夏露　張峣　盧水華

結(jié)核病是當(dāng)前導(dǎo)致發(fā)展中國家兒童死亡的主要疾病之一，2016年世界衛(wèi)生組織(WHO)報道全球新發(fā)兒童結(jié)核病患者100萬例，死亡14萬例[1]。英國謝菲爾德大學(xué)研究組在《柳葉刀·全球衛(wèi)生》上的研究表明，利用新的計算模型來估算2015年全球兒童因結(jié)核病死亡的人數(shù)，5歲以下的兒童死于結(jié)核病的例數(shù)大約為20萬例[2]，這個數(shù)據(jù)說明WHO關(guān)于兒童結(jié)核病的數(shù)據(jù)有可能被低估。

中國的兒童結(jié)核病疫情同樣不容樂觀，2016年WHO報道中國兒童結(jié)核病患者發(fā)病例數(shù)為7.5萬例(其中女3.7萬例，男3.8萬例)[1]。全國第四次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查結(jié)果顯示，0～14歲兒童結(jié)核病感染率為9%，活動性肺結(jié)核患病率為91.8/10萬，估算約有2608萬例兒童感染結(jié)核分枝桿菌，活動性肺結(jié)核患兒約26.6萬例。其中，兒童菌陽肺結(jié)核的患病率為12.3/10萬，兒童涂陽肺結(jié)核的患病率為6.7/10萬[3]。

龐大的患病率必然使兒童結(jié)核病成為WHO關(guān)注的焦點(diǎn)，2014年WHO出版了《國家結(jié)核病規(guī)劃關(guān)于兒童結(jié)核病處理指南》[4]，并從戰(zhàn)略上提出了《全球兒童結(jié)核病零死亡率藍(lán)圖》[5]，可以展望兒童結(jié)核病的防控未來將獲得長足進(jìn)步。但是由于兒童具有咳嗽反射較弱、細(xì)菌載量較低、痰標(biāo)本獲取較為困難、痰涂片陽性率較低，以及肺外結(jié)核所占比例較高等特點(diǎn)，兒童結(jié)核病的診斷目前仍面臨著巨大的挑戰(zhàn)，零死亡率短期內(nèi)尚不可能實(shí)現(xiàn)。降低死亡率的重點(diǎn)是要提高兒童結(jié)核病的早期診斷率，實(shí)驗(yàn)室檢查是結(jié)核病診斷、治療及預(yù)防控制的重要依據(jù)。近年來出現(xiàn)了一些新的診斷方法用于診斷兒童結(jié)核病，譬如γ干擾素釋放試驗(yàn)(IGRA)、分子診斷技術(shù)、早期分泌靶抗原-6(ESAT-6)和培養(yǎng)濾液蛋白-10(CFP-10)融合蛋白皮膚試驗(yàn)等，大大提高了兒童結(jié)核病的確診率，筆者對以上診斷方法在兒童結(jié)核病中的最新進(jìn)展進(jìn)行綜述。

一、IGRA

目前，結(jié)核分枝桿菌特異性的IGRA已被WHO列入結(jié)核病的診斷指南, 并且已推薦用于幫助診斷兒童的潛伏結(jié)核感染和結(jié)核病[6]。它主要是用兩種結(jié)核特異性蛋白——ESAT-6及CFP-10，來刺激外周血中結(jié)核特異性T淋巴細(xì)胞釋放γ干擾素(IFN-γ)，從而進(jìn)行檢測。根據(jù)檢測方法的不同，IGRA主要有兩種技術(shù)：一種是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，另外一種是結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT.TB)。研究顯示，這兩種方法對結(jié)核感染的診斷價值相當(dāng)[7]。Shimizu等[8]入組了52例15歲以下的潛伏結(jié)核感染或活動性結(jié)核病患者，所有患者均行T-SPOT.TB與結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)(TST)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)T-SPOT.TB檢測為陽性的患者有9例(17.3%)，TST試驗(yàn)結(jié)果為陽性的患者有12例(23.1%)，有7例患者出現(xiàn)T-SPOT.TB與TST試驗(yàn)結(jié)果不一致的情況，這7例患者結(jié)合影像學(xué)檢查資料及與結(jié)核病患者接觸史，均提示有潛伏結(jié)核感染或活動性結(jié)核??；可見，單用T-SPOT.TB或TST可能會誤診，建議聯(lián)合應(yīng)用T-SPOT.TB與TST檢查提高診斷率。孫琳等[9]關(guān)于T-SPOT.TB在不同年齡活動性結(jié)核病患兒診斷中的應(yīng)用價值的一項研究發(fā)現(xiàn)，在1072例研究對象中，T-SPOT.TB的敏感度與TST試驗(yàn)相近，特異度高于TST試驗(yàn)，該研究證明了T-SPOT.TB在各年齡階段的兒童均具有較好的敏感度和特異度，在活動性結(jié)核病患兒的輔助診斷中具有一定的應(yīng)用價值。

