-ELISA法測定抗血清效價(jià)：將感病西葫蘆樣品和抗原包被緩沖液（0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液，pH 9.6）按1∶10（W/V）的比例加入研磨袋充分研磨，用研磨液包被酶聯(lián)板。以同樣的方法處理健康葉片作為陰性對照。抗血清按照1∶26～1∶214進(jìn)行梯度稀釋。顯色后使用酶標(biāo)儀讀取405 nm的OD值，I（待測樣品讀數(shù)-空白讀數(shù)）/ H（陰性樣品讀數(shù)-空白讀數(shù)）≥3為陽性反應(yīng)。

參照Towbin等[11]的方法進(jìn)行Western blot，分析抗血清的特異性。以感染PRSV-W的西葫蘆葉片為檢測對象，以健康西葫蘆葉片為陰性對照。提取蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳后電轉(zhuǎn)至NC膜上，放置5%脫脂奶粉溶液中4℃封閉過夜。按1∶500加入所制備的抗血清，孵育、洗滌后放入HRP-鼠抗兔IgG稀釋液中（1∶50 000稀釋）。將HRP-ECL化學(xué)發(fā)光所用A、B發(fā)光液按1∶1混合后，覆于NC膜上，在ChampChemi全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀中觀察結(jié)果。同時(shí)以感染西瓜花葉病毒（WMV）的西葫蘆葉片以及感染馬鈴薯Y病毒（PVY）的普通煙葉片為對照，檢測抗體的特異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 PRSV-W CP基因克隆及原核表達(dá)

利用引物PRSV-W-CP-NcoⅠ-F和PRSV-W-CP-BamHⅠ-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到870 bp的CP基因片段。PCR產(chǎn)物回收后用NcoⅠ和BamHⅠ雙酶切，與同樣酶切處理的原核表達(dá)載體pEHISTEV進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pEHISTEV-PRSV-W-CP。通過PCR擴(kuò)增和核苷酸序列測定證明其開放閱讀框正確。

將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E. coli Rosetta。菌液經(jīng)不同濃度IPTG和不同時(shí)間誘導(dǎo)后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，發(fā)現(xiàn)在37 kD附近出現(xiàn)一條特異性蛋白條帶（圖1、2），與理論預(yù)期大小一致，說明PRSV-W CP在大腸桿菌中得到了正確表達(dá)。當(dāng) IPTG誘導(dǎo)1 h時(shí)蛋白即可表達(dá)，隨著時(shí)間增長表達(dá)量有所增加，在誘導(dǎo)4 h以后表達(dá)量無明顯變化（圖1）；在IPTG濃度梯度中，當(dāng)其濃度為0.2 mmol/L時(shí)蛋白即可表達(dá)，隨著IPTG濃度的升高表達(dá)量無明顯變化（圖2）。說明，IPTG濃度為0.2 mmol/L、誘導(dǎo)4 h為PRSV-W CP高效表達(dá)條件。

2.2 抗血清制備及效價(jià)測定

從SDS-PAGE凝膠中切下pEHISTEV-PRSV-W-CP的原核表達(dá)產(chǎn)物，乳化后免疫新西蘭大耳兔4次，獲得PRSV-W CP抗血清。以感染PRSV的西葫蘆葉片樣品和健康葉片為材料，通過ACP-ELISA測定所得抗血清效價(jià)（表1），當(dāng)病汁液稀釋10倍，抗血清稀釋8 192倍時(shí)仍呈現(xiàn)明顯的陽性反應(yīng)，表明該抗體效價(jià)較高。endprint

2.3 抗血清特異性檢測

將得到的抗血清通過Western blot分析特異性。結(jié)果顯示，僅PRSV-W侵染的西葫蘆樣品在35 kD處出現(xiàn)了特異性條帶，而健康西葫蘆葉片、PVY侵染的普通煙葉片及WMV侵染的西葫蘆葉片均無特異性反應(yīng)（圖3），說明該抗血清能夠特異地與PRSV-W CP發(fā)生免疫反應(yīng)。

3 討論與結(jié)論

PRSV作為危害葫蘆科作物和番木瓜的主要病毒，對其生產(chǎn)造成了嚴(yán)重?fù)p害，因此建立一種快速可靠的檢測技術(shù)對于控制該病毒病的傳播和蔓延十分重要。血清學(xué)方法具有靈敏、快速、適合大量樣品檢測等特點(diǎn)，在植物病毒檢測中應(yīng)用廣泛。由于PRSV病毒粒子細(xì)長，其外殼蛋白在提純過程中容易斷裂或聚集，與寄主雜質(zhì)粘結(jié)而丟失，因而提純較為困難[12]。利用原核表達(dá)的方法可以在短時(shí)間內(nèi)獲得大量的目的蛋白，成為制備抗血清常用的方法[13]。

本研究利用E. coli Rosetta成功表達(dá)了PRSV-W CP，并通過免疫新西蘭大耳兔制備了特異性強(qiáng)、效價(jià)高的抗血清。該抗血清可用于Western blot和ELISA等對PRSV進(jìn)行檢測。原核表達(dá)過程中重組菌能否誘導(dǎo)表達(dá)以及誘導(dǎo)后表達(dá)產(chǎn)物得率高低是制備抗體的關(guān)鍵，因此對誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)物濃度進(jìn)行了梯度分析。考慮到成本及IPTG對細(xì)胞有毒性等問題，最終確定IPTG濃度為0.2 mmol/L、誘導(dǎo)4 h為PRSV-W CP高效表達(dá)條件。在這一條件下，誘導(dǎo)產(chǎn)物得率高，時(shí)間短，為后續(xù)免疫程序奠定了良好基礎(chǔ)。本研究制備的抗血清為檢測PRSV和CP功能研究奠定了基礎(chǔ)。

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