黃 備，邵君波，周 斌，孟偉杰，羅韓燕

1.浙江省舟山海洋生態(tài)環(huán)境監(jiān)測站,浙江 舟山 316021 2.杭州師范大學(xué),浙江 杭州 311121

在土壤中生活著數(shù)量龐大的微生物種群，幾乎參與土壤中一切生物和生物化學(xué)反應(yīng)，擔(dān)負(fù)著地球碳、氮、磷、硫等物質(zhì)循環(huán)的調(diào)節(jié)器、土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化器和污染環(huán)境的凈化器等多方面生態(tài)功能，在有機污染物生物地球化學(xué)循環(huán)中起著十分關(guān)鍵的作用。微生物作為土壤生態(tài)環(huán)境的重要組成部分容易受到外源污染物影響，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性及其變化在一定程度上反映了土壤的質(zhì)量[1]。土壤微生物不僅是有機污染修復(fù)的重要資源，也具有指示土壤污染的潛力，對土壤微生物的研究十分必要。傳統(tǒng)的對土壤微生物的研究，往往受限于微生物的實驗室培養(yǎng)方法，據(jù)估算，每克土壤最多可能含有10億個微生物個體，100萬種不同的微生物[2]。但是由于現(xiàn)有的技術(shù)條件的限制，在眾多的微生物中只有不到1%的微生物能夠通過培養(yǎng)的方法分離出來。因此，傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)方法只能作為一種輔助工具，所得結(jié)果有很大的局限性，需要結(jié)合現(xiàn)代生物技術(shù)方法才能更客觀而全面地反映微生物群落結(jié)構(gòu)的真實信息。

宏基因組學(xué)作為分子生態(tài)學(xué)發(fā)展的典型技術(shù)策略，能夠從環(huán)境樣本中直接獲得總DNA進(jìn)行文庫構(gòu)建、測序，在整體水平解析微生物群落結(jié)構(gòu)，盡可能真實地揭示原位環(huán)境中微生物群落的復(fù)雜性和多樣性，在土壤微生物多樣性研究中顯示出強大的功能[3]。

椒江位于臺州地區(qū)東部，為浙江省第3條大河，擁有浙江省第三大港——海門港，椒江口兩岸是中國經(jīng)濟發(fā)展最為迅速的地區(qū)之一，醫(yī)藥化工行業(yè)、港口海運、船舶修造及水產(chǎn)品加工等多種臨海臨港工業(yè)及濱海旅游業(yè)成為椒江口經(jīng)濟發(fā)展的重要支撐[4]。河口地區(qū)有數(shù)個濱海化工園區(qū)，現(xiàn)有33家醫(yī)化企業(yè)，占地總面積為1.77 km2，固定資產(chǎn)為34億元，有1.23萬職工，年上繳稅收約5億元。目前，椒江的醫(yī)化行業(yè)作為生產(chǎn)特色原料藥及中間體的產(chǎn)業(yè)集聚群在全球醫(yī)化產(chǎn)業(yè)鏈中具有明顯的競爭優(yōu)勢，已形成了8大類在國際市場上有影響力和控制力的優(yōu)勢產(chǎn)品，有40多個品種在國際市場上有較高占有率[5]。

研究采用基于Illumina成熟的TruSeq邊合成邊測序技術(shù)的MiSeq高通量測序平臺對各點位環(huán)境微生物多樣性進(jìn)行了全面深入的調(diào)查。并應(yīng)用SPSS、CANOCO和R語言Vegan程序包等常用群落分析工具，對椒江河口微生物群落與環(huán)境因子(特別是典型污染物)之間的潛在聯(lián)系進(jìn)行了深入研究。分析椒江口微生物群落的結(jié)構(gòu)和空間差異，發(fā)掘其與環(huán)境的潛在聯(lián)系，以期為濱?；@區(qū)的環(huán)境評價與環(huán)境管理提供技術(shù)支撐。

1 實驗部分

1.1 樣品采集

在椒江化工園區(qū)污水入?？诟浇Ｓ蛟O(shè)置了8個海域生態(tài)監(jiān)測點位(C0～C7)，如圖1所示。2015年4月利用專業(yè)海洋調(diào)查船“浙海環(huán)監(jiān)”號，用靜力式采泥器采集各點位沉積物。取表層(5 cm)泥樣于滅菌的10 mL凍存管中，-20 ℃冷凍保存并帶回實驗室。

