安軍　逄宇

結(jié)核病仍然是危害人類身體健康的重大公共衛(wèi)生問題，全球每年新發(fā)結(jié)核病患者超過1000萬例，同時有近170萬例患者死于結(jié)核病[1]。結(jié)核病的早期診斷不僅可以提高患者預(yù)后，同時對于有效控制結(jié)核病在人際之間的傳播具有重要意義[2]。菌陰肺結(jié)核是指診斷缺乏痰涂片和培養(yǎng)依據(jù)的活動性肺結(jié)核。據(jù)估算，我國菌陰肺結(jié)核患者約占所有肺結(jié)核患者的70%[3]。由于菌陰肺結(jié)核患者缺乏特異性臨床表現(xiàn)，僅依靠醫(yī)生的臨床經(jīng)驗進(jìn)行診斷易造成誤診、過診和漏診[3]，因此，迫切需要快速、準(zhǔn)確、價廉的診斷技術(shù)為其診斷提供實驗室證據(jù)。此外，中華人民共和國國務(wù)院辦公廳頒布的《“十三五”全國結(jié)核病防治規(guī)劃》中明確指出，到2020年，我國肺結(jié)核患者病原學(xué)陽性率達(dá)到50%以上[4]。因此，菌陰肺結(jié)核的診斷值得我們進(jìn)一步關(guān)注。

一、努力提升現(xiàn)有結(jié)核病實驗室診斷的質(zhì)量

痰涂片和培養(yǎng)仍然是我國現(xiàn)階段結(jié)核病患者發(fā)現(xiàn)最主要的實驗室檢查手段，然而，兩種細(xì)菌學(xué)檢查方法受到諸多因素的影響[5]。研究表明，細(xì)菌學(xué)檢查的影響因素之一就是痰標(biāo)本質(zhì)量，唾液痰中結(jié)核分枝桿菌陽性檢出率明顯低于其他類型的痰標(biāo)本[6]；同樣，實驗室質(zhì)量控制存在問題將在細(xì)菌學(xué)檢查中容易造成假陰性的發(fā)生，其影響因素有試劑質(zhì)量、操作規(guī)范程度等[7]。因此，需要首先甄別菌陰肺結(jié)核患者中部分由標(biāo)本質(zhì)量等因素造成的“假陰性”。應(yīng)重點關(guān)注標(biāo)本質(zhì)量和操作規(guī)范，加強與臨床人員的溝通，強化標(biāo)本質(zhì)量在檢測效果中重要意義的認(rèn)識；同時，努力提升結(jié)核病實驗室檢測質(zhì)量，從而提高結(jié)核病患者病原學(xué)檢測的陽性率。

二、合理應(yīng)用現(xiàn)有的菌陰肺結(jié)核診斷的適宜技術(shù)

當(dāng)細(xì)菌學(xué)檢測方法對于痰標(biāo)本“束手無策”時，分子生物學(xué)技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)和病理學(xué)技術(shù)可為結(jié)核病實驗室診斷提供重要補充。然而，如何理解并合理應(yīng)用現(xiàn)有的菌陰肺結(jié)核診斷的適宜技術(shù)，并且服務(wù)于臨床一直存在爭議。

(一)綜合運用菌陰肺結(jié)核診斷的分子生物學(xué)技術(shù)

近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展的突飛猛進(jìn)，涌現(xiàn)出一批用于結(jié)核病早期診斷的快速診斷技術(shù)[5]。多中心大樣本臨床評估結(jié)果表明，多種分子生物學(xué)檢測技術(shù)不僅對菌陽肺結(jié)核患者具有很高的檢出率，而且對于菌陰肺結(jié)核患者也具有一定的陽性檢出率[8-10]。上述研究成果拓展了分子生物學(xué)檢測技術(shù)用于菌陰肺結(jié)核診斷的應(yīng)用前景，特別是2013年世界衛(wèi)生組織修訂了結(jié)核病的診斷標(biāo)準(zhǔn)，將世界衛(wèi)生組織推薦的分子生物學(xué)檢測技術(shù)陽性檢出結(jié)果視同于細(xì)菌學(xué)檢測陽性，作為病原學(xué)陽性結(jié)核病的診斷依據(jù)[11]。我國也于2017年修訂了肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)，將分子生物學(xué)技術(shù)檢測陽性結(jié)果作為病原學(xué)陽性結(jié)核病的診斷標(biāo)準(zhǔn)[12]，從而極大地補充了傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)檢測方法，積極發(fā)揮分子生物學(xué)檢測技術(shù)對于涂陰肺結(jié)核患者的診斷優(yōu)勢，從而使其更好地服務(wù)于臨床。

