陳雪峰， 蔡國強(qiáng)， 范 華， 劉 歡

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 引言

發(fā)菜，學(xué)名發(fā)狀念珠藻，是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高的光能自養(yǎng)型陸生藍(lán)細(xì)菌.在我國，野生發(fā)菜主要分布在干旱、半干旱的荒漠及半荒漠地帶[1-3].發(fā)菜胞外多糖是發(fā)菜生長過程中分泌在細(xì)胞外的活性多糖，具有抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、提高免疫力等生物活性，可以保護(hù)細(xì)胞，抵抗外界惡劣環(huán)境，賦予發(fā)菜較高的食用和藥用價(jià)值[4-6].然而，發(fā)菜因?yàn)樯L緩慢和過度采掘致使野生發(fā)菜資源瀕臨滅絕.如何通過人工培養(yǎng)的方式提高發(fā)菜及其胞外多糖的產(chǎn)量成為亟待解決的問題[7，8].

王貴春[9]發(fā)現(xiàn)在0.3 M鹽濃度下，發(fā)菜胞外多糖產(chǎn)量較正常培養(yǎng)條件下提高了50.3%.趙秀霞[10]對(duì)0 M和0.3 M鹽濃度下的發(fā)菜細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，得到13 170條差異表達(dá)基因，其中3 115條上調(diào)表達(dá)基因，10 055條下調(diào)，差異表達(dá)基因的GO功能聚類和Pathway代謝通路分析表明，涉及到光合作用、糖酵解/糖合成、Na+/K+運(yùn)輸、能量代謝、核糖體代謝、次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成等眾多通路的基因都出現(xiàn)一定程度的差異表達(dá)[11,12].糖基轉(zhuǎn)移酶是多糖合成途徑中的重要酶，作用是催化活性糖基從糖基供體轉(zhuǎn)移到糖基受體，形成特異的糖苷鍵，進(jìn)而參與多糖重復(fù)單元的組裝，對(duì)于多糖合成具有重要的調(diào)控作用[13,14].前期轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)菜糖基轉(zhuǎn)移酶基因在0.3 M鹽濃度下轉(zhuǎn)錄水平較0 M提高了2.29倍.

本文對(duì)發(fā)菜中的糖基轉(zhuǎn)移酶基因進(jìn)行了克隆及生物信息學(xué)分析，并構(gòu)建其重組表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌中成功高效表達(dá).為發(fā)菜多糖合成調(diào)控機(jī)理的研究奠定了一定的理論基礎(chǔ),為糖基轉(zhuǎn)移酶基因工程菌株的構(gòu)建提供理論依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)所用發(fā)菜、質(zhì)粒pET-28a由陜西科技大學(xué)微生物制造研究室保藏;大腸桿菌BL21、DH5α感受態(tài)細(xì)胞以及各種試劑盒購于天根生化科技(北京)有限公司;pMD19T載體和各種限制性內(nèi)切酶購于TaKaRa寶生物工程有限公司;溴酚藍(lán)購于沈陽試三生化科技開發(fā)有限公司;考馬斯亮藍(lán)、SDS和甘氨酸購自美國Sigma公司;巰基乙醇來自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;30% 丙烯酰胺和TEMED來自碧云天生物技術(shù)公司.

1.2 儀器與設(shè)備

DYCZ-24EN蛋白電泳儀，江蘇興化市分析儀器廠;LDZX-30KBS高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠;MGC-400HP光照培養(yǎng)箱，上海善志儀器設(shè)備有限公司;HH-4恒溫水浴鍋，金壇市宏華儀器廠;Mastercycler nexusPCR儀，德國Eppendorf公司;DYY-2C瓊脂糖凝膠電泳儀，北京市六一儀器廠;FR-980A生物電泳圖像分析系統(tǒng)，上海復(fù)日科技有限公司.

1.3 方法

1.3.1 目的片段TA克隆

按照天根生化科技(北京)有限公司的植物基因組提取試劑盒方法提取發(fā)菜基因組DNA,根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果及NCBI相似基因序列同源比對(duì)分析后進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，上游引物的序列為G1：5′-ATGCAAATTCTGATTTAT-3′，下游引物的序列為G2：5′-TCAAATATCAACAAGTG-3′，由上海捷瑞生物工程有限公司合成.PCR反應(yīng)體系為：發(fā)菜基因組DNA 2μL，上下游引物各1μL，2×Taq PCR MasterMix 10μL，ddH2O 6μL.擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，35 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min.1%瓊脂糖電泳檢測并回收產(chǎn)物，與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，篩選陽性克隆進(jìn)行菌液PCR檢測后送至北京奧科鼎盛生物科技公司測序.