圖1 椒江口附近海域采樣點位示意圖Fig.1 Sampling sites of offshore marine area in Jiaojiang Estuary

1.2 總DNA提取

各點位采用TIANGEN TIANamp Soil DNA Kit試劑盒提取樣品總DNA，按標(biāo)準(zhǔn)流程操作，具體步驟為①取750 μL SA緩沖液和0.25 g玻璃珠至2 mL離心管；②在離心管中加入0.5 g沉積物樣品，渦旋混勻15 s；③再加入60 μL SC緩沖液，渦旋振蕩10 min至樣本混勻；④12 000 r/min離心1 min，轉(zhuǎn)移上清液至新的2 mL離心管；⑤加入5 μL Proteinase K溶液，混勻離心，56 ℃孵育10 min；⑥加入250 μL HA緩沖液，渦旋5 s，4 ℃放置5 min；⑦12 000 r/min離心1 min，轉(zhuǎn)移上清液至新的2 mL離心管，加入200 μL HB緩沖液，混勻，4 ℃放置5 min；⑧12 000 r/min離心1 min，轉(zhuǎn)移上清液至新的2 mL離心管，加入1 200 μL GF緩沖液，顛倒混勻；⑨取上述溶液于CB3吸附柱中(吸附柱放入收集管)，12 000 r/min離心30 s，棄廢液，將吸附柱放回收集管；⑩向吸附柱中加入500 μL PWS漂洗液，12 000 r/min離心30 s，棄廢液，將吸附柱放回收集管；向吸附柱中加入500 μL 70%乙醇，12 000 r/min離心30 s，棄廢液，將吸附柱放回收集管；12 000 r/min離心2 min，棄廢液；將吸附柱置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液，放入新的1.5 mL離心管中，向吸附膜的中央懸空滴加100 μL TE洗脫緩沖液，室溫放置5 min；12 000 r/min離心2 min，收集DNA溶液于離心管中，-20 ℃儲存待用。

1.3 測序文庫構(gòu)建與測序

測序樣品交由某生物科技公司按照16S宏基因組測序標(biāo)準(zhǔn)流程構(gòu)建環(huán)境微生物16S rRNA基因V3-V4可變區(qū)(引物序列：341F-CCTACGGGNGGCWGCAG；805R-GACTACH VGGGTATCTAATCC)測序文庫并進(jìn)行相應(yīng)的質(zhì)量控制，應(yīng)用Illumina MiSeq雙末端(250 bp×2)測序平臺完成序列測定。

1.4 測序數(shù)據(jù)分析

1.4.1 質(zhì)量控制

原始測序數(shù)據(jù)首先應(yīng)用FASTQC檢查測序質(zhì)量；然后用PRINSEQ及Fastx toolkit進(jìn)行質(zhì)量過濾，除去低質(zhì)量的reads，修剪接頭序列，并除去修剪后非常短的讀??；然后在FLASH中進(jìn)行序列融合；最后導(dǎo)入mothur篩查并去除嵌合體序列。

1.4.2 生物信息學(xué)分析

通過預(yù)處理獲得的高質(zhì)量序列應(yīng)用mothur按97%序列相似度劃分可操作分類單位(OTU)，計算α、β多樣性指數(shù)并繪制稀釋曲線，同時比對Silva v123數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分類學(xué)分析。

1.4.3 統(tǒng)計分析

對獲取的OTU及種類組成數(shù)據(jù)，結(jié)合環(huán)境因子，應(yīng)用SPSS、R語言vegan程序包等軟件，分析椒江口微生物群落的結(jié)構(gòu)和空間差異，發(fā)掘其與環(huán)境的潛在聯(lián)系。

