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大白菜基因組DNA快速提取方法的研究

2018-01-12 00:42王超楠溫娟娟
華北農(nóng)學(xué)報(bào) 2017年6期
關(guān)鍵詞:凝膠電泳離心管丙烯酰胺

王 濤,王超楠,張 紅,溫娟娟,張 斌

(1.天津師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,天津 300387;2.天津科潤(rùn)蔬菜研究所,蔬菜種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津市蔬菜遺傳育種企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300381)

植物基因組DNA的提取是重要的基礎(chǔ)性技術(shù),也是影響后續(xù)試驗(yàn)結(jié)果的關(guān)鍵步驟[1]。目前,常用的大白菜基因組DNA提取方法主要是CTAB法和SDS法[2],CTAB法中的CTAB能將破碎植物葉片細(xì)胞中的DNA溶解出來(lái),再經(jīng)氯仿-異戊醇抽提除去蛋白質(zhì),最后得到DNA。SDS法中的SDS在高溫條件下能裂解植物細(xì)胞,使染色體離析、蛋白質(zhì)變性,釋放出DNA。這2種方法提取的DNA濃度高,且基因組DNA的完整性好,在植物分子育種研究上具有廣泛的應(yīng)用,但是其缺點(diǎn)也是很明顯的,過(guò)程復(fù)雜,整個(gè)提取過(guò)程約3 h,效率低,無(wú)法滿(mǎn)足快速檢測(cè)的需要,而且所用到的有些試劑存在毒性,對(duì)人的身體健康會(huì)造成一定的危害[3]。隨著分子標(biāo)記技術(shù)在大白菜育種工作中的應(yīng)用,經(jīng)常需要對(duì)成千上萬(wàn)的大群體進(jìn)行DNA提取,如果應(yīng)用CTAB法或SDS法,則耗時(shí)長(zhǎng)且工作量巨大。而分子標(biāo)記輔助選擇、純度鑒定等工作中所需的DNA量不大[4],提取的DNA也不需要長(zhǎng)時(shí)間保存。因此,尋找一種簡(jiǎn)單、快速的DNA提取方法非常必要。

堿裂解法是一種快速提取植物基因組DNA的新方法,在堿性環(huán)境中,樣品的細(xì)胞膜和核膜被破壞[5],染色體DNA變性分開(kāi)[5],然后加入Tris-HCl在DNA提取液中起到緩沖液的作用,使DNA去質(zhì)子化,提高其溶解性[6]。這種方法提取的DNA量少、DNA保存時(shí)間短,但是操作過(guò)程簡(jiǎn)單,耗時(shí)短,能滿(mǎn)足基本的試驗(yàn)需要[7]。目前文獻(xiàn)報(bào)道的應(yīng)用此種方法提取基因組DNA的有高粱[8]、水稻[9]、大豆[10]、玉米[11]、番茄[12]等,而堿裂解法在十字花科植物,如對(duì)大白菜基因組DNA提取中還未見(jiàn)相關(guān)的報(bào)道。本研究對(duì)堿裂解法進(jìn)行了改進(jìn),并通過(guò)對(duì)幾種大白菜基因組DNA提取方法的比較,在保證試驗(yàn)結(jié)果的可靠性和提高試驗(yàn)效率的基礎(chǔ)上,旨在找到一種能夠快速提取大白菜基因組DNA的方法。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為抗根腫病的大白菜親本G57和感根腫病的大白菜親本G70,G70和G57雜交獲得F1,F(xiàn)1與感病親本G70回交構(gòu)建BC1群體,所有試驗(yàn)材料均由天津科潤(rùn)蔬菜研究所提供。

2016年3月將試驗(yàn)的種子播種到育苗盤(pán)中,正常管理,育苗培養(yǎng)30 d后,待幼苗長(zhǎng)到5~6片真葉時(shí)取樣,采集葉片2~3片保存于-80 ℃,用于DNA提取。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 CTAB法[13]①取大白菜真葉0.2~0.3 g(1 cm×1 cm)葉片加入1.5 mL離心管中,加50 μL 2%的CTAB提取緩沖液,研磨,補(bǔ)至400 μL,65 ℃水浴40 min,每10 min拿出輕搖一次;②加入400 μL氯仿∶異戊醇(24∶1),輕搖5 min;③12 000 r/min離心5 min;④取上清200 μL至新的1.5 mL離心管,加入預(yù)冷的異丙醇200 μL,混勻,-20 ℃放置20 min,取出離心管,12 000 r/min,離心10 min;⑤棄上清,加入150 μL預(yù)冷乙醇,上下顛倒,洗凈異丙醇,12 000 r/min,離心 5 min;⑥棄上清,室溫下晾干2 h;⑦加蒸餾水100 μL溶解DNA,備用。

1.2.2 二步CTAB法[14]①取大白菜真葉0.2~0.3 g(1 cm×1 cm)葉片加入1.5 mL離心管中,加50 μL 2%的CTAB提取緩沖液,研磨,補(bǔ)至400 μL,65 ℃水浴40 min,每10 min拿出輕搖一次;②加入400 μL氯仿∶異戊醇(24∶1),輕搖5 min;③12 000 r/min,離心5 min;④取上清200 μL至新的離心管,備用。

