沈文通

(江蘇省阜寧縣危險化學(xué)品管理辦公室，江蘇 阜寧 224400)

殼聚糖(Chitosan, CTS)是由β(1,4)-2-氨基-2-脫氧-D-葡聚糖(GlcN)和β(1,4)-2-乙酰氨基-2-脫氧-D-葡聚糖(GlcNAc)構(gòu)成的線性天然高分子共聚物，主要通過甲殼素(Chitin)在濃堿存在下脫乙酰生成[1]。作為唯一的帶有氨基的天然堿性多糖，其pKa值一般為6.2～7.0，并且在水溶液中往往會表現(xiàn)出典型的弱陽離子高分子化合物特征[2]。殼聚糖不但具有優(yōu)良的生物降解性和生物相容性，而且還具有良好的吸附性和生物安全性。同時，殼聚糖的抗微生物活性、金屬離子螯合性能和游離基捕集性能也優(yōu)于甲殼素[3]。但是，殼聚糖分子結(jié)構(gòu)中的羥基和氨基在分子鏈上的排布的規(guī)整性及這種規(guī)整性導(dǎo)致的殼聚糖分子鏈間存在的強烈氫鍵作用，使殼聚糖在中性或堿性水溶液中的溶解性顯著下降，這也對殼聚糖在食品行業(yè)中的進一步應(yīng)用產(chǎn)生了不利影響[4]。為克服這一不足，并結(jié)合食品行業(yè)的特點和要求，人們提出了多種方法用于殼聚糖的改性，以制備具有良好水溶性的殼聚糖衍生物，其中通過殼聚糖降解制備水溶性的甲殼低聚糖(也稱殼寡糖，Chito-oligosaccharides)得到廣泛研究。

與殼聚糖相比，甲殼低聚糖不但有更低的分子量，而且分子結(jié)構(gòu)中羥基和氨基在分子鏈上排布的規(guī)整性和分子鏈間的氫鍵作用顯著降低，因而可在水溶液中表現(xiàn)出良好的溶解性[5]。同時，甲殼低聚糖在保持了殼聚糖具有的生物降解性、生物相容性和生物安全性外，還具有更好的抗氧、防腐、抗腫瘤等活性[6～10]。本文主要對通過過氧化氫直接氧化降解法制備甲殼低聚糖的方法及其影響因素進行研究，并對產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進行表征。

1實驗部分

1.1 主要原料與儀器

殼聚糖：生化試劑，脫乙酰度90.84%(電位滴定法測定)，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；30%過氧化氫：分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇：分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉：化學(xué)純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；鹽酸：分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司。

紅外光譜分析儀：Nicolet 670型，美國Nicolet 公司；核磁共振分析儀：DRX500型，BRUKER公司(瑞士)。

1.2 甲殼低聚糖的制備

將4.1 g CTS和120 mL蒸餾水加入到四口反應(yīng)瓶中并攪拌分散，再在室溫下由滴液漏斗向反應(yīng)瓶慢慢滴加一定體積質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為30%的H2O2水溶液，滴加過程中控制物料溫度不高于40 ℃；H2O2水溶液滴加完畢后，水浴加熱物料使其升至設(shè)定溫度，并恒溫反應(yīng)一定時間；反應(yīng)完成后，對反應(yīng)物料進行過濾，并將得到的濾液濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上于減壓條件下濃縮，直到物料呈粘稠的淺黃綠色液體。攪拌下將濃縮后的物料緩慢加入到50mL無水乙醇中，待析出的淺黃白色沉淀物聚集成團后，再將乙醇液分出。向析出的黏結(jié)成團的沉淀物中再加入30 mL無水乙醇，并研磨脫水(重復(fù)數(shù)次，直至黏結(jié)成團的沉淀物完全轉(zhuǎn)化為黃白色粒狀物)；抽濾并將得到的淡黃白色粒狀物料置于冷凍干燥器中干燥，即得到水溶性甲殼低聚糖。

