桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西 桂林 541001

金沙排石沖劑的制備及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

劉川玉鄧俊剛唐建紅*何潔

桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西 桂林 541001

目的制備金沙排石沖劑并建立其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法采用水提醇沉工藝制成顆粒劑，采用薄層色譜法對廣金錢草、澤瀉、白芍、穿破石、炙甘草進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜法進(jìn)行白芍苷的含量測定。結(jié)果采用薄層色譜法對廣金錢草、澤瀉、白芍、穿破石、炙甘草進(jìn)行定性鑒別，特征性強(qiáng)，重現(xiàn)性好。白芍苷的進(jìn)樣量在2.5～200.0 μg(r=0.9992)的線性范圍良好，加樣回收率為98.05%，RSD=1.65%(n=6)。結(jié)論該制劑制備方法合理、簡便、可行，所建立的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可為金沙排石沖劑的臨床應(yīng)用療效提供保證。

金沙排石沖劑；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；薄層色譜法；高效液相色譜法

“排石湯”是我院治療泌尿系結(jié)石的臨床驗(yàn)方，由廣金錢草、海金沙、白芍、雞內(nèi)金、石韋、滑石粉、穿破石[1]、威靈仙、茯苓、澤瀉、炙甘草等11味中藥組成，具有清熱利濕、利尿通淋、化瘀排石、解痙鎮(zhèn)痛等功效，組方的特點(diǎn)是在常規(guī)治療泌尿系結(jié)石基礎(chǔ)上增加了養(yǎng)營和血、緩急止痛的芍藥甘草湯[2]，對泌尿系結(jié)石具有獨(dú)特的療效。為了便于臨床使用，更廣泛地發(fā)揮其療效，研究采用水提醇沉工藝將該驗(yàn)方制成金沙排石沖劑，采用TLC法對其主要成分廣金錢草、澤瀉、白芍、穿破石和炙甘草進(jìn)行定性鑒別，用HPLC法進(jìn)行主要有效成分白芍苷的含量測定，現(xiàn)報告如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器 FA2004電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；B2500S-MT型超聲波清洗器 (必能信超聲上海有限公司)；Agilent HP1100系列高效液相色譜儀 (Agilent G1310A單元泵、Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱、Agilent G1316A柱溫箱、威瑪色譜工作站、Agilent G1314A可變波長檢測器，美國安捷倫公司)。

1.2 材料 硅膠G(薄層層析用化學(xué)純，批號:1284211，青島海洋公司)；羧甲基纖維素(批號:1208011，青島海洋公司)；廣金錢草(批號：120810)、穿破石(批號：130915)、雞內(nèi)金(批號：130701)、白芍(批號：20130605)、石韋(批號：130501)、威靈仙(批號：130315)、茯芩(批號：131001)、澤瀉(批號：130915)、炙甘草(批號：131001)、海金沙(批號：121201)等以上10味藥均購買于安徽井泉集團(tuán)中藥飲片有限公司；滑石粉(批號：20131005，柳州市神農(nóng)中藥飲片)；白芍苷對照品(批號：20131130，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司)；甲醇為色譜純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 處方與制備

2.1.1 處方 廣金錢草30 g，海金沙15 g，雞內(nèi)金15 g，白芍15 g，石韋10 g，滑石粉10 g，穿破石15 g，威靈仙15 g，茯芩15 g，澤瀉10 g，炙甘草10 g。

2.1.2 樣品制備 將該處方中的藥材備齊、凈選，按處方5倍量投料加水煎煮1 h，煎煮兩次合并煎煮液，減壓濃縮至相對密度1.05～1.10，加95%乙醇沉淀過夜(至含50 %醇量)，濾取上清液。減壓低溫濃縮至稠浸膏(60～65 ℃測定相對密度為1.20～1.25)。加入適量的蔗糖，用70%乙醇調(diào)整濕度制成軟材，造粒機(jī)擠壓過10目篩制成濕顆粒，60 ℃干燥，整粒，共得顆粒1 kg。用相同的方法制備3個批次的金沙排石沖劑。分別將處方中缺廣金錢草、澤瀉、炙甘草、白芍和空破石的藥材備齊、凈選，用相同方法分別制得各陰性樣品。

