*

1.南京中醫(yī)藥大學藥學院，江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210046；2.河南科技大學化工與制藥學院，河南 洛陽 471023

水生藥用植物黑三棱對多環(huán)芳烴的吸收、分布和代謝研究

戴仕林1王新勝2吳啟南1*

1.南京中醫(yī)藥大學藥學院，江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210046；2.河南科技大學化工與制藥學院，河南 洛陽 471023

目的分析黑三棱對菲和芘的吸收、分布、代謝，為進一步研究多環(huán)芳烴對三棱藥材品質的影響提供依據(jù)。方法采用GC-MS對黑三棱植物的根、莖、葉以及沉積物中的菲、芘進行含量測定。結果200 mg/kg條件下，菲和芘在黑三棱植物根、莖、葉以及沉積物中的含量高于50 mg/kg生長條件下各部分的含量；200 mg/kg生長條件下，菲和芘在塊莖中的含量高于葉，50 mg/kg生長條件下則相反；沉積物中含有菲和芘的降解中間產(chǎn)物鄰苯二酚。結論黑三棱對多環(huán)芳烴有較強的吸收、富集能力；菲和芘的濃度對黑三棱的生長及在植物體內的分布有著重要影響，其降解途徑與植物及其根際微生物的聯(lián)合作用有關。

黑三棱；多環(huán)芳烴；GC-MS；代謝

多環(huán)芳烴(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，簡稱PAHs)是指分子中含有兩個或兩個以上苯環(huán)以線狀、角狀或簇狀排列的稠環(huán)型化合物，包括菲(Phe)、芘(Pyr)、萘(Nap)等150余種化合物[1]。研究表明，多種PAHs具有致癌、致畸、致突變作用[2]，引起世界各國的重視。由于PAHs具有疏水性，沉積物中可檢測到多種PAHs[3-7]。植物生態(tài)修復具有不破壞生態(tài)環(huán)境的特點，受到越來越多研究者的關注[8-9]，吸收、富集或轉化有毒、有害物質，從而達到修復的目的。另一方面，由于PAHs的生物富集性，通過食物鏈會影響到人類身體健康，研究表明，有機物污染物進入植物體主要途徑是通過根部吸收和植物葉片吸收[10]，根系吸收主要通過共質體傳輸和質外體傳輸兩種主要途徑[11]；與陸生植物相比，多環(huán)芳烴在水生植物的吸收、富集、分布和代謝研究較少[12]。黑三棱科植物黑三棱(SparganiumstoloniferumBuch.-Ham)是典型的水生藥用植物，主要分布在中國、日本、韓國[13]，歐洲和非洲等地也有分布，其塊莖為常用中藥，具有破血行氣，消積止痛的功效[14]。水生藥用植物是一類特殊環(huán)境下的中藥資源，水環(huán)境的改變對藥材品質有很大影響[15]。筆者以黑三棱植物為研究對象，采用GC-MS分析其對菲和芘的吸收、分布和代謝狀況，為進一步研究水環(huán)境改變對三棱藥材品質影響提供基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器 GC-MS(Agilent GC6980/5973MSD)；12孔固相萃取裝置(美國Sigma公司)；BT125型電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司)；KH300SP型超聲儀(300 W；昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；EPED超純水系統(tǒng)(南京易普易達科技發(fā)展有限公司)；TGL-16C型離心機(上海安亭科學儀器廠)；DCY-12S型氮吹儀(青島?？苾x器有限公司)；R-3旋轉蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司)。

1.2 試藥 菲(98%，批號：101081681)、芘(98%，批號：101024057)購于美國Sigma公司；StrataPAH固相萃取小柱(美國Phenomenex公司)；甲醇(色譜純，批號：1799107539，德國Merck公司)；乙腈(色譜純，批號：JA040830，德國Merck公司)；超純水由實驗室自制；其它化學試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 樣品來源及處理

1.3.1 污染沉積物的配制 將采自南京中醫(yī)藥大學藥苑，未被PAHs污染的粘土(有機質0.3%，pH：6.09，速效N、P、K分別是10.63、1.00、56.00 mg/kg)，自然晾干，過2 mm篩，加入菲和芘的丙酮溶液，其中，高污染組(菲+芘，200 mg/kg)，低污染組(菲+芘，50 mg/kg)，以加入等體積丙酮的沉積物為對照[16]。