Bielecka等[10]的研究分析了ELISA檢測中IFN-γ在不同年齡兒童中、不同采血管中釋放水平的差別。該研究共入組153例疑似結(jié)核病患兒，其中，45例兒童年齡≤5歲，108例兒童年齡>5歲；在陽性對照管中，IFN-γ水平與年齡呈正相關(guān)，在結(jié)核抗原管中呈負(fù)相關(guān)，也就是說患者年齡越小，IFN-γ水平越高。該研究顯示ELISA在≤5歲的活動性結(jié)核病及潛伏結(jié)核感染的患兒中有良好的應(yīng)用價值，并且其與TST的一致性達(dá)到82.52%。Lombardi等[11]的研究進(jìn)一步驗(yàn)證了年齡越小，ELISA檢測出來的IFN-γ水平越高；此外，該研究還進(jìn)一步說明，IFN-γ在活動性結(jié)核病患者中的水平高于潛伏結(jié)核感染患者。Sollai等[12]對IGRA在兒童中的應(yīng)用價值進(jìn)行了Meta分析，該文章一共包括31項ELISA研究(6183例兒童)，14項T-SPOT.TB研究(2518例兒童)，34項TST研究(6439例兒童)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在高收入國家，IGRA檢測的敏感度和特異度均高于TST試驗(yàn)；而在低收入國家，IGRA的優(yōu)勢并不明顯。

總體來說，IGRA不受機(jī)體免疫力及卡介苗(BCG)接種的影響，對潛伏期、不典型結(jié)核、肺外結(jié)核，以及HIV并發(fā)結(jié)核感染具有較高的診斷價值，但是否為活動性結(jié)核病，IGRA需要結(jié)合臨床癥狀及其他檢測指標(biāo)進(jìn)行綜合判斷，以便準(zhǔn)確區(qū)分活動性結(jié)核病和潛伏期結(jié)核感染。

二、GeneXpert MTB/RIF檢測

本系統(tǒng)是一種半定量巢式實(shí)時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)體外診斷試驗(yàn)，實(shí)時PCR技術(shù)和反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)相結(jié)合，可以同時檢測結(jié)核分枝桿菌和其對利福平的耐藥性，2 h可以獲得檢測結(jié)果[13]。WHO建議GeneXpert MTB/RIF(以下簡稱“Xpert”)可取代痰涂片和痰培養(yǎng)檢測，作為檢測疑似肺結(jié)核、疑似耐多藥肺結(jié)核或并發(fā)HIV感染的首選方法[4]。目前，各國關(guān)于Xpert在兒童結(jié)核病不同診斷金標(biāo)準(zhǔn)、不同樣本種類、數(shù)量及保存條件、不同并發(fā)癥患兒中的應(yīng)用都有大量報道。

當(dāng)選取不同金標(biāo)準(zhǔn)時，Xpert敏感度、特異度不同。以結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)時，美國Detjen等[14]對Xpert檢測在兒童肺結(jié)核的應(yīng)用進(jìn)行了Meta分析，總共納入15項研究，包括3640例兒童肺結(jié)核患者，4768個呼吸樣本；研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，痰液Xpert檢測的敏感度和特異度分別為62%和98%，胃液Xpert檢測的敏感度和特異度分別為66%和98%。以綜合臨床參考標(biāo)準(zhǔn)(composite clinical reference standard，CCRS)為金標(biāo)準(zhǔn)時，Nhu等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，Xpert檢測在肺結(jié)核患兒中的敏感度可達(dá)50.0%，明顯高于痰培養(yǎng)及痰涂片；Xpert檢測的陽性率較結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)高33.9%，較抗酸染色鏡檢高48.7%以上。中國的一項研究發(fā)現(xiàn)，支氣管肺泡灌洗液的結(jié)核分枝桿菌涂片、培養(yǎng)和Xpert檢測的敏感度分別為8.4%、28.9%和53%，3種檢測方法的特異度均為100.0%[16]，該研究證明Xpert檢測的診斷敏感度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于培養(yǎng)。南非的一項研究納入了102例疑似骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者，其以病理結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)Xpert檢測的敏感度和特異度分別為73.9%、100.0%[17]。

