周 鳳,陳心雨,費(fèi)穎穎,韓 京

(江蘇師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院,徐州 221116)

糖尿病，尤其是2型糖尿病是繼腫瘤、心血管疾病之后的第三大嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的慢性非傳染性疾病[1-3]。目前,全球約有2億糖尿病患者,預(yù)計(jì)到2030年將增加至3.6億,其中2型糖尿病約占糖尿病患者總?cè)藬?shù)的90%以上[4]。現(xiàn)有的一些口服降糖藥物是目前治療糖尿病的主要藥物。但口服降糖藥物最大的不足是無(wú)法逆轉(zhuǎn)糖尿病的病因,即“治標(biāo)不治本”,對(duì)于胰島β-細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和增殖無(wú)明顯作用[5-7]。

胰高血糖素樣肽-1(Glucagon-like peptide-1,GLP-1)是葡萄糖依賴(lài)性地促胰島素分泌腸降血糖多肽激素,能安全降血糖,還可以保護(hù)、修復(fù)、分化、增殖胰腺β-細(xì)胞,同時(shí)還具有抑制食欲和胃酸分泌、延遲胃排空等生理作用。雖然GLP-1降血糖的優(yōu)點(diǎn)突出,但是天然GLP-1半衰期過(guò)短的缺陷使其無(wú)法在臨床應(yīng)用。GLP-1在體內(nèi)會(huì)被二肽基肽酶IV(DPPIV)快速水解。GLP-1在體內(nèi)還會(huì)被中性?xún)?nèi)切酶(NEP 24.11)識(shí)別并降解及被腎臟快速清除,其半衰期僅為2 min左右[8-10]。

目前GLP-1受體激動(dòng)劑類(lèi)藥物的研究都是基于天然GLP-1和Exendin-4進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾,這限制了新型GLP-1受體激動(dòng)劑的研發(fā)[11]。本文以前期研究發(fā)現(xiàn)的非洲爪蟾GLP-1(XenGLP-1)作為先導(dǎo)多肽[12],先在XenGLP-1的C端引入促螺旋序列PSSGAPPPS以增加X(jué)enGLP-1的降糖活性。同時(shí),為了定點(diǎn)、定量地實(shí)現(xiàn)XenGLP-1的PEG化,對(duì)其進(jìn)行半胱氨酸定點(diǎn)替換,從而在肽鏈上引入巰基,設(shè)計(jì)了ZF-1和ZF-2 2條多肽。進(jìn)一步利用MAL-PEG2 000通過(guò)半胱氨酸的巰基與設(shè)計(jì)了ZF-1和ZF-2 2條多肽相綴合,得到PEG化的PEG2 000-ZF-1和PEG2 000-ZF-2 2個(gè)綴合肽,并對(duì)綴合肽進(jìn)行長(zhǎng)效降糖活性研究。

1 儀器與材料

1.1儀器 SI Model 200型多肽合成儀(美國(guó)多肽科技有限公司)；Agilent 1260高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；漢邦制備液相色譜儀(江蘇漢邦科技有限公司)；ThermoHypersil Gold C18制備柱(250 mm×20 mm,12 μm)；真空冷凍干燥機(jī)(Labconco公司)；Ultimate 3000 analytical 液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo公司)；ME104E型萬(wàn)分之一天平(美國(guó)Mettler-Toledo公司)；BT25S型十萬(wàn)分之一天平(德國(guó)Sartorius集團(tuán))；血糖儀與試紙(中國(guó)三諾生物傳感股份有限公司)。

1.2試藥 xendin-4(吉爾生化公司,批號(hào) P141017-LR052143)；MAL-PEG2 000(西安瑞禧生物科技有限公司,批號(hào)RM2016011)；Rink Amide MBHA 樹(shù)脂、Fmoc保護(hù)氨基酸、1-羥基-苯并三氮唑(HOBt)、N,N-二異丙基碳二亞胺(DIC)、苯甲硫醚(thioanisole)和二巰基乙烷(EDT),均購(gòu)自上海吉爾生化有限公司(批號(hào)GLS160405-36607)；哌啶、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、三氟乙酸(TFA)為重蒸試劑,苯酚(批號(hào)20150604)、茚三酮(批號(hào)20150520)等其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。茚三酮檢測(cè)試劑：A.體積分?jǐn)?shù)為5%的茚三酮-無(wú)水乙醇溶液；B.體積分?jǐn)?shù)為80%的苯酚-無(wú)水乙醇溶液。

