秦登科，賈傳龍，盧勇舟，楊清建，陳亮，吳心愿，任潤(rùn)健，朱晶晶，郭妤，楊平，周軼群，畢波，朱寧文，劉天一

1.復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院整形外科，上海200040；2.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院皮膚科，上海200040

皮膚的衰老除了受內(nèi)源性因素影響外，也受外源性因素影響，包括吸煙、飲酒和光照等[1-2]。中波紫外線（ultravioletB,UVB）照射是導(dǎo)致皮膚光老化的重要原因，表現(xiàn)為皮膚皺紋增多、色素沉著及失去彈性等[3]。此外，UVB照射還會(huì)導(dǎo)致皮膚成纖維細(xì)胞（fibroblasts,FBs）正常周期改變，p53和p21等周期相關(guān)蛋白分泌增加，破壞細(xì)胞正常的復(fù)制分裂過(guò)程，使細(xì)胞停滯在S期，影響細(xì)胞正常的結(jié)構(gòu)和功能，加劇細(xì)胞老化和凋亡[4-5]。近期許多研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）通路的抑制劑雷帕霉素（rapamycin,RAPA），作為一種新型大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑，具有調(diào)節(jié)衰老的重要作用[6]。雖然已有關(guān)于RAPA對(duì)細(xì)胞增殖、周期和信號(hào)通路的相關(guān)報(bào)道，但RAPA在光老化周期阻滯方面的研究甚少。本研究旨在探索RAPA是否能夠改善UVB照射導(dǎo)致的小鼠FBs周期阻滯。

1 材料與方法

1.1 小鼠真皮FBs獲取 取1～3 d SPF級(jí)C57BL/6小鼠，乙醚處死后浸泡于75%酒精中約10min，用培養(yǎng)基（dulbecco'smodifiedeaglemedium,DMEM）洗去殘留酒精，放入培養(yǎng)皿內(nèi)，剪刀分離后背皮膚，剪下面積約為1cm×1cm的皮膚組織，立即置于2%中性蛋白酶內(nèi)，4℃冰箱過(guò)夜。第2天取出皮膚，鑷子分離表皮真皮，剪碎真皮后置于0.1%膠原酶中，37℃下消化1.5h，至皮膚的組織基本消失。1500r/min離心5min，收集沉淀，棄上清，細(xì)胞以 DMEM+10%胎牛血清（fetalbovineserum,FBS）重懸，反復(fù)吹打直至均勻，以2×105/cm2的細(xì)胞密度接種在培養(yǎng)皿內(nèi)，于37℃、5%CO2、100%飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，將近80%～90%融合傳代，比例約為1∶4。

1.2 藥物預(yù)處理及光老化模型建立 選用P1代細(xì)胞，用含有不同濃度RAPA的DMEM+10%FBS處理48h。CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活性，選取最適濃度。實(shí)驗(yàn)共分4組：Ctrl組(非RAPA處理，非UVB照射)、RAPA組 (RAPA處理，非 UVB照射)、UVB照射組 (非RAPA處理，UVB照射)、UVB+RAPA組 (RAPA處理，UVB照射)。利用UVB照射建立FBs的光老化模型(stress-induced premature senescence,SIPS)[4]，吸除培養(yǎng)液，加入少量磷酸鹽緩沖液 (phosphate bufferedsaline,PBS)覆蓋細(xì)胞，移走培養(yǎng)皿蓋，放置在UVB燈 (PhilipsTL20w/01RSlamp)正下方，首次照射劑量(使用Lutron UV light meter測(cè)量)為120mJ/cm2，距離細(xì)胞7.5cm，照射后吸除PBS，加入10mL DMEM+1%FBS繼續(xù)培養(yǎng)，照射間隔時(shí)間為12h，每次照射時(shí)間為120s，共4次，末次照射后改為DMEM+10%FBS 培養(yǎng)[4]。

1.3 -半乳糖苷酶染色 吸除6孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)基，用PBS洗滌2次后每孔加入0.25 mL的4%多聚甲醛固定液，室溫下固定15 min。吸除細(xì)胞固定液，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每孔加0.25 mL染色液 (按照試劑盒說(shuō)明書(shū)現(xiàn)用現(xiàn)配)，調(diào)整 PH為6.0[7]，37℃溫箱中孵育過(guò)夜。普通光學(xué)顯微鏡下觀察，胞質(zhì)呈藍(lán)色者為陽(yáng)性細(xì)胞，表示細(xì)胞處于衰老狀態(tài)。 -半乳糖苷酶染色陽(yáng)性率的計(jì)算方法為：200倍下每孔中隨機(jī)選取10個(gè)視野，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分率。

