王 虹 王 軍

(江蘇警官學(xué)院公安科技系，江蘇 南京 210031)

農(nóng)藥常被廣泛地應(yīng)用于抵抗病蟲災(zāi)害、清除雜草、提高產(chǎn)量。食用受到農(nóng)藥污染的蔬菜、水果而造成的急性中毒事件[1]、食品出口過程中因農(nóng)藥殘留超標(biāo)導(dǎo)致退貨的國際貿(mào)易事件[2]、與農(nóng)藥中毒有關(guān)的自殺案件、投毒案件、意外事故也時常出現(xiàn)[3，4]。對農(nóng)藥進(jìn)行分析檢測，其檢測結(jié)果對判斷中毒原因和案件的性質(zhì)至關(guān)重要。

農(nóng)藥檢測的常規(guī)方法有氣相色譜法[5]、液相色譜法[6]、色譜-質(zhì)譜法[7，8]、光譜分析[9，10]等。這些方法雖然具有高準(zhǔn)確度、高精確度，但需要較長的前處理時間，不能進(jìn)行現(xiàn)場快速檢測并獲得檢測結(jié)果。隨著生物技術(shù)和微電子技術(shù)的發(fā)展，生物傳感器在農(nóng)藥殘留檢測中則體現(xiàn)出實時快速、簡單便攜和低成本的分析優(yōu)勢，因此頗受關(guān)注[11，12]。本文介紹了酶生物傳感器的分類、酶的固定技術(shù)，比較了電化學(xué)型酶生物傳感器、光學(xué)型及壓電型酶生物傳感器的應(yīng)用領(lǐng)域、檢測限和優(yōu)缺點。

1酶生物傳感器

酶生物傳感器(Enzymatic Biosensor，EBS)是指將酶與特定的載體或電極結(jié)合并將酶促反應(yīng)的產(chǎn)物信息(如物質(zhì)濃度變化、光熱反應(yīng)等)經(jīng)過能量轉(zhuǎn)換器變?yōu)殡娦盘栞敵龅囊环N裝置[13]。 根據(jù)酶與物質(zhì)反應(yīng)機理不同，酶生物傳感器一般可以分為膽堿酯酶傳感器(CHE)和有機磷水解酶傳感器(OPH)[14]。

根據(jù)酶生物傳感器制作過程中的信號轉(zhuǎn)換器的不同，又可將其分為電化學(xué)型生物傳感器、光學(xué)型生物傳感器、壓電晶體生物傳感器等[15]，其中電化學(xué)型生物傳感器最為常見，按電極反應(yīng)方式不同分為電位型、電流型(安培型)、電位-電流型以及隨著微電子技術(shù)發(fā)展起來的離子選擇性場效應(yīng)晶體管型(ISFET)[16]。

電化學(xué)型EBS的能量轉(zhuǎn)換器即電化學(xué)電極，識別元件則為酶活性材料。由于反應(yīng)在電極周圍即完成，故它既有電化學(xué)電極響應(yīng)快、操作簡便的特點，又有酶的特異性識別和選擇性催化功能，因此在傳感領(lǐng)域發(fā)展最早，研究內(nèi)容最豐富，應(yīng)用范圍也最為廣泛。

光導(dǎo)纖維EBS由光導(dǎo)纖維、酶分子識別元件及檢測器構(gòu)成[17]。它是依據(jù)酶選擇性識別待檢測物質(zhì)，催化反應(yīng)，并伴隨可檢測的磷光、熒光、拉曼光、化學(xué)發(fā)光和生物發(fā)光等光變化，通過檢測器檢測到待檢測物質(zhì)濃度[18]。

石英晶體微天平(QCM)依據(jù)壓電石英晶體諧振測量技術(shù)，早期主要用于檢測氣體有機物和無機物[19]，后來發(fā)展到壓電石英晶體EBS。Abad等[20]將固定有乙酰膽堿酯酶(AChE)的晶體電極浸沒在3-吲哚乙酸組織培養(yǎng)基中，來測量對氧磷和西維因，檢測限分別可達(dá)5.0×10-8和1.0×10-7mol/L。