1.5 海域生態(tài)環(huán)境監(jiān)測

椒江化工園區(qū)排污口附近海域生態(tài)環(huán)境監(jiān)測內(nèi)容包括水質(zhì)、底泥微生物和海洋生物。水質(zhì)調(diào)查項目：pH，化學(xué)需氧量，無機氮(硝酸鹽氮、亞硝酸鹽氮、氨氮)，活性磷酸鹽，石油類，汞，砷，銅，鎘，鉛，鋅，揮發(fā)性有機物和半揮發(fā)性有機污染物等；海域沉積物調(diào)查項目：粒度、石油類、汞、砷、銅、鎘、鉛、鋅、鉻、有機碳、總氮、總磷、硫化物、有機氯農(nóng)藥、多氯聯(lián)苯、多環(huán)芳烴。監(jiān)測采樣和分析方法按《海洋監(jiān)測規(guī)范》(GB 17378—2007)和《海洋調(diào)查規(guī)范》(GB 12763—2007)進(jìn)行，并全程實施了質(zhì)量控制。

2 結(jié)果與討論

2.1 海域沉積物微生物群落

2.1.1 序列統(tǒng)計

共獲得椒江口海域8個點位沉積物微生物原始序列861 685對(pair-end reads)，點位間序列數(shù)介于67 653～194 386條之間，序列平均長度為462 bp。所有原始序列均提交至NCBI SRA數(shù)據(jù)庫，收錄號為SRP067730。經(jīng)質(zhì)量控制和序列優(yōu)化，篩選出156 367條高質(zhì)量序列?？紤]到各點位測序數(shù)據(jù)差異較大，進(jìn)一步隨機抽樣將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，以平衡采樣誤差對后續(xù)分析的影響。原始序列通過預(yù)處理，按97%序列相似度進(jìn)行劃分，共得到564個OTU，其詳細(xì)分布見表1。

表1 海域沉積物微生物序列信息統(tǒng)計

應(yīng)用mothur軟件對優(yōu)化序列進(jìn)行隨機抽樣，以抽到的序列數(shù)與它們所能代表OTU的數(shù)目構(gòu)建稀釋曲線,見圖2。結(jié)果顯示，C0、C1、C2 3個河口點位曲線趨向平坦，而剩余點位也接近于拐點，這與原始序列數(shù)的分布情況一致，同時也說明各點位取樣數(shù)量合理，尤其在C1、C2點位，OTU取樣已達(dá)到飽和。

圖2 海域沉積物微生物稀釋曲線Fig.2 Rarefaction of marine sediment microbes

2.1.2 微生物種類組成

在椒江海域沉積物中鑒定得到古菌和細(xì)菌共33門275科396屬478種。變形菌門在各點位均表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢，其序列數(shù)占總數(shù)的62.1%。其他較為豐富的門類包括綠彎菌門，占6.2%；放線菌門，占5.9%；擬桿菌門，占5.9%。各點位門類組成詳見圖3。

圖3 海域沉積物微生物種類組成Fig.3 Species composition of marine sediment microbes

2.1.3 微生物多樣性

采用mothur軟件，按97%序列相似水平計算菌群豐度指數(shù)(Ace、Chao)、菌群多樣性指數(shù)(Shannon、Simpson)，并根據(jù)探測深度指數(shù)(Coverage)計算結(jié)果評估測序深度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各點位總體Ace、Chao的均值分別為511、518，點位間差異較小。而反映菌群多樣性的Shannon均為5.0左右，Simpson接近于0.02，顯示出C0～C7各點位微生物多樣性較高，且差異較小。各點位Coverage均超過0.99，說明各樣品文庫的覆蓋率較高，樣本中序列沒有被測出的概率極低，進(jìn)一步證實了稀釋曲線的結(jié)論。

表2 海域沉積物微生物多樣性指數(shù)

2.2 海域環(huán)境因子

按1.5節(jié)描述的方法開展研究海域環(huán)境調(diào)查，其中幾項主要因子監(jiān)測結(jié)果如表3所示。

表3 主要環(huán)境因子監(jiān)測結(jié)果

注：“*”為五氯聯(lián)苯(PCB101)，是一種常見的多氯聯(lián)苯(PCBs)。

2.3 對環(huán)境因子的響應(yīng)

應(yīng)用Canoco軟件，首先對微生物群落組成進(jìn)行降趨對應(yīng)分析(DCA)，計算得海域沉積物微生物群落中最大梯度長度值分別為0.408，因此選擇冗余性分析(RDA)進(jìn)一步開展環(huán)境因子與微生物群落的多元統(tǒng)計分析，并采用蒙特卡洛置換檢驗(9 999次)對排序結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)檢驗。