1.3.2 樣品采集和處理 黑三棱幼苗采自南京市浦口區(qū)石橋鎮(zhèn)，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學吳啟南教授鑒為黑三棱科植物黑三棱(SpargniumstoloniferumBuch-Ham)，選擇長勢均勻的黑三棱植物幼苗，洗凈泥土，種植于不同污染程度的沉積物中。室外培養(yǎng)，及時加水，維持水深，實驗過程中加入肥料以保證三棱生長需求，連續(xù)培養(yǎng)5個月后，分別采集兩組的根、塊莖、葉以及沉積物，自然晾干，備用。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備 精密稱取適量菲和芘，置于2 mL容量瓶中，乙腈定容，稀釋成不同濃度的對照品溶液，13000 rpm/min離心15 min后，備用。

2.2 供試品溶液的制備 分別精密稱取兩組的根、塊莖、葉以及沉積物樣品各5 g，分別置于具塞三角瓶中，分別加入正己烷-丙酮(1∶1)50 mL，超聲提取3次，提取液合并，3 ℃減壓回收溶劑至干，分別用乙腈-水(25∶75)50 mL洗滌殘渣，固相小柱萃取，分別用5 mL甲醇-水(1∶1)沖洗，抽干溶劑，再分別以6 mL二氯甲烷洗脫，氮氣吹干，以0.5 mL乙腈溶解，高速離心，備用。

2.3 色譜條件

2.3.1 菲和芘的色譜條件 GC條件：HP-5MS 30 m×0.250 mm毛細管色譜柱(Agilent公司)，載氣為高純He，進樣口溫度240 ℃不分流進樣，進樣量為1μL，初始溫度80 ℃以25 ℃/min升到140 ℃，然后以15 ℃/min，升到250 ℃，保留14 min。MSD條件：EI電離源70 eV，質量范圍35～400 amu，離子源溫度230 ℃，選擇離子檢測(SIM)模式，菲和芘的定量離子分別為178和202。

2.3.2 菲和芘降解產(chǎn)物分析的色譜條件 GC條件：HP-5MS 30 m×0.250 mm毛細管色譜柱(Agilent公司)，載氣為高純He，進樣口溫度240 ℃，頂空進樣。初始溫度40 ℃，以5 ℃/min升到250 ℃，保持5 min，保留14 min。MSD條件：EI電離源70 eV，質量范圍45～650 amu。

2.4 標準曲線制定 取不同濃度的對照品溶液，按照“2.3.1”項下的色譜條件進行分析，以峰面積為縱坐標y，對照品溶液濃度為橫坐標x，進行線性回歸，繪制標準曲線和計算相關系數(shù)r。菲的標準曲線分別為：y=1.35×108x-197190，r=0.9999，線性范圍為0.215～215 μg/mL；芘的標準曲線為：y=1.75×108x-192435，r=0.9999，線性范圍為0.146～146 μg/mL。菲和芘線性關系良好。

2.5 結果

2.5.1 含量測定 按照“2.3.1”項下的色譜條件進行分析，菲和芘的選擇離子掃描圖見圖1。采用標準曲線法測定菲和芘在黑三棱根、塊莖、葉以及沉積物中的含量，測定結果見表1。在高污染組，菲和芘在黑三棱根、塊莖、葉以及沉積物中的含量明顯高于低污染組。菲和芘在沉積物中的含量最高，其次是根；兩者在葉和塊莖中的含量，受污染程度高低影響而不同，高污染組中，塊莖中含量較高，低污染組中葉子中含量較高。

表1 不同樣品中菲和芘含量

組別PAHs沉積物根葉塊莖高污染組菲54294±8198 24643±3173 0593±00491002±0094芘101088±1812 54937±51310905±00421279±0114低污染組菲9062±42951837±01090331±00300171±0011芘30062±3302614217±11150400±00290260±0019對照組菲NDNDNDND芘NDNDNDND

2.5.2 沉積物的GC-MS分析 按照2.3.2項下菲和芘降解產(chǎn)物的色譜分析條件，對沉積物進行GC-MS分析，總離子流圖譜如圖2所示，降解產(chǎn)物用面積歸一化法計算各個化學成分峰面積的相對百分含量，通過質譜數(shù)據(jù)庫檢索與標準圖譜對照。結果見表2。

表2 菲和芘的降解產(chǎn)物

峰序號保留時間/min有機物相對百分含量/%119621，3-戊二烯05222058丙酸025322222-甲基丙醛167442380甲酸己酯021525023，4-二甲基-己酮111625713-甲基-呋喃055726262-甲基-3-丁烯-2-醇08082818乙酸01293112戊醛3573103659己酮0281143093-甲基-3-丁烯-1-醇0131243433-甲基-1-丁醇0161345552-甲基-2-丁烯醛009145075甲苯0171552332-甲基-2-丁烯-1-醇0151657391，3-二甲氧基-丙烷0031757806-甲氧基-2-己醇0251858282，3-丁二醇012196690糠醛0192067653-甲基-丁酸021217812山梨酸0202289892，5-二甲基-2，4-己二烯0342310426苯甲醛0342410747鄰苯二酚5002513019苯乙醛0226146543，7-二甲基-2，6-辛二烯-3-醇06927149141-甲基-3-環(huán)己烯-1-醇0152815276苯乙醇0052917596十二烷01130238092，3-二甲基-環(huán)己-1，3-二烯0653125868順-α-沒藥烯0203226696甲基β-萘酮39233270862，2-二甲基-1-苊酮012