2.2 質(zhì)量控制

2.2.1 性狀 本品為棕色顆粒，味甜。

2.2.2 廣金錢草的薄層色譜鑒別 取3個批次的金沙排石沖劑適量研細(xì)，稱約10.0 g，溶于20 mL純水，稀鹽酸調(diào)pH=2，三氯甲烷振搖提取2次，每次20 mL，棄去三氯甲烷液，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯提取液，蒸干，提取物加無水乙醇1 mL溶解，既得供試液。取廣金錢草對照藥材5 g，加水煮沸30 min，放冷，過濾，濃縮至20 mL，濾液同供試品溶液制備方法下從“稀鹽酸調(diào)pH=2”開始制備成對照藥材溶液。另取缺廣金錢草的陰性樣品5 g，按供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。照薄層色譜法(通則0502)試驗(yàn)[3]，吸取以上5 種溶液各10 uL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-甲酸乙酯-甲酸( 5∶4∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2 %三氯化鋁乙醇液，熱風(fēng)吹于，置紫外燈( 365 nm)下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的熒光斑點(diǎn)；陰性對照無干擾。具體如圖1所示。

2.2.3 澤瀉的薄層色譜 取3個批次的金沙排石沖劑適量研細(xì)，稱約10.0 g，加水40 mL使溶解，加飽和食鹽水2 mL，充分振搖，用乙醚振搖萃取2次，每次30 mL，合并乙醚液，蒸干，殘渣加乙酸乙酯1 mL溶解，作為供試品溶液。取澤瀉對照藥材10 g，加水適量，煎煮30 min，濾過，濾液濃縮至約20 mL，按供試品溶液制備方法制備，作為對照藥材溶液；取缺澤瀉的陰性樣品10 g，同法制成陰性對照溶液。照薄層色譜法(通則0502)試驗(yàn)，吸取上述5種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸(10∶6∶0.2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10 %硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰[1]。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的紫紅色斑點(diǎn)，陰性對照溶液無相應(yīng)的斑點(diǎn)；陰性對照無干擾。如圖2所示。

2.2.4 白芍的薄層色譜鑒別 取3個批次的金沙排石沖劑適量研細(xì)，稱約10.0 g，加水40 mL使溶解，用20 mL水飽和的正丁醇振搖，提取2次，合并正丁醇液，以正丁醇飽和的水洗滌2次，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加乙醇1 mL溶解，作為供試品溶液。取白芍對照藥材粗粉0.5 g，加乙醇10 mL，振搖5 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇2 mL溶解，作為對照藥材溶液，另取白芍苷對照品適量，乙醇溶解，得標(biāo)準(zhǔn)對照品。取缺白芍的陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。照薄層色譜法 (通則0502)試驗(yàn)，吸取上述6種溶液各10 uL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶15∶0.2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，于105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰[4]。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的藍(lán)紫色斑點(diǎn)；在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的藍(lán)紫色斑點(diǎn)；陰性對照溶液無相應(yīng)的斑點(diǎn)；陰性對照無干擾。具體如圖3所示。

2.2.5 炙甘草的薄層色譜 取3個批次的金沙排石沖劑適量研細(xì)，稱約10.0 g，加甲醇50 mL，超聲30 min，過濾，濾液蒸干，殘渣加水40 mL使溶解，用正丁醇振搖提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用水洗滌3次，每次20 mL，棄去水洗液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。取炙甘草對照藥材10 g，加水30 mL，煎煮30 min，濾過，取濾液10 ml，按供試品溶液同法制成對照藥材溶液。取缺炙甘草樣品10 g，同供試品溶液制備方法制得缺甘草的陰性對照溶液。照薄層色譜法 (通則0502)試驗(yàn)，吸取上述5種溶液各10 uL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15∶1∶1∶1.5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，紫外光燈(254 nm) 下檢視。 供試品色譜中，與甘草對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色斑點(diǎn)。陰性對照溶液無相應(yīng)的斑點(diǎn)；陰性對照無干擾。具體如圖4所示。