1.3動(dòng)物 清潔級(jí)ICR小鼠：7周齡,體質(zhì)量為18～22 g,雄性[上海杰斯捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(滬)2013-0006]；清潔級(jí)db/db小鼠：7周齡,雄性[南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所,動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(蘇)2015-0001]。

2 方法和結(jié)果

2.1ZF-1和ZF-2多肽的合成 稱(chēng)取 Rink Amide MBHA 樹(shù)脂(擔(dān)載量0.382 mmol·g-1)0.262 g(0.1 mmol),用二氯甲烷和甲醇(7 mL)交替清洗樹(shù)脂1次,用7 mL二氯甲烷清洗樹(shù)脂2次,加入10 mL二氯甲烷溶脹樹(shù)脂1 h。將溶脹后的樹(shù)脂移入多肽合成儀,以體積分?jǐn)?shù)為20%的哌啶/DMF作為脫保護(hù)試劑,脫除Rink樹(shù)脂的Fmoc保護(hù)基。茚三酮檢測(cè)脫保護(hù)完全后,按照設(shè)計(jì)的類(lèi)似物ZF-1和ZF-2的氨基酸序列,從C 端到N 端依次耦合,縮合試劑為DIC/HOBt(0.4 mmol/0.44 mmol)的DMF溶液,反應(yīng)時(shí)間為2 h,采用茚三酮試劑檢測(cè)縮合和Fmoc脫保護(hù)的完全程度。多肽合成完畢后,用7 mL甲醇清洗樹(shù)脂3次,用氮?dú)獯蹈蓸?shù)脂。使用切割劑Reagent R(TFA/苯甲硫醚/苯酚/EDT,90∶5∶3∶2)5 mL切割樹(shù)脂,室溫磁力攪拌切割2 h,過(guò)濾除去樹(shù)脂,切割液經(jīng)冰乙醚沉淀,洗滌后得粗肽。

表1F-1和ZF-2序列

Tab.1 ZF-1 and ZF-2 sequences

化合物長(zhǎng)度序列ZF-139肽HGEGTYTNDVTEYLCEKAAKEFIEWLIKGKPSSGAPPPSZF-239肽HGEGTYTNDVTEYLEEKAAKEFIEWLIKGCPSSGAPPPS

2.2ZF-1和ZF-2多肽的分析和純化

2.2.1分析方法 將目標(biāo)多肽粗品溶于少量的水中,制成質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的溶液,用0.25 μm微孔濾膜過(guò)濾,Agilent 1260高效液相色譜儀分析純度。色譜柱：Thermo Hypersil Gold C18反相分析柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)。流動(dòng)相A：體積分?jǐn)?shù)0.1% TFA/水,流動(dòng)相B：甲醇,梯度洗脫(0～10 min,B 50%～90%;10～15 min,B 90%～90%)。檢測(cè)波長(zhǎng)：214 nm；流速：1 mL·min-1；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2.2制備液相純化 制備純化條件：色譜柱：Thermo Hypersil Gold C18反相制備柱(250 mm×20 mm,12 μm)；流速：10 mL·min-1；樣品質(zhì)量濃度：20 mg·mL-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：214 nm。流動(dòng)相A：體積分?jǐn)?shù)0.1% TFA/水,流動(dòng)相B：甲醇,梯度洗脫(0～20 min,B 55%～90%;20～45 min,B 90%～90%)。收集主峰,合并質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于95%的樣品,30 ℃減壓蒸餾除去甲醇,真空冷凍干燥后稱(chēng)質(zhì)量,將冷凍干燥后的純品貯存在-20 ℃冰箱中。

2.3質(zhì)譜鑒定 Timate 3000 analytical 液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀；使用體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇/水溶解后進(jìn)樣,錐孔電壓：50 V,毛細(xì)管電壓：3 910 V,N2流速：648 L·h-1,錐孔溫度：120 ℃,霧化室溫度：330 ℃。ZF-1和ZF-2純化后,通過(guò)質(zhì)譜鑒定其相對(duì)分子質(zhì)量,結(jié)果見(jiàn)圖1和表2。