(二)正視免疫學(xué)技術(shù)在菌陰肺結(jié)核診斷中的作用

結(jié)核病免疫學(xué)診斷技術(shù)主要包括血清結(jié)核抗體檢測、結(jié)核變態(tài)反應(yīng)原皮膚試驗和結(jié)核特異性抗原γ干擾素體外檢測，三者均可輔助診斷結(jié)核病，特別是對于菌陰肺結(jié)核的診斷，上述3種免疫學(xué)方法均表現(xiàn)出了特有的優(yōu)勢[13]。其中，血清學(xué)抗體檢測技術(shù)近年來由于其高度可變的敏感度和特異度，一直飽受詬病[14]。近期撰寫的關(guān)于結(jié)核抗體檢測的專家共識中系統(tǒng)分析了導(dǎo)致上述問題的原因，提出在提高產(chǎn)品自身質(zhì)量的同時，優(yōu)化檢測平臺，篩選能夠反映不同患者感染發(fā)病狀態(tài)的抗原組合，將是未來發(fā)展的方向[13]。第二，結(jié)核變態(tài)反應(yīng)原皮膚試驗，即結(jié)核菌素試驗。一個世紀(jì)以來，結(jié)核菌素試驗一直廣泛用于結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查和監(jiān)測，評價卡介苗接種質(zhì)量及輔助結(jié)核病的診斷和鑒別診斷。但是由于其不能區(qū)分卡介苗接種與結(jié)核感染，因此，其檢測特異度受到很大影響。近期出現(xiàn)的人型結(jié)核菌素試驗，能夠排除上述混雜，尤其在菌陰肺結(jié)核患者的輔助診斷中可以提高檢測特異度，未來具有一定的應(yīng)用前景[15]。第三，結(jié)核特異性抗原γ干擾素體外檢測試驗是目前國內(nèi)外最主流的用于結(jié)核感染檢測的方法，特別是對于特殊人群，其可表現(xiàn)出很高的陽性率。因此，可以為菌陰肺結(jié)核的輔助診斷提供重要依據(jù)。兩項在人群中開展的研究表明，γ干擾素體外檢測結(jié)果受結(jié)核病診斷依據(jù)、痰菌量、既往結(jié)核病史或肺部陳舊性結(jié)核病灶、非結(jié)核分枝桿菌(NTM)感染、結(jié)核病灶部位等多種因素的影響[16-17]，因此，在將其用于輔助診斷菌陰肺結(jié)核時，需綜合考慮上述各項因素后做出判斷。值得注意的是，在實際工作中，不可忽視免疫學(xué)檢測方法的作用，更不能夸大其在結(jié)核病診斷中的作用。

(三)拓展病理學(xué)在結(jié)核病診斷中的作用

病理學(xué)診斷是細(xì)菌學(xué)之外最重要的結(jié)核病確診途徑之一，在痰菌陰性的肺結(jié)核及肺外結(jié)核的診斷中發(fā)揮著非常重要的作用[18]。傳統(tǒng)的肺結(jié)核病理學(xué)診斷主要采用抗酸染色及蘇木素-伊紅染色等。抗酸染色是尋找病原學(xué)依據(jù)的重要途徑，但其敏感度較低，在臨床診斷中通常結(jié)合“肉芽腫性炎癥”這一重要組織病理學(xué)特征。但是由于其他感染亦可能出現(xiàn)上述特征，因此，聯(lián)合其他結(jié)核特異性的檢測方法，對于提高病理學(xué)診斷菌陰肺結(jié)核的特異度具有重要意義[18]。本期董宇杰等[19]評價免疫組織化學(xué)及熒光定量PCR對結(jié)核病的診斷價值，與傳統(tǒng)抗酸染色法相比，其敏感度從27.1%分別提高到52.1%和60.4%，提示免疫學(xué)及分子生物學(xué)檢測方法可為結(jié)核病的診斷提供更加敏感和準(zhǔn)確的依據(jù)。但是，病理學(xué)有創(chuàng)檢查的特點可能限制了其在菌陰肺結(jié)核診斷中的作用。