2.2.6 穿破石的薄層色譜 取3個批次的金沙排石沖劑適量研細(xì)，稱約10.0 g，溶于20 mL的蒸餾水中，用乙酸乙酯提取2次每次20 mL，合并乙酸乙酯溶液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL溶解作為供試品。取穿破石對照藥材8 g，加20 mL乙酸乙酯，超聲30 min，過濾，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL溶解，作為穿破石的對照品。取缺穿破石的相同工藝制成的藥材2 g，后面同供試品從“加20 mL蒸餾水溶解”起制備陰性對照品。照薄層色譜法(通則0502)試驗(yàn)，吸取上述5種溶液各10 uL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水( 7∶3∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以9 %的三氯化鐵溶液，斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，與穿破石對照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色斑點(diǎn)。陰性對照溶液無相應(yīng)的斑點(diǎn)；陰性對照無干擾。具體如圖5所示。

2.3 含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Zorbax C18(250 mm ×4.6 mm,5μm)，流動相為甲醇-水(25∶75，V/V) ；流速為1.0 mL/min，檢測波長為230 nm，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量為20 μL。理論塔板數(shù)以白芍苷峰計算應(yīng)不低于2000。

2.3.2 供試品、陰性對照與對照品溶液的制備 取金沙排石沖劑研細(xì)，精密稱定2.0 g，置于50 mL容量瓶中，加50%甲醇適量，超聲5.0 min，放冷，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液經(jīng)微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。另取缺白芍的陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制備陰性對照溶液。精密稱取干燥至恒重的白芍苷標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，加50 %的甲醇溶解，定容于10 mL容量瓶中，制成每1 mL含1 mg的對照品溶液。

2.3.3 供試品、陰性對照與對照品溶液的高效療相色譜 精密吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液等3種溶液，在“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定。結(jié)果，白芍苷峰保留時間為14.36 min，雜質(zhì)峰與樣品峰分離完全，不干擾白芍苷的測定；理論塔板數(shù)按白芍苷峰計算不低于3000。白芍苷的HPLC如圖6所示。

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.3.2”項(xiàng)下對照品溶液適量，用50%甲醇稀釋成濃度分別為200、100、50、25、10、5、2.5 μg/mL的對照品溶液系列，搖勻, 經(jīng)微孔濾膜濾過,各取5 μL，按照“2.3.1”色譜條件進(jìn)樣測定。以白芍苷進(jìn)樣量(X,μg)對峰面積積分值(Y) 進(jìn)行線性回歸, 得回歸方程為Y=21238X-59110(r=0.9992)。結(jié)果表明,白芍苷進(jìn)樣量在2.5～200.0 μg范圍內(nèi)與其峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.3.2”項(xiàng)下方法所得對照品溶液，按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣測定5 次，測得白芍苷峰面積的RSD為2.17 %(n=5)，表明儀器精密度良好。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批金沙排石沖劑6份，分別按照“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果白芍苷平均含量為0.077 mg/g，RSD為1.67%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取按照“2.3.2”項(xiàng)下所得同一份供試品溶液，分別于0、2、4、6、8 h，按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測定白芍苷峰面積的RSD為1.01 %(n=5)，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn) 取“2.3.5”項(xiàng)下已測知白芍苷含量的金沙排石沖劑6份，每份2.5g，精密稱定，分別精密加入適量對照品溶液，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計算加樣回收率。結(jié)果白芍苷的平均回收率為98.05%，RSD為1.65%。

2.3.9 樣品含量測定 取金沙排石沖劑樣品3批，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，測定白芍苷含量。結(jié)果見表1。

表1 金沙排石沖劑中白芍苷含量測定結(jié)果(n=5)

3 討論

泌尿系結(jié)石是臨床的常見病和多發(fā)病，在中醫(yī)又稱尿石癥、石淋，是指晶體物質(zhì)在腎和膀胱內(nèi)形成及下移所引起的一組疾病，在泌尿系疾病中列第3 位，是臨床常見急癥之一[5]，其首要病因?yàn)闈駸嶂疤N(yùn)結(jié)于下焦，濕熱相煎，猶如湯瓶在火中加熱，久而久之則瓶中結(jié)成水垢[6]，日久停留，氣病及血，血亦因之不行[7]。濕熱和瘀血為導(dǎo)致該病的病機(jī)，因此，用藥多從清熱利濕、活血化瘀、排石止痛立法，中醫(yī)藥治療尿石癥的療效已得到臨床驗(yàn)證，結(jié)石直徑<1.0 cm 的排石總有效率達(dá)73%～98%[8]。經(jīng)我院長期臨床驗(yàn)證，驗(yàn)方排石湯對尿石癥具有明顯療效，方中廣金錢草清熱解毒通淋、化瘀利尿排石，海金沙清熱解毒、利水通淋，雞內(nèi)金通淋化堅消石，三金配合，具有良好的排石通淋效果；白芍養(yǎng)血柔肝止痛，并能減輕或消除炎癥反應(yīng)，與炙甘草配伍能松馳輸尿管、膀胱等平滑肌[9]，緩急止痛，利于結(jié)石排出；澤瀉利水滲濕泄熱，抑制結(jié)石形成[10]；石韋利尿通淋排石并有保護(hù)腎臟的作用[11]；威靈仙通絡(luò)止痛；穿破石活血止痛；茯苓利水，諸藥相合，共奏清熱利濕、利尿通淋、化瘀排石止痛之功。