2檢測食品中農(nóng)殘常用的酶生物傳感器

圖1所示為傳感器基本構(gòu)成，其核心部件是分子識別元件和能量轉(zhuǎn)換器。在酶生物傳感器中識別元件即為固定化的酶，可以識別待測物質(zhì)催化反應(yīng)，引起的物質(zhì)的量的變化或光熱的變化即經(jīng)信號轉(zhuǎn)換后用于檢測。因此酶的固定技術(shù)可以說是酶生物傳感器制作中最重要的一項技術(shù)。

圖1 生物傳感器構(gòu)成示意圖Fig 1 sketch drawing of biosensor

2.1 酶固定技術(shù)

酶的固定技術(shù)是將酶和載體或者電極結(jié)合，使酶能夠集中在一定空間范圍內(nèi)與待測物質(zhì)進(jìn)行催化反應(yīng)的方式。酶的固定方法會影響酶的穩(wěn)定性、反應(yīng)靈敏性和使用壽命等。一般酶固定方法有吸附法、交聯(lián)法、共價鍵結(jié)合法、包埋法等[21]。

吸附法較為簡單，有物理吸附和化學(xué)吸附兩種。優(yōu)點在于操作簡單，且酶活力損失較小，但是這種固定方法酶易脫落，不夠穩(wěn)定。在絲網(wǎng)印刷電極表面乙酰膽堿酯酶(AChE) 的固定中會用到這種方法[22]。

交聯(lián)法是由酶分子間或分子內(nèi)通過交聯(lián)劑作用發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，而形成不溶于水的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，這樣的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)輕薄且易吸附，會附著在一些固體的表面從而使酶得到固定[23]。這種酶固定方法穩(wěn)定性好，響應(yīng)快，但酶活性中心易失活所以重復(fù)性較差。

共價鍵結(jié)合法是酶的側(cè)鏈基團(tuán)和電極表面發(fā)生反應(yīng)形成共價鍵而相互結(jié)合從而使酶得到固定的方法。參加共價結(jié)合反應(yīng)的不能是酶的活性中心，否則會使酶的活性大大降低。這種固定方法由于發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)故穩(wěn)定牢固，酶分子不易脫落，使用壽命長，但是化學(xué)修飾和激烈的反應(yīng)可能使酶活性降低，且操作復(fù)雜，成本較高。

包埋法是通過物理方法將酶分子包埋在高分子聚合物形成的三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)基質(zhì)中得以固定。與共價鍵結(jié)合法不同，這種方法一般不產(chǎn)生化學(xué)修飾，故很少改變酶的高級結(jié)構(gòu)，對酶活性影響較小。缺點是分子量大的底物在凝膠網(wǎng)格內(nèi)擴散較固難。光纖型EBS的制作中常用這種方法來固定酶，在電流型EBS制作中也常見到[23]。

酶的固定方法各有優(yōu)點和不足，應(yīng)該結(jié)合具體的酶生物傳感器類型、固定的基質(zhì)性質(zhì)及傳感器作用方式來確定選擇合適的固定方法來提高性能。在實際應(yīng)用中，有時會把兩種固定方法結(jié)合起來使用以優(yōu)勢互補獲得更好的性能。例如將吸附和交聯(lián)法結(jié)合，通過交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性來克服吸附法中酶易從載體漏失或脫落的問題，增強了酶的穩(wěn)定性[24]。

2.2 電化學(xué)型酶生物傳感器

電化學(xué)型酶生物傳感器是目前應(yīng)用最為廣泛的一種酶生物傳感器。隨著研究進(jìn)展它又分為多個不同的分支種類，表1列出了幾種類型電化學(xué)型酶生物傳感器的制作方式及檢測限。在制作方式、檢測限、重復(fù)性、反應(yīng)時間以及線性范圍方面均有不同。

傳統(tǒng)電位型EBS在檢測農(nóng)藥殘留方面發(fā)展最早，它制作簡單、靈敏度較高、響應(yīng)快、線性范圍寬、重復(fù)性較好，且易于實現(xiàn)自動化、基本無需對待測樣品做前處理。但相對而言傳統(tǒng)pH電極直接檢測的精密度不高、工作曲線也不是很穩(wěn)定、電極壽命短，因此逐漸被其他類型電化學(xué)型EBS所取代。

