黃名威 吳留成 周帆 覃宇周 陳建思

國家癌癥中心2015年數據［1］顯示，我國每年新發(fā)癌癥病例約337萬，發(fā)病率為250/10萬，每年癌癥死亡人數約211萬，死亡率為156/10萬，僅次于心腦血管疾病。眾所周知，惡性腫瘤治療后復發(fā)或遠處轉移是治療失敗的主要原因。目前，臨床上發(fā)現和診斷惡性腫瘤復發(fā)轉移主要依靠影像學檢查及傳統(tǒng)的腫瘤標志物監(jiān)測，但兩者均難以早期發(fā)現轉移或復發(fā)，也難以及時反映療效。因此，尋找更加靈敏的預測因子對監(jiān)測腫瘤復發(fā)轉移具有重大現實意義。循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）的發(fā)現及研究使腫瘤早期診斷及療效預測成為研究熱點之一，本文就CTCs參與腫瘤復發(fā)轉移機制的研究進展作一綜述。

1 循環(huán)腫瘤細胞的定義

CTCs是指因自發(fā)或診療操作由原發(fā)灶或轉移灶進入外周血循環(huán)的腫瘤細胞。1869年，澳大利亞A shworth教授在血液中發(fā)現類似原發(fā)灶腫瘤細胞的循環(huán)細胞，并首次提出CTCs的概念［2］。但由于技術原因，CTCs的研究并未引起足夠重視，直至Ce llS ear c h系統(tǒng)的問世才激起研究者對CTCs研究的密切關注。由于CTCs研究在腫瘤早期診斷、治療效果評估及腫瘤復發(fā)監(jiān)測等方面凸顯巨大潛力，已成為當前癌癥研究的熱點之一。近年關于CTCs分離富集技術、鑒定方法及分子機制的研究不斷取得新的突破，已在乳腺癌［3］、前列腺癌［4］、肺癌［5］、結直腸癌［6］、頭頸部腫瘤［7］、胃癌［8-10］、胰腺癌［11］、肝癌［12］等證實CTCs的存在。研究發(fā)現CTCs與早期轉移［13］、療效反應［14］及臨床預后［15］等密切相關，并認為CTCs可作為一種新型的診斷工具，為臨床提供良惡性診斷、臨床分期判定等信息，輔助臨床醫(yī)師診斷和治療。檢測CTCs較傳統(tǒng)的侵入性病理活檢具有取材方便、非創(chuàng)傷性、避免腫瘤轉移擴散和良好的重復性等特點，因此又被稱為“液相活檢”［16-17］。