表2ZF-1和ZF-2的質(zhì)譜分析

Tab.2 Mass spectrometric analysis of ZF-1 and ZF-2

化合物相對(duì)分子質(zhì)量多電荷相對(duì)分子質(zhì)量計(jì)算值實(shí)測(cè)值ZF-14251.81418.2[M+3H]3+1418.7[M+3H]3+1064.0[M+4H]4+1064.3[M+4H]4+ZF-24252.71418.6[M+3H]3+1418.9[M+3H]3+1064.2[M+4H]4+1064.4[M+4H]4+

圖1ZF-1和ZF-2的質(zhì)譜圖

Fig.1 Mass spectrogram of ZF-1 and ZF-2

2.4PEG2 000-ZF-1和PEG2 000-ZF-2綴合肽的合成 利用巰基和馬來(lái)酰亞胺可以快速、定點(diǎn)、定量的反應(yīng)特征,在中性條件下,將ZF-1和ZF-2與MAL-PEG2 000綴合,得到PEG化的ZF-1和ZF-2綴合肽[13]。反應(yīng)條件：將ZF-1和ZF-2與MAL-PEG2 000在pH值為7的條件下,以體積分?jǐn)?shù)為50%的水/甲醇做溶劑,在DIEA的催化下反應(yīng)0.5 h。使用安捷倫 HPLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程,反應(yīng)完全后,利用制備液相分離純化得到目標(biāo)綴合肽,合成路線(xiàn)見(jiàn)圖2,PEG2 000-ZF-1和PEG2 000-ZF-2綴合肽的結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖3。

2.5EG2 000-ZF-1和PEG2 000-ZF-2綴合肽的結(jié)構(gòu)鑒定 ltimate 3 000 analytical 液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀；使用體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇/水溶解后進(jìn)樣,錐孔電壓：70 V,毛細(xì)管電壓：3 910 V,N2流速：648 L·h-1,錐孔溫度：120 ℃,霧化室溫度：330 ℃。通過(guò)質(zhì)譜鑒定其相對(duì)分子質(zhì)量,由于本研究中選擇的MAL-PEG2 000是平均相對(duì)分子質(zhì)量為2 000的聚合物,PEG修飾后的化合物無(wú)法計(jì)算單個(gè)分子的相對(duì)分子質(zhì)量,以質(zhì)譜只能測(cè)定一組相差特定質(zhì)荷比的呈正態(tài)分布的多電荷離子峰。圖3～4顯示的是一系列呈正態(tài)分布的多電荷離子峰,PEG2 000-ZF-1和PEG2 000-ZF-2的相對(duì)分子質(zhì)量理論值為4 477.9±44n及4 478.8±44n(n代表在單個(gè)分子中“CH2CH2O”骨架的數(shù)量),通過(guò)計(jì)算其理論分子離子峰值,結(jié)果顯示與實(shí)測(cè)值一致。測(cè)定結(jié)果顯示，最終PEG2 000-ZF-1和PEG2 000-ZF-2的相對(duì)分子質(zhì)量平均值為6 325.9和6 326.8(n=42)。PEG2 000-ZF-1和PEG2 000-ZF-2綴合肽的質(zhì)譜數(shù)據(jù)見(jiàn)圖4和表3～4。

圖2PEG2 000-ZF-1和PEG2 000-ZF-2綴合肽的合成路線(xiàn)

Fig.2 The synthetic routes of the conjugated peptides of PEG2 000-ZF-1 and PEG2 000-ZF-2

圖3PEG2 000-ZF-1和PEG2 000-ZF-2綴合肽的結(jié)構(gòu)

Fig.3 The structures of the conjugated peptides of PEG2 000-ZF-1 and PEG2 000-ZF-2