1.4 細(xì)胞周期檢測(cè) Ctrl組和UVB照射組末次照射48 h后，吸移培養(yǎng)液，收集細(xì)胞懸液，1 500 r/min離心5min，棄去上清液，PBS洗2次，預(yù)冷的70%乙醇吹打均勻后重懸，4℃下固定過(guò)夜后，PBS洗3次，0.5 mL PBS重懸。加入50g/mL碘化丙啶和1mg/mL的RNA酶，避光37℃孵育30min后流式細(xì)胞儀檢測(cè)。細(xì)胞周期的分布使用ModiFit LT v2.0軟件進(jìn)行分析。

1.5 周期相關(guān)蛋白檢測(cè) 正常細(xì)胞或SIPS細(xì)胞最后一次照射48h后，移去培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，加入細(xì)胞裂解液500L，提取總蛋白。應(yīng)用二喹啉甲酸法通過(guò)微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定蛋白濃度，變性后取40 g，經(jīng)10%聚丙烯酰胺電泳分離蛋白并將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上，孵育袋中加入稀釋的 p53、p21(艾博抗1∶500)和 -微管蛋白 -tublin(博士德1∶2000)，4℃孵育過(guò)夜。采用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗 (艾博抗1∶2000)室溫孵育2h。增強(qiáng)型的化學(xué)發(fā)光法顯影和定影，利用灰度分析法檢測(cè)蛋白條帶的相對(duì)蛋白含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組間的比較采用方差分析，＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RAPA對(duì)小鼠FBs活性的影響 為選擇最適宜的RAPA濃度處理細(xì)胞并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別使用含有不同濃度RAPA的DMEM+10%FBS處理小鼠FBs。發(fā)現(xiàn)48h處理時(shí)間內(nèi)，較低濃度的RAPA(0～5mol/L)并不影響細(xì)胞活性，而較高濃度的 RAPA(10mol/L)會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性（＜0.05），抑制細(xì)胞增殖。因此選擇5 mol/L的RAPA作為后續(xù)細(xì)胞處理藥物濃度。見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度RAPA對(duì)小鼠FBs活性的影響

2.2 RAPA降低光老化細(xì)胞的衰老染色陽(yáng)性率 UVB照射組衰老染色明顯，主要集中在核周，呈藍(lán)綠色。RAPA預(yù)處理后的UVB照射組中陽(yáng)性染色細(xì)胞顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05），正常細(xì)胞組和RAPA處理的正常細(xì)胞組鮮有染色。見(jiàn)圖2。

圖2 UVB照射后SA--Gal染色陽(yáng)性率

2.3 各組FBs周期 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期后發(fā)現(xiàn)UVB照射組S期的細(xì)胞比率是Ctrl組的2.2倍，說(shuō)明UVB照射后的細(xì)胞發(fā)生了明顯的S期阻滯。而UVB+RAPA組細(xì)胞處于S期的比率為26.3%，與UVB照射組相比下降了6.5%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05），可見(jiàn)RAPA預(yù)處理可以緩解UVB照射導(dǎo)致的S期阻滯，而RAPA預(yù)處理后對(duì)Ctrl組細(xì)胞的S期沒(méi)有影響。見(jiàn)圖3。2.4RAPA可以降低光老化FBs周期蛋白p53和p21的生成 p53和p21是細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，也是作為細(xì)胞衰老的常用指標(biāo)。Western Blot結(jié)果顯示與正常細(xì)胞組相比，UVB照射組p53和p21的表達(dá)量分別是Ctrl組的1.9倍和1.8倍，UVB+RAPA組p53和p21的表達(dá)量是Ctrl組的1.4倍和1.3倍，說(shuō)明RAPA預(yù)處理后減少了UVB照射組p53和p21的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05），而RAPA預(yù)處理組p53和p21的表達(dá)量與Ctrl組比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖4。