2 CTCs的分離富集

由于外周血中CTCs的數量極少，僅為1～10個/10mL，因此，要從數百萬計的血細胞中分離CTCs，對技術的要求極高。根據分選原理不同，CTCs的分離富集技術可分為兩大類［18］：一是根據CTCs的物理學特性，如大小、密度、電荷及可塑性等進行分離富集。方法主要有密度梯度離心法、膜過濾法及介電泳分離富集法等，每種富集方法均有其優(yōu)缺點。密度梯度離心法簡單經濟，但需要的血量較大，且分離后純度較低，易受單核細胞影響；而膜過濾法雖簡便、易于操作，但小于濾膜孔徑的CTCs會丟失，因此靈敏度較低；介電泳分離富集技術雖特異性較強、回收率較高，但因其通量較小、耗時較多，很少應用于臨床。二是根據CTCs的生物學特性進行分離富集，即根據CTCs表達的抗原有別于外周血細胞將捕獲的抗體包被于磁珠表面，利用抗原抗體特異性結合，當血液經外磁場時抗原抗體復合物被吸附并滯留，從而達到分離富集的目的?；诿庖邔W原理的CTCs分離富集技術的關鍵是尋找到理想的細胞標志物，即用于識別的細胞抗原是CTCs特有且恒定表達的抗原，目前這種理想的標志物尚未發(fā)現。由于大多數的實體腫瘤來源于上皮細胞，因此上皮細胞表面標志物（如EpCAM、CK等）是目前研究上皮來源惡性腫瘤CTCs最常用的標志物［18］。免疫分離富集法又可分為陽性分選法和陰性分選法。陽性分選法以CTCs作為目的細胞進行直接捕獲，Cell Search系統(tǒng)是陽性分選技術的經典代表。近年研究較多、發(fā)展最迅速的微流體芯片捕獲法［19-21］也屬于陽性分選法，該法將包被有E pC A M抗體的芯片附著于硅片上，當全血流經硅片時，芯片對CTCs進行捕獲。微流體芯片分離富集方法自動化程度高，富集的CTCs純度高，但因制作復雜，成本高昂，且受周圍血流通暢性的影響，距大范圍臨床應用尚需時日。依賴上皮細胞表面標志物進行分離富集CTCs的方法面臨的主要問題是可能出現假陰性和假陽性結果。研究表明，腫瘤細胞在脫落入血過程中，發(fā)生上皮-間質轉化（epi t he l ia l me s en c hyma l t ran s i t ion，E MT），腫瘤細胞表面標志物表達發(fā)生變化［22］，即上皮來源的標志物表達下降，而間質細胞標志物（如V imen t in、T wi s t等）表達上調，導致無法檢測到部分CTCs而產生假陰性結果；另外，血循環(huán)中上皮來源的細胞可能并非均為腫瘤細胞，已有報道［23］從結腸良性病變患者外周血中檢測到循環(huán)上皮細胞的存在。因此，以上皮細胞標記進行CTCs分離富集可能產生假陽性結果。與陽性分選法相反，陰性分選法先去除血細胞，最后達到富集CTCs的目的。陰性分選法不依賴CTCs表面標志物的表達，因此可用于多種腫瘤的CTCs富集，且富集的細胞活性較高，可作進一步培養(yǎng)鑒定。但陰性富集法同樣存在缺陷，即純度不高，容易出現假陽性結果等。

3 CTCs的檢測鑒定

根據CTCs特性進行分離富集的過程亦是對CTCs檢測的過程，但有時為進一步鑒定還需采用一些針對腫瘤細胞的技術方法對CTCs進行檢測。常用的檢測技術方法有免疫細胞化學法（immunocy to chemistry，I CC）、熒光原位雜交法（fluorescence in situhy bridiation，FISH）和RT-PCR法等。ICC技術借助針對腫瘤抗原的抗體反映細胞內抗原的表達，在細胞層面進行計數和鑒定。I CC鑒定CTCs的主要缺點是缺乏特異性的腫瘤標志物。FISH技術利用熒光標記的特異核酸探針與細胞內相應的靶DNA分子或RNA分子雜交，通過熒光顯微鏡下觀察熒光信號，計數與特異探針雜交后被染色的細胞。Li等［24］利用SET-iFISH技術對晚期胃癌患者CTCs進行檢測，結果陽性率為90.5%，靈敏性較高。RT-PCR法主要檢測來自CTCs的腫瘤基因表達，但CTCs經過E MT后，其基因表達會發(fā)生變化，因此該法的特異性受限；同時由于PCR技術本身的高敏性，亦可能出現假陽性結果［25］。此外，為研究CTCs的生物學功能（如成瘤性、侵襲性等），需對富集的CTCs進行體外培養(yǎng)或體內移植成瘤等實驗［26-27］，但由于CTCs數量極少，其中包含的成瘤性細胞（如腫瘤干細胞或腫瘤起始細胞）更少，因此功能性實驗仍面臨許多困難。

4 CTCs參與腫瘤復發(fā)轉移的機制

盡管研究已證實CTCs的存在與腫瘤分期、預后及治療反應等有關，但對CTCs分子生物學機制的研究仍處于初步探索階段。研究表明，并非所有的CTCs均具備轉移能力。侵入循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細胞大部分由于機體的免疫識別、機械殺傷或失巢凋亡可在短期內死亡，只有極少數存活，在適宜自身存活和增殖的器官或組織形成轉移灶。這些少數的CTCs如何獲得存活甚至在靶器官定植、增殖形成轉移灶的能力及其調控機制仍是目前的研究熱點［28］。