表1 常見電化學(xué)型酶生物傳感器比較Table 1 the compare of electrochemical enzyme biosensor

離子選擇性場效應(yīng)管(ISFET) EBS是隨著微電子技術(shù)的發(fā)展而產(chǎn)生的。其構(gòu)造簡單，穩(wěn)定性更高，且檢測靈敏度和使用壽命較傳統(tǒng)電極高。該種EBS本身也向微型化、集成化發(fā)展；同時ISFET適合批量制造，故其市場已較為成熟，具有廣闊的應(yīng)用潛力。

電流型EBS的種類最為繁多，早期的電流型EBS由于檢測電位較高，一些電化學(xué)活性物質(zhì)對其干擾較大，影響其靈敏度；加入一些介體修飾后雖然降低了檢測電位，并且提高了檢測限，但電極制作工藝復(fù)雜，重復(fù)性差，難以推廣應(yīng)用。后來絲網(wǎng)印刷技術(shù)的發(fā)展和引入使電流型EBS研究有了新的突破，在選擇性、重復(fù)性、靈敏度方面均得到提高[16]。絲網(wǎng)印刷技術(shù)最大優(yōu)勢是實現(xiàn)了酶電極探頭批量生產(chǎn),且電極重現(xiàn)性好，降低了傳感器的成本，在實際推廣應(yīng)用中只需進(jìn)一步提高酶的穩(wěn)定性以及成本控制。從表中可以看出，電流型EBS的檢測限在幾種電化學(xué)型EBS中是最高的，可以達(dá)到10-8的數(shù)量級，在今后的發(fā)展中也很有潛力。

電位-電流型EBS作為兩者的結(jié)合，是一個新的研究方向。它結(jié)合了電位型EBS響應(yīng)時間短、重復(fù)性好、檢測范圍廣以及電流型EBS靈敏度高、檢測限低的優(yōu)勢，但是受傳感器制作成本高及核心芯片制作工藝復(fù)雜的限制，到實際應(yīng)用仍需研究改進(jìn)。

不同類型的酶生物傳感器的優(yōu)缺點不是一成不變的，與制作方式和應(yīng)用場合有極大關(guān)系，選擇不同的酶就會使傳感器效果不同。例如膽堿酯酶中，丁酰膽堿酯酶對農(nóng)藥的抑制性比乙酰膽堿酯酶更強，故用其代替乙酰膽堿酯酶所制作的傳感器更加的靈敏、檢測限也更高，有時甚至能提高一個數(shù)量級。有機磷水解酶則是通過水解底物來完成反應(yīng)的，其針對性、準(zhǔn)確性很高，它只需一步反應(yīng)，故其反應(yīng)速度比較快，響應(yīng)時間短，但一般由于底物量較少，對檢測精度要求就很高，制作起來也相對比較困難。綜上可見，酶生物傳感器的效果其實是各個因素的綜合結(jié)果。

2.3 光學(xué)型及壓電型酶生物傳感器

光學(xué)型EBS主要由光纖和生物敏感膜組成，隨著研究進(jìn)展不斷有最新技術(shù)引入，也存在著一些亟待解決的不足之處。

壓電型(石英晶體微天平(QCM))EBS以QCM為信號轉(zhuǎn)換器。QCM是根據(jù)壓電石英晶體諧振測量技術(shù)制成的，晶體吸附外來物后振動頻率的變化和附著層的質(zhì)量變化可以轉(zhuǎn)換為信號輸出，具有10-9g級的質(zhì)量檢測能力，它對表面質(zhì)量負(fù)載的高度靈敏特性使之成為傳感器制備中較好的信號轉(zhuǎn)換器。表2列出了幾種常見的光學(xué)型和壓電型酶生物傳感器的比較結(jié)果。

表2 常見光學(xué)型及壓電型酶生物傳感器比較Table 2 the compare of optical and piezoelectric enzyme biosensor

光纖EBS以光為檢測信號，靈敏度極高，可以達(dá)到10-9～10-10數(shù)量級，響應(yīng)時間短，抗電磁場干擾能力強，信息傳遞容量大，能量損耗低等，在常量至微量甚至超微量分析方面,具有其他傳感技術(shù)所不具有的優(yōu)勢。同樣由于光的特性，使得光纖EBS易受背景光的干擾，穩(wěn)定性較差，且制作時固定生物材料難度更大。然而無論如何，光纖EBS快速、可逆，能夠?qū)崿F(xiàn)在線實時檢測,這點在實際應(yīng)用中有重要意義。