3 討論

UVB照射可以破壞皮膚的正常結(jié)構(gòu)和功能，并能引起皮膚提前衰老，造成皮膚的粗糙、干燥、皺紋增多以及色素沉著等[8]。真皮的FBs是皮膚的主體細(xì)胞，除了衍生真皮外，還可以形成細(xì)胞外基質(zhì)，對(duì)維持皮膚的結(jié)構(gòu)、功能以及傷口的修復(fù)和愈合起著至關(guān)重要的作用[9]。長(zhǎng)期暴露在UVB照射下，不僅會(huì)導(dǎo)致皮膚老化甚至?xí)T發(fā)皮膚癌[10]。UVB照射可以直接損傷細(xì)胞DNA，誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞毒性物質(zhì)（卟啉、膽紅素、黑色素、氧自由基和活性氧簇等），造成細(xì)胞周期阻滯，干擾細(xì)胞的增殖進(jìn)程，影響的正常細(xì)胞功能[11]。

圖3 流式檢測(cè)各組FBs周期

圖4 RAPA對(duì)UVB誘導(dǎo)的FBs周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

細(xì)胞內(nèi)DNA可以直接吸收UVB中的光量子，造成DNA突變和核苷酸結(jié)構(gòu)重排，導(dǎo)致缺陷DNA鏈的產(chǎn)生，影響DNA的正常復(fù)制過(guò)程，干擾細(xì)胞增殖的正常進(jìn)程[12]，細(xì)胞內(nèi)的這些改變可以引起包括細(xì)胞增殖、分化、老化、周期阻滯及DNA損傷修復(fù)在內(nèi)的多條信號(hào)通路激活[13]。而B(niǎo)hatia-Dey等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞可以通過(guò)周期阻滯來(lái)進(jìn)行DNA修復(fù)，是細(xì)胞對(duì)DNA損傷的一種反饋表現(xiàn)，通過(guò)阻滯細(xì)胞周期防止細(xì)胞DNA的進(jìn)一步損害。p53和p21等抑癌基因可以調(diào)控細(xì)胞周期，是激活衰老信號(hào)通路的中樞信號(hào)[15]。UVB導(dǎo)致的DNA損傷可以激活p53和p21基因，導(dǎo)致視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白的去磷酸化，抑制細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞周期蛋白依賴激酶的合成，使細(xì)胞進(jìn)入一個(gè)穩(wěn)定的周期阻滯期，加劇老化的進(jìn)程[12,14]。UVB照射可以導(dǎo)致線粒體內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧簇（reactiveoxygenspecies,ROS），影響細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA的合成，干擾細(xì)胞間正常的信號(hào)通路[16]。p53和p21表達(dá)增多可以激活絲裂原活化蛋白激酶和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-通路，進(jìn)一步加速 ROS生成。ROS一方面直接破壞DNA，另一方面可以通過(guò)激活核因子appaB和激活蛋白-1等信號(hào)通路促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）的分泌，MMPs可以降解細(xì)胞外基質(zhì)，破壞細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能[17]。在本實(shí)驗(yàn)中，UVB照射組發(fā)生了明顯的 S期阻滯，并且p53和p21蛋白的分泌顯著增加也符合細(xì)胞衰老的生物學(xué)特征，進(jìn)一步驗(yàn)證了 SIPS模型的合理性。

RAPA是一種大環(huán)內(nèi)酯類化合物，主要用來(lái)抑制器官移植后產(chǎn)生的免疫排斥反應(yīng)。近期研究發(fā)現(xiàn)RAPA在改善氧化應(yīng)激反應(yīng)和延緩衰老過(guò)程等方面發(fā)揮著重要作用[18]。RAPA可以通過(guò)結(jié)合 mTOR受體誘導(dǎo)自噬，吞噬細(xì)胞內(nèi)衰老的蛋白、功能受損的細(xì)胞器、代謝廢物及過(guò)氧化物酶體等來(lái)維持細(xì)胞的正常功能[18]。已經(jīng)有實(shí)驗(yàn)證明，RAPA可以明顯延長(zhǎng)哺乳動(dòng)物的生存期，調(diào)控正常的生理衰老進(jìn)程，機(jī)制可能與其誘導(dǎo)的自噬有關(guān)[19]。同時(shí)Finkel等[20]的研究證明，RAPA預(yù)處理后可以減少 ROS和總體炎癥因子產(chǎn)生，降低DNA破壞水平，從而減弱輻射對(duì)上皮干細(xì)胞造成的損傷。而Sonis等[21]發(fā)現(xiàn)，RAPA可以通過(guò)減少細(xì)胞內(nèi)ROS的生成來(lái)降低DNA破壞水平，抑制衰老相關(guān)蛋白p53和p21產(chǎn)生，維持細(xì)胞周期的正常進(jìn)行。

[1]Kohl E,SteinbauerJ,Landthaler M, .Skinageing[J].JEur Acad Dermatol Venereol,2011,25(8):873-884.