通過微生物門類多樣性與環(huán)境因子的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，在RDA排序圖中，第1軸和第2軸分別解釋了總變異的58.1%和18.9%(圖4)。蒙特卡洛排序檢驗表明，PCB101(F=7.36，P=0.01)、鹽度(F=3.32，P=0.021)、γ-氯丹(F=2.93，P=0.006)對微生物門水平的群落分布具有顯著性影響。

圖4 沉積物微生物組成與環(huán)境因子RDA排序Fig.4 RDA ordination of marine sediment microbes composition and environmental factors

變形菌門、放線菌門等多個類群在C0、C1、C2 3個近河口點位顯示出明顯的數(shù)量優(yōu)勢，古菌、螺旋體門和藍(lán)藻門則在遠(yuǎn)離河口(如C5、C6、C7)點位聚集。重金屬、多氯聯(lián)苯、有機氯化合物由河口向外海表現(xiàn)出濃度減少的趨勢，證實了陸源污染對該海域生態(tài)環(huán)境影響的重要性。

通過計算微生物門類組成與環(huán)境因子間Spearman相關(guān)系數(shù)并繪圖(圖5)可見，溫度、鹽度、pH與多個微生物門類的組成和分布呈現(xiàn)明顯的相關(guān)關(guān)系，證實河口區(qū)域環(huán)境特征的獨特性及由淡水向海水環(huán)境過渡區(qū)域沉積物微生物群落與所棲息環(huán)境的緊密聯(lián)系。結(jié)果顯示，多個待定菌群(如OD1、OP11、TM7、WS6)均與重金屬、多環(huán)芳烴化合物及滴滴涕濃度呈顯著正相關(guān)，反映出這些稀有類群微生物對特征污染物的指示意義，也反映了其對典型污染物的潛在降解或吸附能力。

圖5 沉積物微生物組成與環(huán)境因子Spearman相關(guān)系數(shù)示意圖Fig.5 Spearman correlation of marine sediment microbes′ composition and environmental factors

3 討論

海洋沉積物是地球上最復(fù)雜的微生物棲息地，它是集化學(xué)物質(zhì)和微生物于一體的特殊生態(tài)環(huán)境，海洋沉積物中蘊藏著豐富的微生物種質(zhì)和基因資源[6]。作為高壓、高鹽的特殊生境，沉積物中更可能富集功能特異的微生物類群，有研究表明，海洋微生物種類可能高達(dá)1 000萬[7]。海洋沉積物細(xì)菌群落是海洋生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分,在海洋碳、氮、磷、硫等生源要素的礦化和循環(huán)中具有關(guān)鍵作用[8]。

眾多學(xué)者對中國近海沉積物微生物群落進(jìn)行了研究。孫靜等同樣利用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)對中國黃東海近岸海域沉積物樣品原核微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性進(jìn)行研究，共獲得74個門類，其中變形菌門、浮霉菌門和泉生古菌門所占比例相對較高，分別占總數(shù)的44%、11.2%和9%，變形菌門在37個沉積物樣品中均是優(yōu)勢類群[9]。昝帥君應(yīng)用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)在遼河口沉積環(huán)境細(xì)菌群落的研究中，共發(fā)現(xiàn)30個群落類群，其中最大的優(yōu)勢群落為變形菌門，占總?cè)郝涞?0%左右；其次為藍(lán)藻門，占總?cè)郝?0%左右；放線菌門占比為10%左右，其他群落占比約為10%[10]。同樣，方蕾等[11]在遼寧盤錦雙臺口濱海濕地沉積物的細(xì)菌多樣性研究中，鑒定出24門，其中最大的優(yōu)勢群落為變形菌門，占總?cè)郝涞?3%。宋志剛等、劉欣等、張健等[12-14]分別利用PRC-DGGE等技術(shù)對中國近岸海域進(jìn)行了表層沉積物多樣性研究，結(jié)果表明變形菌門在黃海、東海及膠州灣海域沉積物樣品中均是最大的優(yōu)勢類群。本研究結(jié)果與上述研究有相似之處，變形菌門在各點位均表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢，其序列數(shù)占總數(shù)的62.1%。但本研究發(fā)現(xiàn)的微生物門類數(shù)為33個，小于黃東海的調(diào)查結(jié)果，門類數(shù)及變形菌門所占比例與遼河口的調(diào)查結(jié)果非常接近，這是由于2個海域自然環(huán)境比較接近。但除了變形菌門這個最大的優(yōu)勢群落外，其他主要類群在各研究中均不盡相同，顯現(xiàn)出中國沿海沉積物微生物群落豐富的多樣性。