三、展望

盡管眾多新型診斷技術(shù)為臨床診斷菌陰肺結(jié)核提供了備選方案，但是菌陰肺結(jié)核實驗室診斷技術(shù)的效能仍然差強人意。并非是現(xiàn)有技術(shù)的敏感度不夠高，而是由于肺結(jié)核發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性所致。痰標(biāo)本中含有的結(jié)核分枝桿菌菌量依賴于結(jié)核病灶進(jìn)展，并與引流支氣管相通[20]，此時需要患者的病情進(jìn)展到一定程度，而當(dāng)患者在發(fā)病早期階段就診時，通常病灶中結(jié)核分枝桿菌并未進(jìn)入氣管。因此，使用傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)及分子生物學(xué)方法注定無法圓滿完成對這種早期菌陰肺結(jié)核患者的診斷。2009年，有研究報道采用檢測尿液中的脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)診斷結(jié)核病。LAM是一種結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁成分，活躍代謝的結(jié)核分枝桿菌會合成大量的LAM并從細(xì)胞壁到血液，并部分進(jìn)入尿液中。然而前期的評估結(jié)果表明，基于LAM的抗原檢測方法在HIV陽性的結(jié)核病患者中的敏感度達(dá)到67%，而在HIV陰性的結(jié)核病患者中的敏感度僅為14%。提示基于尿液的LAM檢測方法僅適于HIV感染的特殊人群[21]。2017年，美國科學(xué)家報道了一種基于對結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白(培養(yǎng)濾液蛋白10和早期分泌靶抗原6)為標(biāo)志物的抗原檢測方法，借助質(zhì)譜技術(shù)可以從結(jié)核病患者血液中通過早期發(fā)現(xiàn)活躍代謝的結(jié)核分枝桿菌分泌的蛋白肽段，從而對菌陰肺結(jié)核患者進(jìn)行診斷[22]。盡管上述新技術(shù)尚處于研發(fā)及上市審批階段，但是上述方法為結(jié)核病診斷提供了一種新思路，即開發(fā)基于結(jié)核分枝桿菌分泌抗原的新型診斷技術(shù)是未來診斷菌陰肺結(jié)核的重要方向之一。

此外，除了分泌抗原的檢測方法，尋找血液中新型診斷標(biāo)志物也是結(jié)核病特別是菌陰肺結(jié)核診斷的新思路。近年來，基于外泌體發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA被廣泛應(yīng)用于腫瘤、精神類疾病的早期診斷[23]。外泌體中豐富的非編碼RNA使其檢測成為一種有巨大潛在價值的無創(chuàng)診斷方法。目前，對結(jié)核病外泌體的研究正處于早期階段，隨著對結(jié)核病患者血液轉(zhuǎn)錄組及代謝組學(xué)的不斷解析，未來將發(fā)現(xiàn)越來越多的適用于結(jié)核病早期診斷的標(biāo)志物[24]。

加強菌陰肺結(jié)核的早期診斷，對于有效控制我國結(jié)核病疫情具有重要意義。努力提升現(xiàn)有實驗室診斷質(zhì)量、綜合運用現(xiàn)有實驗室診斷技術(shù)將提高菌陰肺結(jié)核診斷的準(zhǔn)確性。但是，鑒于結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制，在血液中尋找適合結(jié)核病早期診斷的新型分子標(biāo)志物及檢測平臺將從根本上彌補現(xiàn)有實驗室方法對于菌陰肺結(jié)核診斷的不足。

[1] World Health Organization. Global tuberculosis report 2017. Geneva: World Health Organization, 2017.

[2] van Cutsem G, Isaakidis P, Farley J, et al. Infection control for drug-resistant tuberculosis: early diagnosis and treatment is the key. Clin Infect Dis, 2016, 62 Suppl 3: S238-S243.

[3] 唐神結(jié). 菌陰肺結(jié)核患者的臨床特征. 中華結(jié)核和呼吸雜志, 2005, 28(10): 674-676.

[4] 中華人民共和國國務(wù)院辦公廳.國務(wù)院辦公廳關(guān)于印發(fā)“十三五”全國結(jié)核病防治規(guī)劃的通知. 國辦發(fā)〔2017〕16號. 2017-02-01.