排石湯在我院臨床應(yīng)用多年，其療效明顯，為保證臨床療效和推廣應(yīng)用，本研究團(tuán)隊(duì)將研究可知，該沖劑排石湯研制成金沙排石沖劑，并建立質(zhì)量控制方法。研究可知，該沖劑制備工藝簡單可行。經(jīng)專屬性、重復(fù)性考察，方中金錢草、穿破石、澤瀉、炙甘草、白芍，可用于薄層色譜鑒別試驗(yàn)，本項(xiàng)目初擬選擇石韋中主要成分綠原酸作為研究對象[12]，但實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在陰性對照溶液中相同的位置也檢測出綠原酸，因廣金錢草也含有綠原酸而對實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生干擾。前期研究證實(shí)，白芍苷含量可作為白芍飲片湯劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究對象，以白芍苷為質(zhì)量控制指標(biāo)，方法簡便、準(zhǔn)確、可靠，可用于金沙排石沖劑中白芍苷的質(zhì)量控制[13]，故選擇白芍苷作為質(zhì)量控制指標(biāo)。采用HPLC法測定芍藥苷時，曾以甲醇-水(30∶70)流動相來試驗(yàn)[14]，但樣品峰和雜質(zhì)峰分離不好。經(jīng)對流動相的多次篩選，最終選用甲醇- 水(25∶75)為流動相測定，色譜圖中樣品峰與雜質(zhì)峰分離效果好，重現(xiàn)性好。

研究結(jié)果顯示，本制備方法簡便可行，薄層色譜準(zhǔn)確度較高，分離度好，含量測定方法可靠，重現(xiàn)性和精密度較好，可用于金沙排石沖劑的制備及質(zhì)量評價。

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PreparationMethodandQualityStandardsResearchofJinshapaishiGranules

LIU Chuanyu DENG Jungang TANG Jianhong*HE Jie

Affiliated hospital of Guilin medical University, Guilin 541001, China

ObjectiveTo establish the preparation method and the quanlity standards of Jinshapaishi granules.MethodsJinshapaishi granules were prepared with the water decoction and alcohol precipitation technique. Alisma plantago-aquatica Linn, radices paeoniae alba , Cudrania cochin chinensis , Glycyrrhiza uralensis Fisch were identified by thin layer chromatography(TLC). The contents of Albiflorin were determined bu high performance liquid chromatography(HPLC).ResultsThe TLC method used in the identification of Alisma plantago-aquatica Linn, radices paeoniae alba , Cudrania cochin chinensis , Glycyrrhiza uralensis Fisch was highly specific with good reproducibility. Using the HPLC method to determinate the albiflorin in the granules,the linear range of it was from 2.5 μg to 200 μg (r=0.9992) and the average recovery rates was 98.05%,RSD=1.65%(n=6).ConclusionThe preparation method was reasonable, simple and feasible,and the estabilished quality standards can provide the guarantee for clinical efficacy.

Jinshapaishi Granules; Quality Standard; TLC;HPLC

廣西中醫(yī)藥科技專項(xiàng)課題(GZZJ13-18)。

劉川玉(1965-)，男，漢族，本科，副主任藥師，研究方向?yàn)橹兴帉W(xué)。E-mail:1046728261@qq.com

唐建紅(1967-)，女，漢族，碩士研究生，副主任藥師，研究方向?yàn)橹兴帉W(xué)。E-mail:tih@glmv.edu.cn

R284.2

A

1007-8517(2017)23-0029-05

2017-10-20 編輯：鄧佳麗)