1.3 產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)表征

用KBr壓片法對殼聚糖和甲殼低聚糖進行FT-IR分析，以D2O和TFA-D2O分別作溶劑對甲殼低聚糖和殼聚糖進行1H NMR分析。

1.4 產(chǎn)物的脫乙酰度測定

利用雙突躍電位滴定法測定產(chǎn)物的脫乙酰度，過程如下：準(zhǔn)確稱量一定量的干燥至恒重的甲殼低聚糖樣品，并用過量的HCl溶液溶解；用標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液滴定，并作出溶液pH隨NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的變化曲線；根據(jù)pH～VNaOH曲線，作出其一級微商關(guān)系曲線，并通過兩突變點對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液的體積差，按式(1)計算甲殼低聚糖的脫乙酰度α。

(1)

式中：△v為兩突變點間的消耗的標(biāo)準(zhǔn)NaOH 溶液體積差(mL)；CNaOH為標(biāo)準(zhǔn)NaOH 溶液的濃度(mol·L-1)；m為水溶性甲殼低聚糖樣品質(zhì)量(g)；16為氨基的相對摩爾質(zhì)量；0.0994為完全脫乙酰甲殼低聚糖中氨基的理論含量。

2結(jié)果和討論

2.1 H2O2水溶液用量對水溶性甲殼低聚糖收率的影響

在反應(yīng)溫度為60℃和保溫時間為7.0 h條件下，考察了質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為30%的H2O2水溶液對水溶性甲殼低聚糖收率的影響，其結(jié)果見表1。

表1 不同H2O2水溶液用量時水溶性甲殼低聚糖的收率Table 1 Effect of H2O2 dosage on the yieldof water-soluble chito-oligosaccharides

由表1可以看出，在一定范圍內(nèi)H2O2水溶液用量的增加有利于殼聚糖降解生成水溶性甲殼低聚糖，但用量過大也會由于其對氨基氧化能力的提高而導(dǎo)致產(chǎn)物被部分進一步氧化而轉(zhuǎn)化為其它非水溶性甲殼低聚糖等物質(zhì)。

2.2 反應(yīng)溫度對水溶性甲殼低聚糖收率的影響

在保溫時間為7.0 h和30% H2O2水溶液用量為12.0 mL條件下，考察了反應(yīng)溫度對水溶性甲殼低聚糖收率的影響，其結(jié)果見表2。

表2 不同反應(yīng)溫度下水溶性甲殼低聚糖的收率Table 2 Effect of reaction temperature on theyield of water-soluble chito-oligosaccharides

由表2可知，在40～70 ℃范圍內(nèi)，溫度的提高有利殼聚糖轉(zhuǎn)化為水溶性甲殼低聚糖；反應(yīng)溫度達80 ℃時，產(chǎn)物的收率會顯著下降。同時，實驗中還發(fā)現(xiàn)，40～60 ℃范圍內(nèi)得到的產(chǎn)物為淺白色或淺黃白色，70 ℃時的產(chǎn)物為黃色，而80 ℃時的產(chǎn)物為棕黃色，這說明過高的反應(yīng)溫度會導(dǎo)致氧化副反應(yīng)發(fā)生程度明顯提高。

2.3 保溫時間對水溶性甲殼低聚糖收率的影響

在反應(yīng)溫度為60℃和30% H2O2水溶液用量為12.0 mL條件下，考察了保溫時間對水溶性甲殼低聚糖收率的影響，其結(jié)果見表3。

表3 不同保溫時間時水溶性甲殼低聚糖的收率Table 3 Effect of reaction time on the yieldof water-soluble chito-oligosaccharides

由表3 可知，延長反應(yīng)時間總體上對提高水溶性甲殼低聚糖的收率是有利的，但以7.0～8 h 為宜；但是當(dāng)反應(yīng)時間超過7 h后，反應(yīng)時間的延長對提高水溶性甲殼低聚糖的收率已經(jīng)影響較小了。

2.4 水溶性甲殼低聚糖脫乙酰度測定結(jié)果

通過雙突躍電位滴定法測定產(chǎn)物脫乙酰度時得到的pH～VNaOH曲線見圖1，對應(yīng)的一級微商關(guān)系曲線見圖2。

圖1 pH～VNaOH關(guān)系曲線Fig 1 Relationship curve of pH versus VNaOH

圖2 一級微商關(guān)系曲線Fig 2 Relationship curve of first derivative

根據(jù)一級微商關(guān)系曲線中兩突變點對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液體積差，按式(1)計算得到的水溶性甲殼低聚糖的脫乙酰度α為85.61%。此值較之于未降解的殼聚糖有所下降，其原因可能與H2O2在反應(yīng)過程中使殼聚糖間的糖苷鍵發(fā)生斷裂時，也部分使殼聚糖結(jié)構(gòu)中的氨基發(fā)生了轉(zhuǎn)化。