[5] Dorman S. Advances in the diagnosis of tuberculosis: current status and future prospects. Int J Tuberc Lung Dis, 2015, 19(5): 504-516.

[6] Cattamanchi A, Huang L, Worodria W, et al. Integrated strategies to optimize sputum smear microscopy: a prospective observational study. Am J Respir Crit Care Med, 2011, 183(4): 547-551.

[7] 楊新宇, 丁北川, 王甦民. 肺結(jié)核病人痰涂片鏡檢室間質(zhì)量保證模式的評價研究. 中國防癆雜志, 2008, 30(1): 43-46.

[8] Lawn SD, Mwaba P, Bates M, et al. Advances in tuberculosis diagnostics: the Xpert MTB/RIF assay and future prospects for a point-of-care test. Lancet Infect Dis, 2013, 13(4): 349-361.

[9] Ou X, Li Q, Xia H, et al. Diagnostic accuracy of the PURE-LAMP test for pulmonary tuberculosis at the county-level laboratory in China. PLoS One, 2014, 9(5): e94544.

[10] Pang Y, Wang Y, Zhao S, et al. Evaluation of the Xpert MTB/RIF assay in gastric lavage aspirates for diagnosis of smear-negative childhood pulmonary tuberculosis. Pediatr Infec Dis J, 2014, 33(10): 1047-1051.

[11] World Health Organization. Definitions and reporting framework for tuberculosis-2013 revision. 2013. Geneva: World Health Organization, 2014.

[12] 中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會. WS 288—2017肺結(jié)核診斷. 2017-11-09.

[13] 《中國防癆雜志》編輯委員會, 中國醫(yī)療保健國際交流促進(jìn)會結(jié)核病防治分會基礎(chǔ)學(xué)組和臨床學(xué)組. 現(xiàn)階段結(jié)核抗體檢測在我國臨床應(yīng)用的專家共識. 中國防癆雜志, 2018, 40(1): 9-13.

[14] World Health Organization. Commercial serodiagnostic tests for diagnosis of tuberculosis: policy statement. Geneva: World Health Organization, 2011.

[15] 李衛(wèi)彬, 侯琰, 程新征. 結(jié)核菌素試驗的臨床應(yīng)用進(jìn)展. 臨床肺科雜志, 2014, 19(4): 737-739.

[16] 尹洪云, WenLing Tan, 馬俊, 等. 結(jié)核感染T細(xì)胞斑點試驗在不同患者群中的檢測結(jié)果分析. 中國防癆雜志, 2018, 40(4): 358-364.

[17] 廉娟雯, 黨麗云, 許家玲, 等. 結(jié)核感染T細(xì)胞斑點試驗在惡性腫瘤并發(fā)結(jié)核病患者中的應(yīng)用價值. 中國防癆雜志, 2018, 40(4): 353-357.

[18] 中華醫(yī)學(xué)會結(jié)核病學(xué)分會, 結(jié)核病病理學(xué)診斷專家共識編寫組. 中國結(jié)核病病理學(xué)診斷專家共識. 中華結(jié)核和呼吸雜志, 2017, 40(6): 419-425.

[19] 董宇杰, 張莉, 王宇軒, 等. 免疫組織化學(xué)及PCR技術(shù)在淋巴結(jié)結(jié)核病理診斷中的應(yīng)用價值. 中國防癆雜志, 2018, 40(4): 348-352.

[20] 成詩明. 進(jìn)一步提高我國涂陰肺結(jié)核的防治和管理水平. 中國防癆雜志, 2015, 37(5): 470-472.

[21] Lawn SD. Point-of-care detection of lipoarabinomannan (LAM) in urine for diagnosis of HIV-associated tuberculosis: a state of the art review. BMC Infect Dis, 2012, 12: 103.

[22] Liu C, Zhao Z, Fan J, et al. Quantification of circulatingMycobacteriumtuberculosisantigen peptides allows rapid diagnosis of active disease and treatment monitoring. Proc Natl Acad Sci U S A, 2017, 114(15): 3969-3974.

[23] 黃依瑤, 鄭磊. 重視外泌體的實驗診斷價值. 中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志, 2015, 38(11): 724-726.

[24] Smith VL, Cheng Y, Bryant BR, et al. Exosomes function in antigen presentation during an in vivoMycobacteriumtuberculosisinfection. Sci Rep, 2017, 7: 43578.