1.3.2 序列分析

將測序結(jié)果提交BLAST進(jìn)行目的基因確認(rèn).使用DNAMAN軟件對(duì)基因序列推譯得到氨基酸序列，并和其他物種進(jìn)行同源性比對(duì)分析.運(yùn)用DNAstar對(duì)氨基酸序列進(jìn)行基礎(chǔ)性分析.利用ExPASy的ProtScale程序?qū)δ康牡鞍走M(jìn)行親水性和疏水性分析.利用DNAMAN和SOPMA軟件對(duì)糖基轉(zhuǎn)移酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析.利用TMHMM程序?qū)δ康牡鞍走M(jìn)行跨膜區(qū)分析.利用NetPhos3.1 Server對(duì)目的蛋白進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)分析.

1.3.3 糖基轉(zhuǎn)移酶的原核表達(dá)

根據(jù)測序結(jié)果，設(shè)計(jì)糖基轉(zhuǎn)移酶基因的擴(kuò)增引物，并在上下游的5′端添加BamHI和XhoI的酶切位點(diǎn)以及相應(yīng)的保護(hù)堿基(A1:5′-CGCGGATCCATGCAAATTCTGATTTAT-3′;A2:5′-CCGCTCGAGAATATCAACAAGTG-3′).PCR

擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min.反應(yīng)后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測.

以糖基轉(zhuǎn)移酶基因與pMD19-T連接而成的重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增.將純化后的PCR產(chǎn)物和pET28a質(zhì)粒用BamHI和XhoI分別進(jìn)行雙酶切后相連，得到蛋白基因表達(dá)載體.將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH5α培養(yǎng)，通過卡納青霉素篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行菌液PCR和雙酶切驗(yàn)證.以陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，并以終濃度1 mM的IPTG誘導(dǎo)目的基因表達(dá)，SDS-PAGE電泳進(jìn)行分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)菜以糖基轉(zhuǎn)移酶基因TA克隆

提取發(fā)菜DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果符合預(yù)期大小(如圖1所示).以發(fā)菜基因組DNA為模板，以G1和G2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，得到一條1 300 bp大小的特異性條帶，與預(yù)期大小相符(如圖2所示).將純化回收后的發(fā)菜以糖基轉(zhuǎn)移酶基因連接到pMD19-T 載體上，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，挑選陽性單克隆菌落，利用T載體通用引物對(duì)所選克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，結(jié)果顯示，成功篩得含有大小為1 500 bp(含克隆位點(diǎn)140 bp左右)的重組克隆載體的陽性菌株(如圖3所示)，表明發(fā)菜以糖基轉(zhuǎn)移酶基因成功克隆至pMD19-T 載體上.

M：λ DNA HindIII;1-2:發(fā)菜DNA圖1 發(fā)菜基因組DNA抽提電泳圖

M：DL2000；1：糖基轉(zhuǎn)移酶基因圖2 糖基轉(zhuǎn)移酶基因的PCR擴(kuò)增

M：DL2000；1-3：糖基轉(zhuǎn)移酶基因陽性轉(zhuǎn)化子圖3 陽性轉(zhuǎn)化子(DH5α)的PCR驗(yàn)證

2.2 發(fā)菜糖基轉(zhuǎn)移酶基因序列分析

糖基轉(zhuǎn)移酶基因與pMD19-T連接成功后，使用通用引物M13-47和RV-M對(duì)目的基因片段進(jìn)行雙向測序.結(jié)果表明：發(fā)菜糖基轉(zhuǎn)移酶基因大小為1 290 bp.由糖基轉(zhuǎn)移酶基因序列所推譯的氨基酸序列表明糖基轉(zhuǎn)移酶包含429個(gè)氨基酸殘基.通過DNAstar 8.0分析表明糖基轉(zhuǎn)移酶的帶電荷總氨基酸為112個(gè)，占總氨基酸殘基26.11%，其中帶正電荷61個(gè)，帶負(fù)電荷51個(gè).極性氨基酸共有95個(gè)，占22.14% ，疏水氨基酸有184個(gè)，占42.89%，酸性氨基酸和堿性氨基酸分別占8.86%和10.72%.在糖基轉(zhuǎn)移酶中含量最豐富的氨基酸為Leu(13.75%)、Ala(10.02%)、 IIe(7.93%)、Val(7.93%)、Gly(6.29%)，含量最少的氨基酸為Trp(0.70%)(如圖4所示).

