楊 茜

（大連醫(yī)科大學檢驗醫(yī)學院，遼寧 大連 116044）

1985年K.Mullis發(fā)明的聚合酶鏈式反應技術（polymerase chain reaction，PCR），可以在體外模擬體內核酸的合成過程，大大縮短了實驗周期、降低科研成本，是生命科學領域的一項革命性壯舉。但傳統(tǒng)的PCR技術也有弊端，僅能進行半定量測定，在分析產物時需要進行開蓋操作，容易產生假陽性[1]。隨著科學技術的發(fā)展，能夠實時定量檢測核酸的實時熒光定量PCR技術（quantitative PCR，qPCR）、數字PCR技術（digital PCR，dPCR）也相繼出現，一舉攻克傳統(tǒng)PCR的技術難題。而數字PCR憑借其高通量、高準確度的特點，有著極為廣泛的應用前景[2]。

1 數字PCR技術的原理

數字PCR技術包括兩部分，PCR擴增以及熒光信號分析。它的原理是將含有DNA模板的反應體系稀釋分離成單分子，分配到大量的反應單元中進行PCR擴增反應，采集每個反應單元的熒光信號，有熒光信號記為1，無熒光信號記為0。通過陽性微滴的比例或泊松分布公式計算樣本的原始濃度或拷貝數，最終獲得結果[3]。

2 數字PCR技術分類

數字PCR的靈敏度取決于檢測器的靈敏度、PCR擴增效率以及反應單元的數目。根據反應單元形成的不同方式，將PCR技術分為三類系統(tǒng)：

2.1 微反應室數字

PCR是在不銹鋼芯上刻蝕了數以千計的微反應室，同時也將每個反應單元的體積從微升級降至納升級，提高了樣品同量，但需要借助高通量的自動點樣儀，提高了儀器成本和操作復雜性[4]。

2.2 微流控芯片數字

PCR是建立在微流體技術、納米制造技術和微電子技術等發(fā)展之上的，它的出現為我們提供了一個實現低成本、小體積和高通量PCR分析的理想平臺[5]。

2.3 液滴數字

PCR系統(tǒng)是在擴增之前進行微滴化處理，以極低的濃度包裹于油水兩項形成的數萬個納升至皮升級液滴中，每個液滴都是一個獨立的反應體系，擴增后的產物富集在磁性微球上，破乳后收集進行測序[6]。該技術的優(yōu)勢在于，能夠把不同模板的DNA分隔在不同的乳液中，避免了引物與引物之間、不同產物之間的相互影響[7]。同時可以在不同的反應室中進行同時擴增，實現了高通量測定。

3 數字PCR技術應用

3.1 病原微生物的檢測

目前醫(yī)院主要通過qPCR對血液、腦脊液等臨床樣本進行病原微生物的檢測，但qPCR仍存在較多缺點：不同實驗室標準品或者對照品之間存在誤差，導致實驗室內或者不同實驗室之間qPCR的檢測結果有差異，需建立統(tǒng)一標準曲線[2]；Yan[8]等采取感染H7N9的患者十個不同治療時期的樣本，分別進行qPCR及dPCR檢測，發(fā)現對于qPCR陰性的樣本，dPCR仍可以檢測出病毒的存在，說明dPCR的靈敏度遠高于qPCR。數字PCR不僅可以對病原體定性，而且還能對病原體DNA或RNA序列進行絕對定量，從而對疾病進行早期診斷、藥物療效觀察、病情判斷及預后觀察，目前數字PCR技術已廣泛的應用于HBV、HIV、甲型流感病毒等臨床領域[9]。

3.2 腫瘤診斷

許多腫瘤早期就出現癌基因的突變和表達異常，dPCR技術不僅能有效地檢測到癌基因的突變，而且可以準確定量其表達。如肺癌表皮生長因子受體、神經膠質瘤異檸檬酸脫氫酶及葡萄膜黑色素瘤突變的檢測[9]。miRNA是一類由內源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，它們在動植物中參與轉錄后基因表達調控，其與癌癥也密切相關[10]。田輝等人[11]建立了一種基于連接反應的微滴式數字PCR檢測單細胞中miRNA，這與研究與miRNA有關的疾病有著重要的意義。

3.3 產前診斷

產前診斷可以在出生前對胎兒的發(fā)育狀態(tài)、患有的疾病等方面進行檢測。傳統(tǒng)的侵入方法如羊水穿刺和絨毛取樣，存在讓孕婦流產的風險[10]。1997年，LO[12]發(fā)現了存在于孕婦外周血的胎兒游離的cffDN A，為無創(chuàng)產前診斷提供了新的思路。2017年，LO[13]利用數字PCR進行了cffDNA的異常分析，用于21三體綜合征的診斷，上述方法可檢測血液中25%的胎兒基因。Barrett[14]利用cffDNA進行了鐮狀紅細胞貧血的檢測。

dPCR作為一項新的技術，還存在許多問題需要解決和探討。相信隨著科技的進步與技術的革新，該技術定將廣泛的應用在生命科學的各個領域。