1.2.3 堿裂解法Ⅰ ①取大白菜真葉0.2~0.3 g(1 cm×1 cm)葉片加入1.5 mL離心管中;②加100 μL 0.4 mol/L NaOH,研磨;③沸水浴1 min后,10 000 r/min,離心1 min;④取上清液10 μL至新的1.5 mL離心管,再加300 μL 0.1 mol/L Tris-HCl(pH值 8.0),混勻備用。

1.2.4 堿裂解法Ⅱ 共4步,其中步驟③,離心管10 000 r/min,離心1 min,其他3步同堿裂解法Ⅰ。

1.2.5 堿裂解法Ⅲ 共4步,其中步驟③中,不進(jìn)行沸水浴和離心過(guò)程,其他3步同堿裂解法Ⅰ。

1.2.6 堿裂解法Ⅳ ①取大白菜真葉0.2~0.3 g(1 cm×1 cm)葉片加入1.5 mL離心管中;②加入200 μL 0.4 mol/L NaOH,研磨;③沸水浴1 min,直接作為PCR的模板,備用。以上每種方法重復(fù)3次。

1.3 提取的基因組DNA質(zhì)量的檢測(cè)

1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的提取質(zhì)量(電泳緩沖液為1×TAE),GelRed染色,在凝膠成像儀上成像、觀察。

1.4 PCR反應(yīng)

取不同方法獲得的DNA樣本2 μL進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.4.1 引物 分別為Bra019317、Bra019348、Bra019235-2和Bra019345-2。SSR標(biāo)記為本項(xiàng)目開(kāi)發(fā)的與本抗源抗根腫病基因連鎖的分子標(biāo)記,引物由華大基因公司合成。

1.4.2 PCR反應(yīng)體系 20 μL,包括模板DNA 2 μL,F(xiàn)orward primer(10 μmol/L)1 μL,Reverse primer(10 μmol/L)1 μL,dNTPs(2.5 mmol/L each)2 μL,10×Buffer 2 μL,Taq酶(2.5 U/μL)0.2 μL,ddH2O補(bǔ)足20 μL。

1.4.3 PCR 反應(yīng)程序 94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,35 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。

1.5 PCR產(chǎn)物檢測(cè)分析

2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的質(zhì)量(電泳緩沖液為1×TAE),GelRed染色,在凝膠成像儀上成像、觀察。8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)條帶多態(tài)性。

1.6 不同提取方法DNA保存時(shí)間和保存條件的比較

將提取到的DNA分別保存于4 ℃和-20 ℃下,并分別于第1,10,30,45,60天對(duì)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,利用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)條帶的清晰度,判斷每種方法提取到DNA的保存時(shí)間和最佳的保存條件。

1.7 堿裂解法在抗根腫病基因分子標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用

選擇最優(yōu)的堿裂解法快速提取G57、G70、F1及BC1群體的DNA,用與抗根腫病基因連鎖的標(biāo)記Bra019345-2,對(duì)含抗病基因的單株進(jìn)行篩選,以檢驗(yàn)該方法在分子標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取基因組DNA質(zhì)量的檢測(cè)

將CTAB法、二步CTAB法和4種堿裂解法提取的基因組DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。由圖1可知,只有CTAB法提取的DNA顯示出特異性的電泳條帶,其他5種方法未見(jiàn)到特異性的電泳條帶,說(shuō)明CTAB法提取基因組DNA的濃度高、質(zhì)量好,其他方法提取的DNA可能濃度偏低。

M.DNA MarkerⅠ;①~⑥.提取DNA的CTAB法、二步CTAB法、堿裂解法Ⅰ、堿裂解法Ⅱ、堿裂解法Ⅲ、堿裂解法Ⅳ。圖2-4同。M.DNA MarkerⅠ;①-⑥.DNA from CTAB method,two-step CTAB method,alkaline lysis methodⅠ,alkaline lysis methodⅡ,alkaline lysis method Ⅲ,alkaline lysis method Ⅳ.The same as Fig.2-4.

2.2 不同方法提取的DNA為模板的PCR擴(kuò)增效果的比較分析

分別以這6種方法提取的基因組DNA為模板,使用引物Bra019317和Bra019348進(jìn)行PCR擴(kuò)增,2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

結(jié)果表明,二步CTAB法和堿裂解法Ⅳ提取的DNA為模板擴(kuò)增不出特異性條帶,而CTAB法和堿裂解法Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ可以擴(kuò)增出特異性條帶,且條帶清晰、明亮。說(shuō)明CTAB法和堿裂解法Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ提取的基因組DNA能夠滿(mǎn)足PCR反應(yīng)的需要(圖2)。

A.引物Bra019317;B.引物Bra019348。A.The primer Bra019317;B.The primer Bra019348.