圖4 糖基轉(zhuǎn)移酶DNA的核苷酸序列(上行)及推導(dǎo)的氨基酸序列(下行)

通過DNAMAN軟件將發(fā)菜中糖基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列及氨基酸序列與GenBank的同源物種序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)糖基轉(zhuǎn)移酶基因具有較高的保守性，與點(diǎn)狀念珠藻(Nostoc punctiforme PCC 73102)的核苷酸同源性達(dá)89.5%,與筒孢藻(Cylindrospermum stagnale PCC 7417)的核苷酸同源性達(dá)87.1%，與念珠藻(Nostoc sp.NIES 3756)的核苷酸同源性達(dá)76.5%，與節(jié)球藻(Nodularia spumigena CCY 9414)的核苷酸同源性達(dá)76.4%，與念珠藻(Nostoc sp.PCC 7524)的核苷酸同源性達(dá)73.5%，與多變魚腥藻(Anabaena variabilis ATCC 29413)的核苷酸同源性達(dá)71.3%，與水膠須藻(Rivularia sp.PCC 7116)的核苷酸同源性達(dá)70.2%，與側(cè)生藻(Fischerella sp.NIES 3754)的核苷酸同源性達(dá)69.1%(如圖5所示).與Nostoc sp.KVJ20、Nostoc punctiforme、Cylindrospermum sp.NIES-4074、Nostoc linckia NIES-25、Nostoc sp.NIES-3756、Scytonema hofmanni、Nodularia spumigena、Hassallia byssoidea VB512170、Mastigocladopsis repens、Cylinfrospermum stagnale、Tolypothrix campylinemoides、Nostoc calcicola、Chrysosporum ovalisporum的氨基酸同源性分別達(dá)92%、91%、84%、83%、79%、79%、79%、78%、77%、77%、77%、77%、76%(如圖6所示).

圖5 糖基轉(zhuǎn)移酶DNA 的核苷酸序列

圖6 糖基轉(zhuǎn)移酶DNA 的氨基酸序列

2.3 糖基轉(zhuǎn)移酶基因的疏水性、跨膜區(qū)、磷酸化位點(diǎn)分析及二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用ExPASy軟件對(duì)發(fā)菜糖基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列進(jìn)行疏水性分析，結(jié)果顯示第50位酪氨酸(Tyr)親水性最強(qiáng)，第120位脯氨酸(Pro)疏水性最強(qiáng).整體來看，親水性區(qū)間分布更廣，相對(duì)于疏水性區(qū)間較多，因此確定糖基轉(zhuǎn)移酶是親水性蛋白.

利用TMHMM程序?qū)μ腔D(zhuǎn)移酶進(jìn)行跨膜區(qū)分析，結(jié)果表明，糖基轉(zhuǎn)移酶不含跨膜區(qū).

利用NetPhos對(duì)糖基轉(zhuǎn)移酶的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明，糖基轉(zhuǎn)移酶有2個(gè)Tyr磷酸化位點(diǎn)、9個(gè)Thr磷酸化位點(diǎn)和18個(gè)Ser磷酸化位點(diǎn).

運(yùn)用DNAMAN軟件和SOPMA軟件對(duì)糖基轉(zhuǎn)移酶二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析，雖然不同軟件的算法存在差異，但經(jīng)綜合分析認(rèn)為，發(fā)菜糖基轉(zhuǎn)移酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要構(gòu)成方式為α螺旋和隨機(jī)卷曲(如表1所示).

表1 發(fā)菜糖基轉(zhuǎn)移酶二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果

2.4 糖基轉(zhuǎn)移酶在大腸桿菌中的表達(dá)

構(gòu)建糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)載體pET28a-glycosyl transferase,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌后通過卡納青霉素抗性挑選陽性克隆進(jìn)行PCR驗(yàn)證，得到1 600 bp大小的特異性條帶(加上克隆位點(diǎn)300 bp左右)，符合預(yù)期大小(如圖7所示).抽取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果在1290 bp處出現(xiàn)1條特異條帶，與預(yù)期片段大小一致(如圖8所示).測序結(jié)果表明插入的片段就是糖基轉(zhuǎn)移酶基因.