PCB101是一種常見的PCBs組分，在環(huán)境中檢出率高、含量高且較難降解，是公認(rèn)的一類最復(fù)雜的內(nèi)分泌干擾物[15]。椒江工業(yè)園區(qū)是浙江省經(jīng)濟建設(shè)的重要區(qū)域，研究證實PCBs各組分含量長期居高不下，有機污染問題不容忽視[16-17]。該次監(jiān)測結(jié)果顯示，PCB101在C0、C1、C2 3個河口點位均有檢出，平均濃度占總PCBs含量的13.7%。γ-氯丹是一種有機氯殺蟲劑，為深琥珀色黏性液體，常用于殺滅地下害蟲(如螻蛄、地老虎、稻草害蟲等)，對防治白蟻效果顯著。由于河流的遷移運輸，椒江河口海域常出現(xiàn)有機氯農(nóng)藥的高值區(qū)[18]。該次監(jiān)測結(jié)果顯示，γ-氯丹在C1～C4點位均有檢出，平均濃度占總有機氯含量的20.2%，僅次于p，p’-DDE(39.6%)和p，p’-DDD(38.2%)，且各點位間差異顯著，C2點位達(dá)到最高值0.77 mg/kg，其余3個點位均在0.10 mg/kg左右。持續(xù)性的陸源有機氯輸入對河口生態(tài)環(huán)境造成直接影響，雖然中國已陸續(xù)禁用部分有機氯農(nóng)藥，但在沿海海域有機氯農(nóng)藥經(jīng)常性地被檢測出，因此開展沉積物環(huán)境殘留有機氯化合物的微生物降解及其生態(tài)影響研究仍具有重要意義。國內(nèi)很多學(xué)者對持久性有機污染物的海洋微生物降解進(jìn)行了深入研究[19]，但有關(guān)海洋微生物群落對污染物濃度的響應(yīng)還未見報道，本研究揭示了PCB101、γ-氯丹等對微生物門類分布有顯著影響。

河口的環(huán)境特征異常復(fù)雜，那些在淡水與海水中具有顯著差別的環(huán)境因子很有可能使其他一些因素對微生物群落變化的影響變得更為模糊。研究在海域沉積物各點位觀察到明顯的自河口內(nèi)側(cè)向外海的鹽度梯度。鹽度是近岸海域解釋生物群落變化最重要的環(huán)境因子。有研究證實，椒江河口變形菌門和放線菌門的不同類群受鹽度支配分別占據(jù)淡水和海水區(qū)域，氨氧化菌的分布也受到鹽度的顯著影響[20]。昝帥君的研究揭示，遼河口沉積環(huán)境細(xì)菌群落多樣性隨鹽度遞減。本研究表明，鹽度和pH與多個微生物門類的組成和分布呈現(xiàn)明顯的負(fù)相關(guān)，但由于河口環(huán)境復(fù)雜多變，要厘清自然環(huán)境因子與典型有機污染物對微生物組成和分布的各自影響和特征，需要繼續(xù)開展分析研究。

4 結(jié)論

1)應(yīng)用Illumina MiSeq宏基因組高通量測序技術(shù)，在椒江口海域沉積物中鑒定得到古菌和細(xì)菌共33門類，變形菌門為明顯的優(yōu)勢門類，其序列數(shù)占總數(shù)的62.1%。其他較為豐富的門類包括綠彎菌門、放線菌門、擬桿菌門。

2)椒江口海域菌群豐度指數(shù)Ace和Chao的均值分別為511、518，點位間差異較小。Shannon菌群多樣性指數(shù)均在5.0左右，Simpson指數(shù)接近于0.02，顯示出8個點位微生物多樣性較高，且差異較小。

3)通過微生物門類多樣性與環(huán)境因子的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，PCB101、鹽度、γ-氯丹對微生物門水平的群落分布具有顯著性影響。計算微生物門類組成與環(huán)境因子間Spearman相關(guān)系數(shù)并繪圖分析，溫度、鹽度、pH與多個微生物門類的組成和分布呈現(xiàn)明顯的相關(guān)關(guān)系。

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