壓電型(石英晶體微天平(QCM))EBS是一種新穎的生物傳感器，它檢測靈敏度很高，快速簡單，成本較低，且對樣品無需破壞處理，可以在線監(jiān)測。但是壓電型EBS對操作環(huán)境條件要求嚴(yán)格，濕度和溫度都可能影響其結(jié)果，故在實際應(yīng)用中有時難以達(dá)到預(yù)期效果，不利于推廣應(yīng)用。 但是光纖EBS和壓電型EBS的出現(xiàn)，給酶生物傳感器的發(fā)展提供了新的思路，從能量轉(zhuǎn)換的角度來開發(fā)更多種類的傳感器。

對比電化學(xué)型、光學(xué)型、壓電型這三大類酶生物傳感器，雖有各自發(fā)展之先后，但自身都存在一些優(yōu)點和不足之處。

電化學(xué)型EBS以酶作分子識別元件對底物有高度選擇性，具有較高的靈敏度，同時電極響應(yīng)時間短，檢測迅速?，F(xiàn)在隨著發(fā)展還出現(xiàn)了以動植物細(xì)胞和組織來代替純酶試劑，降低了生物傳感器的制作成本。電化學(xué)型EBS適用范圍廣，性能穩(wěn)定，其技術(shù)已經(jīng)相對完善且有實際應(yīng)用意義，有廣闊的發(fā)展前景。

光學(xué)型和壓電型EBS是新型的生物傳感器，它們都有極高的檢測靈敏度(這也是酶生物傳感器的特性之一)，并且都可以實現(xiàn)在線實時檢測。但是兩者的制作過程均略顯復(fù)雜，檢測范圍受到限制，壓電型EBS對操作環(huán)境要求嚴(yán)格，因此兩者離實際應(yīng)用推廣還有一段距離，但仍是生物傳感技術(shù)的重要分支，具有重要的研究意義。

3結(jié) 論

酶生物傳感器開辟了農(nóng)藥殘留檢測的新領(lǐng)域，在測定農(nóng)藥，特別是痕量微量的農(nóng)藥殘留，與其它需用儀器進(jìn)行分析的方法相比較，它更方便、快速且需對樣品所做的前處理較少。但酶生物傳感器尤其是一些電化學(xué)生物傳感器以及一些新型酶生物傳感器的研究多在實驗室條件下，被開發(fā)應(yīng)用到實際檢測中的種類很少。目前要生產(chǎn)用于農(nóng)藥殘留日常檢測的酶生物傳感器并在工業(yè)中實現(xiàn)推廣還要進(jìn)行大量的研究工作，其最大問題還是穩(wěn)定性、靈敏度、重復(fù)性和準(zhǔn)確性。當(dāng)前要有所突破克服現(xiàn)有的一些不足還需要研究新的酶固定化技術(shù)，做到提高酶活力的同時延長酶生物傳感器使用壽命；也可以通過研發(fā)新型信號轉(zhuǎn)換技術(shù)來研制新型酶生物傳感器。今后，酶生物傳感器將朝著經(jīng)濟化、小型化、功能多樣化、智能化和集成化方面發(fā)展。而想要把酶生物傳感器應(yīng)用到公安工作中來，不僅僅是要考慮到它快速檢測的優(yōu)勢，還要考慮到酶生物傳感器的選擇性比較高，但也正是這樣其毒物檢測范圍就會受到限制，通常只能針對某類毒物或者農(nóng)藥進(jìn)行檢測，但公安案件中的檢材通常是很復(fù)雜多樣的，這樣的檢測結(jié)果就會出現(xiàn)假陰性。不管是將多種酶一起固定在基質(zhì)上形成多酶膜還是一些其他的解決方法，酶生物傳感器在公安工作中的真正應(yīng)用還有很長一段路要走，還有很多實際的問題需要大家一起探索解決，不管如何，酶生物傳感器作為一種快速檢測方法還是十分有發(fā)展?jié)摿Φ摹?/p>

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