圖4PEG2 000-ZF-1andPEG2 000-ZF-2的質(zhì)譜圖

Fig.4 The mass spectrogram of PEG2 000-ZF-1 and PEG2 000-ZF-2

表3PEG2 000-ZF-1的質(zhì)譜分析結(jié)果

Tab.3 The results of mass spectrometric analysis of PEG2 000-ZF-1

na(m/z)計(jì)算值(m/z)實(shí)測(cè)值40[m+5H]5+1248.6[M+4H+Na]5+1253.0[m+5H]5+1248.8[M+4H+Na]5+1253.441[m+5H]5+1257.4[M+4H+Na]5+1261.8[m+5H]5+1256.9[M+4H+Na]5+1262.142[m+5H]5+1266.2[M+4H+Na]5+1270.6[m+5H]5+1266.3[M+4H+Na]5+1270.843[m+5H]5+1275.0[M+4H+Na]5+1279.4[m+5H]5+1274.8[M+4H+Na]5+1279.744[m+5H]5+1283.8[M+4H+Na]5+1288.2[m+5H]5+1283.5[M+4H+Na]5+1288.5

表4EG2 000-ZF-2的質(zhì)譜分析結(jié)果

Tab.4 The results of mass spectrometric analysis of PEG2 000-ZF-2

na(m/z)計(jì)算值(m/z)實(shí)測(cè)值40[m+5H]5+1248.8[M+4H+Na]5+1253.2[m+5H]5+1249.2[M+4H+Na]5+1253.541[m+5H]5+1257.6[M+4H+Na]5+1262.0[m+5H]5+1257.8[M+4H+Na]5+1262.342[m+5H]5+1266.4[M+4H+Na]5+1270.8[m+5H]5+1266.7[M+4H+Na]5+1271.343[m+5H]5+1275.2[M+4H+Na]5+1279.6[m+5H]5+1275.8[M+4H+Na]5+1279.944[m+5H]5+1284.0[M+4H+Na]5+1288.4[m+5H]5+1284.3[M+4H+Na]5+1289.2

2.6生物活性的測(cè)定

2.6.1PEG2 000-ZF-1、PEG2 000-ZF-2綴合肽的短效降糖活性測(cè)試 小鼠腹腔糖耐量實(shí)驗(yàn)是通過(guò)給予小鼠葡萄糖和受試化合物,依據(jù)空白組對(duì)照,測(cè)定不同時(shí)間的血糖水平,可以準(zhǔn)確評(píng)估化合物的短效降血糖活性[14-15]。使用ICR小鼠來(lái)評(píng)價(jià)綴合肽的降糖活性,實(shí)驗(yàn)方法：雄性ICR小鼠(體質(zhì)量18～22 g),適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,實(shí)驗(yàn)前隨機(jī)分組,每組6只。自由飲水,禁食過(guò)夜(12 h)。在腹腔給予葡萄糖前10 min每組ICR小鼠分別腹腔注射生理鹽水(空白對(duì)照)、陽(yáng)性對(duì)照GLP-1(25 nmol·kg-1)、受試化合物PEG2 000-ZF-1、PEG2 000-ZF-2(25 nmol·kg-1)；0 min腹腔注射葡萄糖(2 g·kg-1),于0,15,30,60和120 min在小鼠尾部斷尾取血，用血糖儀測(cè)定血糖值。見(jiàn)圖5。

由圖5可知,PEG2 000-ZF-1和PEG2 000-ZF-2綴合肽均有顯著的降糖活性,在15和30 min時(shí)的血糖數(shù)值與陽(yáng)性對(duì)照GLP-1相當(dāng),說(shuō)明PEG化綴合肽并沒(méi)有PEG的降糖活性。

圖5PEG2 000-ZF-1和PEG2 000-ZF-2的短效血糖時(shí)間曲線(xiàn)

Tab.5 Short-acting blood glucose and time curves of PEG2 000-ZF-1 and PEG2 000-ZF-2