M：DL2000；1-3：糖基轉(zhuǎn)移酶基因重組質(zhì)粒陽性轉(zhuǎn)化子圖7 陽性轉(zhuǎn)化子(DH5α/pET28a-Glycosyl transferase)的PCR驗(yàn)證

1：DL2000；2：雙酶切后糖基轉(zhuǎn)移酶基因；3：重組質(zhì)粒雙酶切；4：雙酶切后pET28a；5：10 kb DNA ladder圖8 陽性轉(zhuǎn)化子(DH5α/pET28a-Glycosyltransferase)的酶切驗(yàn)證

將轉(zhuǎn)化成功的陽性菌接種到含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基，37 ℃，200 rpm培養(yǎng)至OD值為0.8時(shí)，加入IPTG使其濃度為1 mM，16 ℃，120 rpm培養(yǎng)20 h后取樣進(jìn)行電泳.SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果表明有外源蛋白表達(dá)(如圖9所示)，參照蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，外源蛋白分子量約為47.54 kDa，與預(yù)測的糖基轉(zhuǎn)移酶分子量相同.

M：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1: IPTG誘導(dǎo)的空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子；2：未誘導(dǎo)的陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子；3： IPTG誘導(dǎo)10 h的陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子；4：IPTG誘導(dǎo)15h的陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子；5：IPTG誘導(dǎo)20 h的陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子圖9 糖基轉(zhuǎn)移酶基因在大腸桿菌BL21中的表達(dá)

由于發(fā)菜全基因組尚未公布，因此通過BLAST比對(duì)高同源性的基因序列設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行克隆成為研究發(fā)菜基因的主要手段[15，16].所以本文根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果及同源比對(duì)分析設(shè)計(jì)引物進(jìn)行糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆，成功得到大小為1 290 bp的目的序列.經(jīng)同源性比較發(fā)現(xiàn)發(fā)菜糖基轉(zhuǎn)移酶基因具有較高保守性，與點(diǎn)狀念珠藻(Nostoc punctiforme PCC 73102)的核苷酸序列同源度達(dá)89.5%，與Nostoc sp.KVJ20的氨基酸序列同源度達(dá)97.3%.生物信息學(xué)分析表明糖基轉(zhuǎn)移酶是親水性膜外蛋白，有2個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)、9個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)以及18個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，二級(jí)結(jié)構(gòu)主要構(gòu)成方式為隨機(jī)卷曲和α螺旋，等電點(diǎn)為9.33，正負(fù)電荷氨基酸殘基數(shù)分別為61和51.這為進(jìn)一步研究糖基轉(zhuǎn)移酶基因在發(fā)菜多糖代謝中的分子調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ).此外，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了糖基轉(zhuǎn)移酶基因的高效表達(dá)載體，且表達(dá)蛋白以可溶性蛋白形式存在，這為今后糖基轉(zhuǎn)移酶基因工程菌株的構(gòu)建提供理論依據(jù).

3 結(jié)論

鹽脅迫下發(fā)菜多糖產(chǎn)量提高，糖基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào).這暗示基因可能是鹽脅迫下發(fā)菜胞外多糖代謝的關(guān)鍵調(diào)控因子，它們?cè)诎l(fā)菜響應(yīng)鹽脅迫過程中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用.糖基轉(zhuǎn)移酶可以催化活性糖基轉(zhuǎn)移，進(jìn)而形成多糖合成所必須的活性糖核苷酸前體物質(zhì)，參與多糖合成.說明發(fā)菜可能通過相關(guān)基因調(diào)控多糖合成途徑以響應(yīng)鹽脅迫，這也從分子層面為"鹽脅迫下發(fā)菜多糖產(chǎn)量明顯提高"這一結(jié)論提供依據(jù).然而，多糖代謝調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜的生物調(diào)控過程，參與基因眾多，它們?nèi)绾卧谵D(zhuǎn)錄水平調(diào)控多糖代謝以響應(yīng)鹽脅迫還需要進(jìn)一步研究.

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