4.1 E MT與CTCs

研究發(fā)現CTCs在轉移過程中會產生不同的表型變化，以逃避機體的免疫殺傷或獲得抵抗失巢凋亡的能力，適應新的生存環(huán)境，其中最重要的表型變化是E MT［28］。E MT是上皮表型細胞轉變?yōu)榫哂虚g質細胞特性的過程，表現為各類上皮標志物（如E pC A M、C K等）表達減少和間質細胞來源蛋白質（如波形蛋白等）表達增加。利用這一特點，研究者發(fā)現許多腫瘤CTCs表現出E MT特性，如轉移性前列腺癌CTCs中E MT相關基因高表達［29］；胃癌CTCs不僅存在上皮、間質分型，且間質型CTCs還可能與治療預后相關［30］；轉移性非小細胞肺癌CTCs中波形蛋白高表達［31］；最近我國多家大型醫(yī)療中心聯(lián)合研究結果同樣發(fā)現結直腸癌中存在E MT現象，通過檢測CTCs上皮和間質表型相關基因對CTCs進行分型有助于判斷腫瘤分期及預后等［32］。這些研究結果均提示CTCs中存在E MT現象。通過E MT過程，腫瘤病灶細胞間的緊密連接和黏附可發(fā)生改變，而具有侵襲轉移潛能的CTCs常表現出E MT特性，這可能與E MT可促使單個細胞從緊密連接的細胞層分離并游走遷移至血管有關［33］。E MT對促進CTCs滲透到血管和維持CTCs在血管中生存也有一定作用［34］；E MT還可能促使CTCs獲得干細胞特征而更易于復發(fā)轉移及耐藥［35-36］?；贓 MT在CTCs中的重要作用，從E MT方向研究CTCs的分子生物學機制十分必要。國內學者基于Canpa t ro l TM技術平臺［30，32，37］，對結直腸癌患者術前術后的CTCs進行研究，通過檢測結直腸癌CTCs上皮標志物EpCAM、CK8、CK18、CK19及間質標志物V imen t in、T wi s t的表達，并利用這些標志物將CTCs分型（上皮型、間質型和混合型）。結果表明，隨著病理分期進展，CTCs總數及間質型CTCs比例均顯著升高（P＜0.05），而上皮型CTCs比例則顯著降低（P＜0.05），且間質型CTCs與遠處轉移顯著相關（P＜0.05）。上述研究結果提示，CTCs在惡性腫瘤進展過程中存在E MT現象，E MT可能是CTCs獲得存活及轉移能力的重要機制。

4.2 腫瘤干細胞與CTCs

腫瘤干細胞（cancerste mcells，CSCs）是一類具有自我增殖、分化、更新等特性的腫瘤細胞，已證實在多種腫瘤中存在［38］，并被認為是腫瘤的“種子”細胞。而CTCs作為存在于血液系統(tǒng)中高活力、高轉移潛能的細胞，可能具備C S C s特性。研究發(fā)現，在黑色素瘤［39］、轉移性乳腺癌［40］及肺癌［41］中存在高表達CD133的CTCs，且其與不良預后密切相關。頭頸部腫瘤［42］、轉移性乳腺癌［43］、胃癌［44］的CTCs則存在CD44+亞群；相較于原發(fā)乳腺癌，A LDH1high/TW IS T nu c的CTCs在轉移性乳腺癌中更常見［45］。但也有研究發(fā)現，在轉移性結直腸癌CTCs與CD44或CD133不存在相關性，而A LDH1、S ur v i v in、M R P5與CTCs顯著相關［46］。由于CTCs具有E MT的特性，間質型CTCs通常被認為更有形成轉移灶的能力。但T am等［47］則提出不同的看法，認為介于上皮型和間質型的CTCs表型才可能具有遠處轉移形成腫瘤的能力，即具備C S C s的特性。綜上所述，CTCs與C S C s雖然具有共同特征，但兩者并不完全等同，C S C s可能是CTCs的一種特殊類型，或者是具有干細胞特性的異質性CTCs，這使CTCs可長期存在于血液循環(huán)并保持高侵襲轉移性。