2.6.2PEG2 000-ZF-1、PEG2 000-ZF-2綴合肽的長(zhǎng)效降糖活性測(cè)試 db/db小鼠是一種2型糖尿病穩(wěn)定可靠的動(dòng)物模型,其正常血糖值基本在15 mmol·L-1以上,而正常小鼠的血糖值低于10 mmol·L-1,基于db/db小鼠的高血糖特點(diǎn),設(shè)計(jì)db/db小鼠不禁食給藥降糖實(shí)驗(yàn)[16-18]。db/db小鼠在腹腔注射PEG2 000-ZF-1和PEG2 000-ZF-2綴合肽后,自由飲食飲水,對(duì)照組db/db小鼠的血糖值會(huì)維持在高位,而注射綴合肽小鼠的血糖值會(huì)先下降,后隨著藥效的降低血糖值會(huì)緩慢回升。因此,通過(guò)比較化合物降低血糖的曲線(xiàn)及曲線(xiàn)下面積,可以準(zhǔn)確評(píng)估化合物的長(zhǎng)效降糖活性[19-20]。

6周齡雄性db/db小鼠,隨機(jī)分組,每組6只,適應(yīng)性飼養(yǎng)(標(biāo)準(zhǔn)小鼠飼料,12 h光照,25 ℃)1周后,使用血糖儀測(cè)定各組小鼠的血糖數(shù)值,待各組小鼠血糖值高于15 mmol·L-1后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。陽(yáng)性對(duì)照組給予exendin-4(25 nmol·kg-1)、化合物組給予PEG2 000-ZF-1、PEG2 000-ZF-2(25 nmol·kg-1),陰性對(duì)照組給予生理鹽水。0 h給予各組化合物及生理鹽水,各組小鼠自由飲水、飲食,于0,1,2,3,4,6,8,10,12,16,20和24 h在小鼠尾部斷尾取血,用血糖儀測(cè)定血糖,作血糖曲線(xiàn),并計(jì)算曲線(xiàn)下面積。見(jiàn)圖6～7。

由圖6～7可知,PEG2 000-ZF-1和PEG2 000-ZF-2綴合肽在25 nmol·kg-1的劑量下,穩(wěn)定血糖作用都優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照exendin-4。它們的血糖曲線(xiàn)下面積也顯著小于exendin-4,這說(shuō)明PEG2 000-ZF-1和PEG2 000-ZF-2綴合肽不僅具有優(yōu)異的降糖活性,其長(zhǎng)效降糖作用也非常顯著,具有潛在的藥物開(kāi)發(fā)前景。

圖6PEG2 000-ZF-1和PEG2 000-ZF-2的長(zhǎng)效血糖時(shí)間曲線(xiàn)

Tab.6 Long-acting blood glucose and time curves of PEG2 000-ZF-1 and PEG2 000-ZF-2

圖7PEG2 000-ZF-1、PEG2 000-ZF-2的血糖曲線(xiàn)下面積

Tab.7 The area under the blood glucose curves of PEG2 000-ZF-1 and PEG2 000-ZF-2

3 小結(jié)

隨著生活水平的提高,糖尿病患者逐年遞增,因此,對(duì)于糖尿病治療藥物的研究具有重大意義。本研究將與人GLP-1具有相似生物活性的XenGLP-1作為先導(dǎo)多肽,先在XenGLP-1的C端引入增加活性的片段及Cys定點(diǎn)替換,再進(jìn)行PEG長(zhǎng)效化修飾,這既實(shí)現(xiàn)了PEG與XenGLP-1多肽定點(diǎn)、定量的綴合,又減輕了PEG化所導(dǎo)致的XenGLP-1多肽降糖活性的降低程度。

分別在ICR鼠和2型糖尿病db/db模型小鼠上評(píng)價(jià)了綴合肽的短效及長(zhǎng)效降糖活性?；钚詫?shí)驗(yàn)結(jié)果表明,PEG2 000-ZF-1、PEG2 000-ZF-2綴合肽不僅具有優(yōu)異的降糖活性,也具有良好的長(zhǎng)效降糖作用,值得進(jìn)行深入的活性研究,具有開(kāi)發(fā)成2型糖尿病治療藥物的前景。

[1] American Diabetes Association.Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus[J].Diabetes Care,2014,37 (Supple 1)：S81-S90.

[2] 周琦,劉一輝.糖尿病研究及其防治[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生,2013,29(4)：560-562.

[3] 姚立群,張敏,林朝芹,等.糖尿病連續(xù)性護(hù)理的研究進(jìn)展[J].中華護(hù)理雜志,2012,47(6)：568-570.