不同樣本種類、數(shù)量及儲存方法對Xpert的檢測結(jié)果影響較大。南非Bunyasi等[18]發(fā)現(xiàn)，采集患者 1 份胃液進(jìn)行Xpert檢測的敏感度、特異度分別為9.4%、99.9%，2份胃液進(jìn)行檢測的敏感度、特異度分別為22.6%、99.4%；采集患者1份誘導(dǎo)痰進(jìn)行檢測的敏感度、特異度分別為22.6%、100%，2份誘導(dǎo)痰進(jìn)行檢測的敏感度、特異度分別為26.7%、100%。印度Singh等[19]的研究納入130例肺結(jié)核患兒，每例患者均連續(xù)2 d 收集誘導(dǎo)痰及胃液行檢查，也發(fā)現(xiàn)連續(xù) 2 d 收集樣本可明顯增加培養(yǎng)及Xpert檢測的陽性率。此外，該研究將所有標(biāo)本儲存于-80 ℃環(huán)境中，發(fā)現(xiàn)在保存650～849 d的涂片陽性標(biāo)本中，誘導(dǎo)痰和胃液進(jìn)行Xpert檢測的敏感度分別為85.7%和77.1%；如果保存超過1050 d，敏感度則分別下降到33.3%和50.0%。Banada等[20]進(jìn)行了糞便Xpert檢測診斷肺結(jié)核的研究，該研究入組了痰液或胃液Xpert檢測陽性的20例確診肺結(jié)核的兒童及20例非結(jié)核病兒童，分別取患兒0.2 g、0.6 g和1.2 g糞便進(jìn)行Xpert檢測，發(fā)現(xiàn)用0.6 g糞便進(jìn)行Xpert檢測時，敏感度、特異度最高，分別為85%、100%。

患者的并發(fā)癥、營養(yǎng)狀況也可能影響Xpert檢測的結(jié)果。Chisti等[21]報道了在嚴(yán)重營養(yǎng)不良和重癥肺部感染兒童中，采用誘導(dǎo)痰和胃液進(jìn)行Xpert檢測的診斷率均較培養(yǎng)高。

以上關(guān)于Xpert檢測的報道中，多數(shù)報道Xpert檢測的敏感度低于痰培養(yǎng)檢查[14,18-20]，少量研究提示Xpert檢測的敏感度高于結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)，考慮可能與Xpert檢測陰性的患者隨訪缺失，造成敏感度假性升高有關(guān)?？傮w來說，Xpert檢測在兒童肺結(jié)核及耐藥結(jié)核病的診斷效能較高，聯(lián)合培養(yǎng)可提高兒童結(jié)核病的確診率，且操作簡便，檢出時間快，是目前較為理想的兒童結(jié)核病診斷方法。

目前，最新一代Xpert MTB/RIF Ultra檢測(簡稱Xpert Ultra)已問世，傳統(tǒng)Xpert檢測的最小檢出菌量為131 CFU/ml，BACTEC MGIT培養(yǎng)的最小檢出菌量為10～100 CFU/ml[14]，而Xpert Ultra檢測最小檢出菌量僅為10 CFU/ml。一項大型前瞻性多中心研究顯示，Xpert Ultra的敏感度高于Xpert，但兩者在檢測是否對利福平耐藥時差異無統(tǒng)計學(xué)意義[22]。Xpert Ultra用于兒童結(jié)核病的檢測效能目前尚未見文章報道，相信未來2年應(yīng)該有兒童結(jié)核病應(yīng)用Xpert Ultra檢測的研究出現(xiàn)。

其他的分子生物學(xué)技術(shù)還包括環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)、RNA恒溫擴(kuò)增實(shí)時熒光檢測技術(shù)(SAT)、線性探針技術(shù)(LPA)等，但其應(yīng)用于兒童的數(shù)據(jù)極少，暫且不進(jìn)行詳細(xì)闡述。

三、重組ESAT-6和CFP-10融合蛋白皮試試驗(yàn)