5 展望

CTCs的存在已得到證實，且與腫瘤復發(fā)轉移關系密切。CTCs的分離富集和檢測技術已取得巨大進步，但對CTCs生物行為及機制仍知之甚少。因此CTCs檢測應用于臨床診斷及治療的意義和價值還需進一步研究。當前CTCs的研究大多著眼于CTCs自身特性而忽略CTCs與原發(fā)灶、CTCs與腫瘤微環(huán)境及機體內環(huán)境的整體關系。腫瘤機體內環(huán)境的失衡對CTCs生物學行為的調控可能是大多數惡性腫瘤出現復發(fā)轉移的重要機制。CTCs能在血液循環(huán)中存活并最終增殖形成轉移灶，這離不開生長因子及相應信號通路的維持與調控，而針對這一領域的研究則有可能成為打開惡性腫瘤復發(fā)轉移機制之門的一把金鑰匙。

［1］ 陳萬青，鄭榮壽，張思維，等.2012年中國惡性腫瘤發(fā)病和死亡分析［J］.中國腫瘤，2016，25（1）：1-8.

［2］Ashworth TR.A case of cancer in which cells similar to those in the tumors were seen in the blood after death［J］.Aust Med J，1869，14：146.

［3］wata H，Masuda N，Yamamoto D，et al.Circulating tumor cells as a prognostic marker for efficacy in the randomized phase III JO21095 trial in Japanese patients with HER2-negative metastatic breast cancer［J］.Breast Cancer Res Treat，2017，162（3）：501-510.

［4］Kuske A，Gorges TM，Tennstedt P，et al.Improved detection of circulatingtumorcellsinnon-metastatichigh-riskprostatecancerpatients［J］.Sci Rep，2016，6：39736.

［5］Gao W，Yuan H，Jing F，et al.Analysis of circulating tumor cells from lung cancer patients with multiple biomarkers using high-performance size-based microfluidic chip［J］.Oncotarget，2017，8（8）：12917-12928.

［6］Zhang D，Zhao L，Zhou P，et al.Circulating tumor microemboli（CTM）and vimentin+circulating tumor cells（CTCs）detected by a size-based platform predict worse prognosis in advanced colorectal cancer patients during chemotherapy［J］.Cancer Cell Int，2017，17：6.［7］Tinhofer I，Hristozova T，Stromberger C，et al.Monitoring of circulating tumor cells and their expression of EGFR/phospho-EGFR during combined radiotherapy regimens in locally advanced squamous cell carcinoma of the head and neck［J］.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2012，83（5）：e685-690.

［8］Li Y，Zhang X，Gong J，et al.Aneuploidy of chromosome 8 in circulating tumor cells correlates with prognosis in patients with advanced gastric cancer［J］.Chin J Cancer Res，2016，28（6）：579-588.

［9］Watanabe T，Okumura T，Hirano K，et al.Circulating tumor cells expressing cancer stem cell marker CD44 as a diagnostic biomarker in patients with gastric cancer［J］.Oncol Lett，2017，13（1）：281-288.

［10］Shimazu K，Fukuda K，Yoshida T，et al.High circulating tumor cell concentrations in a specific subtype of gastric cancer with diffuse bone metastasis at diagnosis［J］.World J Gastroenterol，2016，22（26）：6083-6088.

［11］Poruk KE，Blackford AL，Weiss MJ，et al.Circulating tumor cells expressing markers of tumor-initiating cells predict poor survival and cancer recurrence in patients with pancreatic ductal adenocarcinoma［J］.Clin Cancer Res，2017，23（11）：2681-2690.