為了進(jìn)一步驗(yàn)證幾種方法的準(zhǔn)確性,利用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。由圖3可知,8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果一致,CTAB法和堿裂解法Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ都可以看到清晰的條帶,完全能夠滿(mǎn)足PCR擴(kuò)增的需要(圖3)。

圖3 8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.3 The test results of 8% non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis

2.3 DNA保存時(shí)間和保存條件的比較

為了判斷幾種方法提取DNA的保存時(shí)間,以及保存溫度對(duì)DNA保存時(shí)間的影響,第1 天時(shí),把試驗(yàn)中6種方法提取到的DNA先用引物Bra019235-2進(jìn)行PCR,然后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。再把6種方法提取到的DNA分別置于4 ℃和-20 ℃的條件下保存,分別于第10,30,45,60天對(duì)DNA用引物進(jìn)行PCR,對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè),觀察記錄條帶情況。結(jié)果如圖4所示。

對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析可知,堿裂解法Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ提取到的DNA在30 d檢測(cè)時(shí),4 ℃和-20 ℃條件下保存的效果都比較好,30~45 d堿裂解法Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ提取到的DNA在4 ℃條件下開(kāi)始有明顯的降解,-20 ℃條件下的保存效果比4 ℃較好,但是DNA也略有降解,第60天檢測(cè)時(shí),2種保存條件下,堿裂解法Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ提取到的DNA進(jìn)行PCR,再進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè),已經(jīng)檢測(cè)不到條帶。對(duì)CTAB法、堿裂解法Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ提取DNA的保存時(shí)間進(jìn)行比較,CTAB法提取的DNA保存時(shí)間最長(zhǎng),堿裂解法Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ提取的DNA在30 d內(nèi)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物,可以通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)到清晰的特異性條帶,并可滿(mǎn)足進(jìn)一步試驗(yàn)的需要。

2.4 堿裂解法在抗根腫病基因分子標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用

通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),堿裂解法Ⅲ不僅效率高,提取的DNA也能滿(mǎn)足試驗(yàn)的需要。結(jié)合堿裂解法Ⅲ進(jìn)行F1群體和BC1群體的基因型鑒定,鑒定F1群體的雜交率及分子標(biāo)記輔助選擇BC1群體中含抗病基因的單株。堿裂解法Ⅲ提取抗、感大白菜親本、74株F1群體和74株BC1群體植株的基因組DNA,用與抗根腫病基因連鎖的標(biāo)記Bra019345-2進(jìn)行PCR,聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè),所有的F1群體和BC1群體植株都檢測(cè)到了清晰的條帶(圖5,6)。74株F1群體植株均表現(xiàn)為雜合條帶;74株BC1群體植株中有33株表現(xiàn)為感病條帶,41株表現(xiàn)為雜合抗病條帶。說(shuō)明堿裂解法Ⅲ完全能夠滿(mǎn)足大群體純度鑒定及分子標(biāo)記輔助選擇中對(duì)基因組DNA質(zhì)量的要求。

圖6 BC1群體的8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果(1~74)Fig.6 The test results of BC1 population of 8% non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis(1-74)

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),以CTAB法和堿裂解法Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ制備的基因組DNA作為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,都可以被檢測(cè)到清晰的條帶,而二步CTAB法和堿裂解法Ⅳ制備的基因組DNA作為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)不到條帶。CTAB法的提取時(shí)間較長(zhǎng),提取成本也較高[15]。相比較而言,能檢測(cè)到條帶的3種堿裂解法耗時(shí)短,操作簡(jiǎn)單,方便快速,實(shí)用性強(qiáng),結(jié)合組織研磨儀可以高通量操作[16],而且成本低,只用到NaOH和Tris-HCl 2種常規(guī)試劑,試驗(yàn)方法大大的簡(jiǎn)化。尤其是堿裂解法Ⅲ,不需要沸水浴和離心,操作更為簡(jiǎn)便,效率最高,檢測(cè)結(jié)果也好[17],是值得推薦的方法。

相比較堿裂解法Ⅳ,加了Tris-HCl的堿裂解法Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ制備的DNA作為模板,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可以檢測(cè)到清晰的條帶,說(shuō)明使用堿裂解法提取大白菜基因組DNA時(shí),Tris-HCl是必需的[18]。二步CTAB法成本低,耗時(shí)短,有文獻(xiàn)報(bào)道這種方法提取的玉米基因組DNA通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),DNA的完整性較好[14],但是在本試驗(yàn)中提取的大白菜基因組DNA通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),沒(méi)有檢測(cè)到特異性條帶,這可能和試驗(yàn)材料的不同有關(guān)。堿裂解法Ⅲ提取的基因組DNA在保存至30 d時(shí),將基因組DNA作為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物還能通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)到清晰的條帶,說(shuō)明這種方法保存時(shí)間較長(zhǎng),可以應(yīng)用于大規(guī)模樣本的分子標(biāo)記篩選。

分子標(biāo)記輔助選擇育種,試驗(yàn)的對(duì)象都是一個(gè)大的群體[19-21]。傳統(tǒng)的CTAB法提取基因組DNA的步驟繁瑣,本試驗(yàn)尋找到的堿裂解法Ⅲ操作過(guò)程簡(jiǎn)單,耗時(shí)短,且保存時(shí)間較長(zhǎng),可以滿(mǎn)足大白菜大批量快速檢測(cè)的需要。

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