[2] 許陽(yáng)，駱丹．皮膚衰老的研究新進(jìn)展 [J]．老年醫(yī)學(xué)與保健，2016，22（6）：334-338．

[3] 陳亮，畢波，曾繼平，等．羅格列酮對(duì)UVB誘導(dǎo)的小鼠光老化皮膚成纖維細(xì)胞MMPs表達(dá)和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白合成的影響 [J]．中國(guó)美容整形外科雜志，2015，26（8）：500-503．

[4]ZengJP,BiB,ChenL, .Repeatedexposureofmousedermal fibroblasts at a sub-cytotoxic dose of UVB leads to premature senescence:arobust model of cellular photoaging[J].JDermatol Sci,2014,73(1):49-56.

[5] ChenL,BiB,ZengJ, .Rosiglitazoneamelioratessenescencelike phenotypes in a cellular photoaging model[J].J Dermatol Sci,2015,77(3):173-181.

[6] Demidenko ZN,Zubova SG,Bukreeva EI, .Rapamycin decelerates cellular senescence[J].Cell Cycle,2009,8(12):1888-1895.

[7] 陳亮，畢波，曾繼平，等．pH對(duì)衰老相關(guān) -半乳糖苷酶染色的影響[J]．中國(guó)美容整形外科雜志，2014，25（12）：751-754．

[8] Wang XF,Huang YF,Wang L, .Photo-protective activity of pogostone against UV-induced skin premature aging in mice[J].Exp Gerontol,2016,77:76-86.

[9] 盧勇舟，陳亮，畢波，等．膠原蛋白碎片對(duì)光老化真皮細(xì)胞外基質(zhì)的影響 [J]．中國(guó)美容整形外科雜志，2015，26（4）：213-215．

[10] Tobin DJ.Introduction to skin aging[J].J Tissue Viability,2017,26(1):37-46.

[11]Schuch AP,Moreno NC,Schuch NJ, .Sunlight damage to cellular DNA:Focus on oxidatively generated lesions[J].Free Radic Biol Med,2017,107(17):110-124.

[12]GreussingR,Hackl M,Charoentong P, .Identificationof microRNA-mRNA functional interactions in UVB-induced senescenceof humandiploidfibroblasts[J].BMCGenomics,2013,14:224.

[13]Bosch R,Philips N,Suárez-Pérez JA, .Mechanisms of photoaging and cutaneous photocarcinogenesis,and photoprotectivestrategieswithphytochemicals[J].Antioxidants(Basel),2015,4(2):248-268.

[14]Bhatia-DeyN,KanherkarRR,StairSE, .Cellular senescence as the causal nexus of aging[J].Front Genet,2016,7:13.

[15]陳亮，畢波，曾繼平，等．羅格列酮調(diào)控光老化成纖維細(xì)胞周期阻滯的研究[J]．中國(guó)美容整形外科雜志，2015，26（7）：436-440．

[16]Karthikeyan R,Kanimozhi G,Prasad NR, .7-Hydroxycoumarin prevents UVB-induced activation of NF-B and subsequent overexpression of matrix metalloproteinases and inflammatorymarkersinhumandermal fibroblast cells[J].JPhotochem Photobiol B,2016,161:170-176.

[17]Lu J,Guo JH,Tu XL, .Tiron inhibits UVB-Induced AP-1 binding sites transcriptional activation on MMP-1 and MMP-3 promoters by MAPK signaling pathway in human dermal fibroblasts[J].PLoS One,2016,11(8):e0159998.

[18]Rubinsztein DC,Marino G,Kroemer G.Autophagy and aging[J].Cell,2011,146(5):682-695.

[19]Laplante M,Sabatini DM.mTOR signaling in growth control and disease[J].Cell,2012,149(2):274-293.

[20] Finkel T.Relief with rapamycin:mTOR inhibition protects against radiation-induced mucositis[J].Cell Stem Cell,2012,11(3):287-288.

[21] Sonis ST.Oral mucositis[J].Anticancer Drugs,2011,22(7):607-612.