［12］Kelley RK，Magbanua MJ，Butler TM，et al.Circulating tumor cells in hepatocellular carcinoma：a pilot study of detection，enumeration，and next-generation sequencing in cases and controls［J］.BMC Cancer，2015，15：206.

［13］Rhim AD，Mirek ET，Aiello NM，et al.EMT and dissemination precede pancreatic tumor formation［J］.Cell，2012，148（1-2）：349-361.

［14］Lee SJ，Lee J，Kim ST，et al.Circulating tumor cells are predictive of poor response to chemotherapy in metastatic gastric cancer［J］.Int J Biol Markers，2015，30（4）：e382-386.

［15］Cristofanilli M，Budd GT，Ellis MJ，et al.Circulating tumor cells，disease progression，and survival in metastatic breast cancer［J］.N Engl J Med，2004，351（8）：781-791.

［16］Tsujiura M，Ichikawa D，Konishi H，et al.Liquid biopsy of gastric cancer patients：circulating tumor cells and cell-free nucleic acids［J］.World J Gastroenterol，2014，20（12）：3265-3286.

［17］Alix-Panabières C，Pierga JY.Circulating tumor cells：liquid biopsy［J］.Bull Cancer，2014，101（1）：17-23.

［18］Alix-Panabieres C，Pantel K.Challenges in circulating tumour cell research［J］.Nat Rev Cancer，2014，14（9）：623-631.

［19］Nagata T，Ohnaga T，Lu XL，et al.Identification of circulating tumor cell（CTC）in breast cancer patients using a newly established CTC detectingsystem［J］.Gan ToKagaku Ryoho，2015，42（10）：1240-1242.

［20］Zhang Y，Zhang X，Zhang J，et al.Microfluidic chip for isolation of viable circulating tumor cells of hepatocellular carcinoma for their culture and drug sensitivity assay［J］.Cancer Biol Ther，2016，17（11）：1177-1187.

［21］Park MH，Reategui E，Li W，et al.Enhanced isolation and release of circulating tumor cells using nanoparticle binding and ligand exchange in a microfluidic chip［J］.J Am Chem Soc，2017，139（7）：2741-2749.

［22］Mikolajczyk SD，Millar LS，Tsinberg P，et al.Detection of EpCAM-negative and cytokeratin-negative circulating tumor cells in peripheral blood［J］.J Oncol，2011，2011：252361.

［23］Pantel K，Deneve E，Nocca D，et al.Circulating epithelial cells in patients with benign colon diseases［J］.Clin Chem，2012，58（5）：936-940.

［24］Li Y，Zhang X，Ge S，et al.Clinical significance of phenotyping and karyotyping of circulating tumor cells in patients with advanced gastric cancer［J］.Oncotarget，2014，5（16）：6594-6602.

［25］Zippelius A，Kufer P，Honold G，et al.Limitations of reverse-transcriptase polymerase chain reaction analyses for detection of micrometastatic epithelial cancer cells in bone marrow［J］.J Clin Oncol，1997，15（7）：2701-2708.

［26］Ramirez JM，Fehm T，Orsini M，et al.Prognostic relevance of viable circulating tumor cells detected by EPISPOT in metastatic breast cancer patients［J］.Clin Chem，2014，60（1）：214-221.

［27］Baccelli I，Schneeweiss A，Riethdorf S，et al.Identification of a population of blood circulating tumor cells from breast cancer patients that initiates metastasis in a xenograft assay［J］.Nat Biotechnol，2013，31（6）：539-544.

［28］Plaks V，Koopman CD，Werb Z.Cancer.Circulating tumor cells［J］.Science，2013，341（6151）：1186-1188.

［29］Chen CL，Mahalingam D，Osmulski P，et al.Single-cell analysis of circulating tumor cells identifies cumulative expression patterns of EMT-related genes in metastatic prostate cancer［J］.Prostate，2013，73（8）：813-826.