TST是診斷結(jié)核病的一種傳統(tǒng)方法，其操作簡便易行，成本低廉。但TST缺少預(yù)期的特異度及敏感度，由于BCG接種較為普及，非結(jié)核分枝桿菌感染率也較高，使TST出現(xiàn)了較高的假陽性率，診斷特異度較低。CFP-10與ESAT-6僅存在于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和少數(shù)致病性結(jié)核分枝桿菌基因組中，所有BCG菌株及絕大部分環(huán)境分枝桿菌(海分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、微黃分枝桿菌除外)基因組均無該區(qū)基因。因此，目前由重組ESAT-6和CFP-10融合蛋白制成的結(jié)核診斷試劑已成為熱點(diǎn)，如丹麥國立血清研究所的C-Tb皮試試驗(yàn)、俄羅斯的“diaskintest (DST)”皮膚試驗(yàn)、中國的ESAT6-CFP10(EC)皮試試驗(yàn)，均是研究較系統(tǒng)、規(guī)模較大的團(tuán)隊。2017年丹麥Morten Ruhwald 研究團(tuán)隊[23]關(guān)于C-Tb皮試的研究發(fā)表在《柳葉刀-呼吸醫(yī)學(xué)雜志》上，該試驗(yàn)在2012—2014年期間共入組了979例受試者(其中5歲以下受試者共35例，5～17歲受試者共86例)，所有受試者均行TST、ELISA、C-Tb檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著結(jié)核感染風(fēng)險增加，C-Tb的陽性率也逐步增高，在活動性結(jié)核患者里面，C-Tb陽性率稍低于ELISA，C-Tb與TST檢測安全性相當(dāng)。Slogotskaya等[24]的研究共納入2609例成年及未成年的肺結(jié)核、肺外結(jié)核、潛伏結(jié)核感染、非結(jié)核病、接種BCG的受試者，所有受試者均行DST試驗(yàn)及TST試驗(yàn)。該研究結(jié)論說明DST試驗(yàn)在所有類型兒童及青少年受試者中，都具有很高的敏感度和特異度。在中國開展的重組結(jié)核分枝桿菌EC變態(tài)反應(yīng)原人體臨床試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱa期已完成，EC皮試后24～72 h診斷的敏感度為85.88%，特異度為92.86%，與皮試前T-SPOT.TB檢查的診斷一致率達(dá)90.07%。同時證實(shí)，重組蛋白EC在健康人群和肺結(jié)核患者中檢測的安全性良好，皮試后無潛在增敏風(fēng)險，診斷敏感度和特異度與T-SPOT.TB相當(dāng)，而明顯優(yōu)于TST[25-26]。目前，中國EC Ⅲ期在兒童結(jié)核病中的臨床試驗(yàn)?zāi)壳耙淹瓿桑嚓P(guān)數(shù)據(jù)暫未公布。

總之，ESAT-6和CFP-10融合蛋白皮試試劑無BCG的交叉反應(yīng)，價格便宜，容易操作，以后在兒童結(jié)核病診斷中的應(yīng)用前景較樂觀。

四、臨床癥狀診斷

WHO推薦基于癥狀的篩查方法可以提高兒童結(jié)核病的診斷率[27]。Mulenga等[28]的研究一共入組了1017例疑似肺結(jié)核的患兒，持續(xù)咳嗽在臨床診斷肺結(jié)核的患兒中陽性率為16.9%(172/1017)，結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)及Xpert檢測的總陽性率為3.7%(38/1017)，X線胸部攝影檢查的陽性率為12.9%(131/1017)，咳嗽的OR值是培養(yǎng)及Xpert檢測陽性率的3倍，并且持續(xù)咳嗽是唯一在重癥肺結(jié)核及非重癥肺結(jié)核中有差別的癥狀。Triasih等[29]的研究顯示，在98例有體質(zhì)量減輕和咳嗽、發(fā)熱等癥狀的兒童里面，有21%的兒童患者最后被診斷為肺結(jié)核；171例無結(jié)核感染相關(guān)癥狀的患者，最終0例確診為活動性結(jié)核病。該研究表明，基于癥狀診斷結(jié)核病是一種簡單而安全的篩查方法，可以在初級保健水平上實(shí)施?？傮w來說，有以下3條癥狀的兒童應(yīng)高度懷疑活動性結(jié)核病[30]：(1)持續(xù)咳嗽2周以上；(2)近3個月內(nèi)發(fā)育遲緩；(3)乏力。

此外，相應(yīng)器官的影像學(xué)檢查、血紅細(xì)胞沉降率、結(jié)核抗體、組織活檢等均有利于兒童結(jié)核病的診斷，因以上檢查特異度不高，需結(jié)合病原學(xué)、分子生物學(xué)檢查聯(lián)合判斷，且近幾年在兒童結(jié)核病的診斷方面無較多進(jìn)展，在此不一一詳述。

綜上所述，我國目前兒童結(jié)核病流行的趨勢還相當(dāng)嚴(yán)峻。在診斷兒童結(jié)核病時，由于取得細(xì)菌學(xué)診斷依據(jù)較難，現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)室或影像學(xué)檢查都不能達(dá)到令人滿意的診斷敏感度，故我們應(yīng)采取多樣本、多個診斷測試的組合以獲得更好的診斷收益。隨著新技術(shù)的不斷涌現(xiàn)，多種有潛力的新診斷方法被開發(fā)并逐步在臨床應(yīng)用，例如現(xiàn)代分子生物學(xué)方法是目前較好的診斷技術(shù)，可快速地為病原學(xué)診斷提供重要的線索。但無論哪種方法均各有優(yōu)劣，對兒童結(jié)核病還需結(jié)合臨床表現(xiàn)及多種聯(lián)合診斷方法的檢測結(jié)果加以綜合診斷。

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