[4] 張玉省,黃麗琴,王芳,等.口服二甲雙胍血糖控制不佳的2型糖尿病患者聯(lián)合沙格列汀治療的效果與安全性研究[J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2017,38(4)：458-461.

[5] 張玉領(lǐng),孫長(zhǎng)顥.Ⅱ型糖尿病動(dòng)物模型的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2012,39(8)：2015-2017.

[6] E N Murage,G Gao,A Bisello,et al.Development of potent glucagon-like peptide-1 agonists with high enzyme stability via introduction of multiple lactam bridges[J].J Med Chem,2010,53(17)：6412-6420.

[7] B Manandhar,J M Ahn.Glucagon-like peptide-1 (GLP-1) analogs:recent advances,new possibilities,and therapeutic implications[J].J Med Chem,2015,58(3)：1020-1037.

[8] J Han,X Huang,L Sun,et al.Novel fatty chain-modified glucagon-like peptide-1 conjugates with enhanced stability and prolongedinvivoactivity[J].Biochem Pharmacol,2013,86(2)： 297-308.

[9] L P Miranda,K A Winters,C V Gegg,et al.Design and synthesis of conformationally constrained glucagon-like peptide-1 derivatives with increased plasma stability and prolongedinvivoactivity[J].J Med Chem,2008,51(9)：2758-2765.

[10]蓋克克,段蓉,李正翔.胰高血糖素樣肽-1受體激動(dòng)劑和二肽基肽酶-4抑制劑聯(lián)用二甲雙胍治療2型糖尿病的療效與安全性對(duì)比的系統(tǒng)評(píng)價(jià)[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志,2017,37(7)：633-638.

[11]Meier J J.GLP-1 receptor agonists for individualized treatment of type 2 diabetes mellitus[J].Nat Rev Endocrinol,2012,8 (12)：728-742.

[12]J Han,Y Wang,Q Meng,et al.Design,synthesis and biological evaluation of PEGylated Xenopus glucagon-like peptide-1 derivatives as long-acting hypoglycemic agents[J].Eur J Med Chem,2017,132：81-89.

[13]Y Chi,H Zhang,W Huang,et al.Microwave-assisted solid phase synthesis,PEGylation,and biological activity studies of glucagon-like peptide-1(7-36) amide[J].Bioorg Med Chem,2008,16(16)： 7607-7614.

[14]J Han,L Sun,Y Chu,et al.Design,Synthesis,and Biological activity of novel dicoumarol glucagon-like peptide 1 conjugates[J].J Med Chem,2013,56(24)：9955-9968.

[15]J Han,L Sun,X Huang,et al.Novel coumarin modified GLP-1 derivatives with enhanced plasma stability and prolongedinvivoglucose-lowering ability[J].Br J Pharm,2014,171(23)：5252-5264.

[16]Solini A,Rossi C,Duranti E,et al.Saxagliptin prevents vascular remodeling and oxidative stress in db/db mice.Role of endothelial nitric oxide synthase uncoupling and cyclooxygenase[J].Vasc Pharm,2016,76：62-71.

[17]X Cui,Q Meng,Y Chu,et al.Glucagon-like peptide-1 loaded phospholipid micelles for the treatment of type 2 diabetes:improved pharmacokinetic behaviours and prolonged glucose-lowering effects[J].Rsc Adv,2016,6(97)：94408-94416.

[18]C Mapelli,S I Natarajan,J P Meyer,et al.Eleven amino acid glucagon-like peptide-1 receptor agonists with antidiabetic activity[J].J Med Chem,2009,52(23)：7788-7799.

[19]S Y Chae,Y G Chun,S Lee,et al.Pharmacokinetic and pharmacodynamic evaluation of site-specific PEGylated glucagon-like peptide-1 analogs as flexible postprandial-glucose controllers[J].J Pharm Sci,2009,98(4)：1556-1567.

[20]T H Kim,H H Jiang,S Lee,et al.Mono-PEGylated dimeric exendin-4 as high receptor binding and long-acting conjugates for type 2 anti-diabetes therapeutics[J].Bioconjug Chem,2011,22(4)：625-632.