2.5 水溶性甲殼低聚糖FT-IR測定結(jié)果及其歸屬

殼聚糖及水溶性甲殼低聚糖FT-IR圖見圖3。

圖3 殼聚糖及水溶性甲殼低聚糖的FT-IR圖Fig 3 FT-IR spectra of CTS and water-solublechito-oligosaccharides

由圖3可以看出，水溶性甲殼低聚糖FT-IR圖中的主要吸收峰在殼聚糖的FT-IR圖中基本都出現(xiàn)，但其主吸收峰數(shù)少于殼聚糖，說明H2O2氧化降解殼聚糖制備水溶性甲殼低聚糖過程中，糖單元的基本結(jié)構(gòu)變化較小。但由于降解反應(yīng)中存在糖苷鍵的斷裂及H2O2對殼聚糖結(jié)構(gòu)中氨基的作用，會使殼聚糖FT-IR圖中原有反映糖苷鍵、羥基和氨基的吸收峰出現(xiàn)位置及強度有部分程度的變化。

2.6 水溶性甲殼低聚糖1H NMR測定結(jié)果及其歸屬

殼聚糖及水溶性甲殼低聚糖的1H NMR圖分別見圖4和圖5。

圖4 殼聚糖1H NMR圖Fig 4 1H NMR spectrum of CTS

圖5 水溶性甲殼低聚糖1H NMR圖Fig 5 1H NMR spectrum of water-solublechito-oligosaccharides

從圖4和圖5可以看出，殼聚糖與水溶性甲殼低聚糖的1H NMR圖存在一定差異。在殼聚糖的1H NMR圖中，4.83和3.12 ppm處的峰分別對應(yīng)于氨基葡萄糖單元C1和C2上H，3.50、3.70和3.86 ppm處的峰則對應(yīng)于糖單元中C3、C4、C5和C6上H，2.68 ppm處的峰對應(yīng)于乙酰氨基葡萄糖單元C2上H，2.01 ppm處的峰對應(yīng)于乙酰胺基中甲基上H，8.41ppm處的峰對應(yīng)于糖單元在水中部分鏈?zhǔn)浇Y(jié)構(gòu)中醛基H。在水溶性甲殼低聚糖的1H NMR圖中，8.44ppm處的峰高明顯增大，說明殼聚糖降解后生成的產(chǎn)物中有更多的鏈?zhǔn)浇Y(jié)構(gòu)成分存在；殼聚糖氨基葡萄糖單元C1和C2上H對應(yīng)的峰則分別在4.71和3.16 ppm處出現(xiàn)，反映糖單元中C3、C4、C5和C6上H對應(yīng)的峰則分別出現(xiàn)在3.66～4.09 ppm處，反映乙酰胺基中甲基上H的峰出現(xiàn)在2.06 ppm處，而在1.18 ppm處出現(xiàn)的峰應(yīng)為殼聚糖降解生成的產(chǎn)物中亞甲基上的H。

3結(jié) 論

以H2O2為氧化劑，在中性介質(zhì)中可使殼聚糖氧化降解為水溶性甲殼低聚糖，并且H2O2用量、反應(yīng)溫度和保溫時間對產(chǎn)物收率存在影響，過高的反應(yīng)溫度和H2O2用量都不利于水溶性甲殼低聚糖的生成；與殼聚糖相比，產(chǎn)物的脫乙酰度有一定降低，且水溶性甲殼低聚糖產(chǎn)物中含醛基的鏈?zhǔn)浇Y(jié)構(gòu)組成明顯高于殼聚糖；在H2O2用量為3.0～3.5 mL(30%H2O2)/g(CTS)，反應(yīng)溫度和保溫時間則分別為60 ℃和7.0～8 h的條件下，水溶性甲殼低聚糖的收率可達90%左右。

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