2.6 結論 黑三棱對多環(huán)芳烴有較強的吸收、富集能力；菲和芘的濃度對黑三棱的生長及在植物體內的分布有著重要影響，其降解途徑與植物及其根際微生物的聯(lián)合作用有關。

3 討論

由菲和芘在黑三棱植物的根、塊莖、葉及沉積物中含量可知，黑三棱對菲和芘有較強的吸收、富集能力，且與沉積物受污染的程度呈正相關，污染程度越高，對菲和芘富集越多。

多環(huán)芳烴是通過植物根系的吸收、富集而轉運到其它組織[17-19]，沉積物中菲和芘被黑三棱的根系吸收、富集后，轉運到塊莖、葉子等組織，高濃度(200 mg/kg)菲和芘可能抑制了轉運，使得塊莖中的含量高于葉；研究表明菲和芘在低濃度(50 mg/kg)時，可促進植物生長[20]，轉運加快，因此葉中的菲和芘含量高于塊莖。菲和芘分別為三環(huán)和四環(huán)類多環(huán)芳烴，由表1可知黑三棱對四環(huán)芘吸收、富集能力高于三環(huán)菲，但四環(huán)芘比三環(huán)菲在沉積物中殘留更持久，這與Sun等[21]和Chiapusio等[22]報道一致。

沉積物中多環(huán)芳烴的降解機制主要有植物直接吸收、植物釋放生物酶促進降解以及植物與根際微生物的聯(lián)合作用降解[23]，其中微生物聯(lián)合降解多環(huán)芳烴的過程中會產(chǎn)生鄰苯二酚或取代鄰苯二酚的中間代謝產(chǎn)物[24]，然后進一步裂解、開環(huán)進入三羧酸循環(huán)。從降解產(chǎn)物分析結果中含有鄰苯二酚可知，實驗中菲和芘的降解可能與植物及其根際微生物的聯(lián)合作用有關。

通過對菲和芘在黑三棱不同部位和沉積物中含量分布及降解產(chǎn)物分析，為進一步研究和探討多環(huán)芳烴進入黑三棱植物體內的生物學過程及外源污染物對三棱藥材品質的影響提供實驗基礎。

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Absorption,DistributionandMetabolismofPAHsinAquaticMedicinalPlants-SparganiumstoloniferumBuch.-Ham.

DAI Shilin1WANG Xinsheng2WU Qinan1*

1.School of pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Jiangsu Collaborative Innovation Centre of Chinese Medicinal Resources Industrialization, Nanjing 210046, China;
2.School of Chemical Engineering and Pharmacy of Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, China

ObjectiveAnalysis the absorption, distribution and metabolism of PAHs inSparganiumstoloniferumBuch.-Ham. and provide a basis for the effect of PAHs on the quality of Sparganii Rhizoma.MethodsThe contents of Phe and Pyr in roots, stems, leaves ofSparganiumstoloniferumBuch.-Ham and sediments were determined by GC-MS.ResultsUnder the condition of 200 mg/kg, the contents of Phe and Pyr in roots, stems, leaves and sediments were higher than those under the condition of 50 mg/kg. The contents of Phe and Pyr in tuber were higher than that in leaves and the result was reversedunder the condition of 50 mg/kg.Thecatechol was found in degradation intermediates.ConclusionThe ability of absorption and enrichment ofPAHs ofSparganiumstoloniferumBuch.-Hamwas powerful. The growth ofSparganiumstoloniferumBuch.-Ham was affected by the concentration of Phe and Pyr. The degradation pathway was related to the combined effect of plant and rhizosphere microorganisms.

Sparganiumstoloniferum; PAHs; GC-MS; Metabolism

藥物研究

國家自然基金項目(81073002);江蘇省高校優(yōu)勢學科建設項目。

戴仕林(1985-)，男，漢族，碩士研究生，實驗師，研究方向為中藥品質評價。E-mail:leonard2511@126.com

吳啟南(1963-),男，漢族，教授，研究方向為中藥資源及品質評價。E-mail：qnwyjs@163.com

R284.1

A

1007-8517(2017)23-0021-05

2017-10-25 編輯：鄧佳麗)