［30］ Li TT，Liu H，Li FP，et al.Evaluation of epithelial-mesenchymal transitioned circulating tumor cells in patients with resectable gastric cancer：relevance to therapy response［J］.World J Gastroenterol，2015，21（47）：13259-13267.

［31］ Lecharpentier A，Vielh P，Perez-Moreno P，et al.Detection of circulating tumour cells with a hybrid（epithelial/mesenchymal）phenotype in patients with metastatic non-small cell lung cancer［J］.Br J Cancer，2011，105（9）：1338-1341.

［32］ Zhao R，Cai Z，Li S，et al.Expression and clinical relevance of epithelial and mesenchymal markers in circulating tumor cells from colorectal cancer［J］.Oncotarget，2017，8（6）：9293-9302.

［33］ Lim SH，Becker TM，Chua W，et al.Circulating tumour cells and the epithelial mesenchymal transition in colorectal cancer［J］.J Clin Pathol，2014，67（10）：848-853.

［34］ Liu H，Zhang X，Li J，et al.The biological and clinical importance of epithelial-mesenchymal transition in circulating tumor cells［J］.J Cancer Res Clin Oncol，2015，141（2）：189-201.

［35］ Mani SA，Guo W，Liao MJ，et al.The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells［J］.Cell，2008，133（4）：704-715.

［36］ Li H，Batth IS，Qu X，et al.IGF-IR signaling in epithelial to mesenchymal transition and targeting IGF-IR therapy：overview and new insights［J］.Mol Cancer，2017，16（1）：6.

［37］ Wu S，Liu S，Liu Z，et al.Classification of circulating tumor cells by epithelial-mesenchymal transition markers［J］.PLoS One，2015，10（4）：e0123976.

［38］ 陸云飛，黃名威.腫瘤干細胞的起源與腫瘤的防治策略［J］.腫瘤防治研究，2011，38（7）：838-839，843.

［39］ Fusi A，Reichelt U，Busse A，et al.Expression of the stem cell markers nestin and CD133 on circulating melanoma cells［J］.J Invest Dermatol，2011，131（2）：487-494.

［40］ Armstrong AJ，Marengo MS，Oltean S，et al.Circulating tumor cells from patients with advanced prostate and breast cancer display both epithelial and mesenchymal markers［J］.Mol Cancer Res，2011，9（8）：997-1007.

［41］ Skirecki T，Hoser G，Kawiak J，et al.Flow cytometric analysis of CD133-and EpCAM-positive cells in the peripheral blood of patients with lung cancer［J］.Arch Immunol Ther Exp（Warsz），2014，62（1）：67-75.

［42］ Balasubramanian P，Lang JC，Jatana KR，et al.Multiparameter analysis，including EMT markers，on negatively enriched blood samples from patients with squamous cell carcinoma of the head and neck［J］.PLoS One，2012，7（7）：e42048.

［43］ Theodoropoulos PA，Polioudaki H，Agelaki S，et al.Circulating tumor cells with a putative stem cell phenotype in peripheral blood of patients with breast cancer［J］.Cancer Lett，2010，288（1）：99-106.

［44］ Li M，Zhang B，Zhang Z，et al.Stem cell-like circulating tumor cells indicate poor prognosis in gastric cancer［J］.Biomed Res Int，2014，2014：981261.

［45］ Papadaki MA，Kallergi G，Zafeiriou Z，et al.Co-expression of putative stemness and epithelial-to-mesenchymal transition markers on single circulating tumour cells from patients with early and metastatic breast cancer［J］.BMC Cancer，2014，14：651.

［46］ Gazzaniga P，Gradilone A，Petracca A，et al.Molecular markers in circulating tumour cells from metastatic colorectal cancer patients［J］.J Cell Mol Med，2010，14（8）：2073-2077.

［47］ Tam WL，Weinberg RA.The epigenetics of epithelial-mesenchymal plasticity in cancer［J］.Nat Med，2013，19（11）：1438-1449.